精子線粒體DNA ATP6、ATP8 和COX3突變與弱精癥的關系

陳孟權 單婷婷 林春春 孔萬仲

男性不育癥是指夫婦雙方未采取避孕措施同居生活1 年以上，男方因素導致女方不孕的疾病。據報道，約50%的不育夫婦是由男性因素導致的，約一半的男性不育患者表現(xiàn)為少精癥和弱精癥[1]，其中弱精癥是指精子前向運動百分率＜32%或精子總活力＜40%。30%～40%的男性均存在一定程度的精子數量或質量異常[1]，約40%的特發(fā)性男性不育癥表現(xiàn)出遺傳易感性[2]，精子線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作為細胞核外的獨立遺傳物質，在男性不育中可能發(fā)揮重要作用[3]。線粒體主要在氧化磷酸化等過程中發(fā)揮作用，是精子結構、運動能力、鞭毛功能和正常受精等環(huán)節(jié)的能量保障[4-7]。mtDNA 含有呼吸鏈復合體部分亞基的多肽基因[8]，但由于缺乏組蛋白保護，易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的損傷，同時其DNA 修復系統(tǒng)作用有限，導致其突變率較核基因高出10～100 倍[9]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 的高頻突變與弱精癥相關[10-11]。據報道，在弱精癥患者中存在多種類型的mtDNA 大片段缺失，如4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp 等[12-13]，這些缺失區(qū)域均包含ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等片段，其中ATP6 和ATP6/8 重疊區(qū)域的T8993G、T9185C 及C8561G突變可能導致復合體Ⅴ的組裝不良和穩(wěn)定性受損[14-15]，COX3 對復合體Ⅳ活性具有調節(jié)作用，G9396A突變引起的氨基酸改變可能導致線粒體腦病或肌病[16]。本研究對精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因進行測序，分析并探討這些區(qū)域的基因突變與弱精癥之間的關系，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019 年7 月至2021 年3 月在溫州市中醫(yī)院就診且行精液檢查的134 例弱精癥患者為弱精癥組，均符合第5 版《WHO 人類精液檢驗與處理實驗室手冊》中弱精癥的相關診斷標準（精液常規(guī)檢查顯示精子前向運動率＜32%或精子總活力＜40%），且有1 年以上不育史，其配偶的婦產科相關檢查均正常。選取同期至本院其他原因就診的129 例精液常規(guī)檢查結果正常的患者為對照組。弱精癥組年齡32（29，35）歲，對照組年齡32（29，36）歲，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。納入標準：（1）留樣時禁欲2～7 d；（2）既往體??；（3）無重要臟器損傷及自身免疫性疾??；（4）無睪丸損傷、附睪炎、泌尿系統(tǒng)感染等病史；（5）無相關性腺器官發(fā)育異常史；（6）常規(guī)精液檢查和精子動力形態(tài)分析等結果齊全。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會審查通過（批準文號：WZY2021-KT-045），所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)檢查 所有患者按要求留取精液，使用專用容器收集單次射精的全部精液，0.5 h 內保溫送檢。全部精液樣本均置于37 ℃恒溫孵箱，待液化后使用精子質量檢測分析系統(tǒng)（型號：CFT-9201，江蘇瑞祺生命科學儀器有限公司）進行精液常規(guī)檢查，分析精子總活力、精子濃度等指標。

1.2.2 精子基因組測序分析 采用PCR 法。使用基因組DNA 提取試劑盒（批號：03427，北京天根生化科技有限公司）提取精子基因組DNA，經質量檢測合格后存于-20 ℃冰箱內備用。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成COX3、ATP6、ATP8 基因引物[17]，引物信息見表1。配置20 μL 反應體系：DNA 模板2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL，Primer F/R（10 μmol/L）0.4 μL，Taq酶0.1 μL，ddH2O 11.9 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）確認PCR 產物后送尚亞生物技術有限公司進行測序，為保證測序結果的準確性，全部樣本均采用雙向重復測序。將測序結果與劍橋標準序列進行比對，查找和分析突變位點。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者精液常規(guī)檢查結果比較 弱精癥組精子總活力和精子濃度均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者精液常規(guī)檢查結果比較

2.2 兩組患者精子基因組測序結果比較 兩組患者精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因測序結果顯示，弱精癥組、對照組精子中分別發(fā)現(xiàn)86、87 個突變位點，突變類型均以同義突變、錯義突變?yōu)橹鳎粌山M患者突變類型、突變區(qū)域比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

2.3 兩組患者精子mtDNA 基因突變分析 突變發(fā)生率＞5%的突變位點共有15 個，其中ATP6、ATP8、COX3 區(qū)域分別有8、1、6 個，錯義突變、同義突變、移碼突變分別有8、6、1 個。本次分析發(fā)現(xiàn)3 個未被報道過的突變類型：A8962C、AT9934A、A8812T；其中A8962C、AT9934A 在弱精癥組中的發(fā)生率均明顯高于對照組（均P＜0.05），而A8812T 在對照組中的發(fā)生率明顯高于弱精癥組（P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者精子mtDNA 基因突變分析

3 討論

弱精癥是多數男性不育癥的主要表現(xiàn)，即精子運動能力減弱，進而影響精子細胞功能，最終導致受精失敗。作為細胞能量來源的線粒體，主要通過氧化磷酸化產生ATP[18]，是細胞生命活動的保障，與精子活力息息相關。線粒體功能出現(xiàn)任何異常，都可能導致細胞呼吸障礙，ATP 生成不足，對精子的產生和發(fā)育造成影響。研究表明，睪丸組織中mtDNA 突變并大量累積可能導致生精細胞呼吸受損、減數分裂停滯以及精子細胞缺氧而發(fā)生凋亡等[19]，同時高水平ROS 和自由基對線粒體和mtDNA 均可造成嚴重損傷，進一步影響精子活力，最終導致男性不育[20]。

據目前已有文獻報道，與弱精癥相關的mtDNA 大片段缺失有4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp等[12-13]，缺失涉及的區(qū)域涵蓋ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等，甚至累及ND5、ND6、CYTB 以及多個tRNA 基因。這些編碼基因作為線粒體呼吸鏈的重要組成部分，其缺失或突變都會影響精子細胞的正常功能。有學者發(fā)現(xiàn)COX3 基因的G9267A 突變可損傷氧化磷酸化并促進ROS 產生[21]，ATP6 基因的A8701G 和G9053A 突變會增加受精失敗風險[22-23]；此外，在不同腫瘤細胞中能檢測到復合體Ⅴ亞基表達下調[24]，多數神經退行性疾病和低生育力與ATP6 基因的A8860G突變有關[17，25-26]。本研究對精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 突變與弱精癥的關系作進一步探討，通過對這些區(qū)域進行測序發(fā)現(xiàn)，弱精癥組與對照組在突變類型、突變區(qū)域等方面比較差異均無統(tǒng)計學意義，且突變類型均以同義突變、錯義突變?yōu)橹?。本研究進一步作序列比對發(fā)現(xiàn)，突變發(fā)生率＞5%的突變位點有15個，其中3 個是未被報道過的突變類型（A8962C、AT9934A、A8812T），位于ATP6、COX3 的A8962C 和AT9934A 在弱精癥組中的發(fā)生率均明顯高于對照組，而A8812T 在對照組中的發(fā)生率明顯高于弱精癥組。A8962C 是將該位點編碼的蘇氨酸變成脯氨酸的錯義突變，該突變可能導致呼吸鏈復合體Ⅴ合成的數量或空間結構發(fā)生異常，造成能量供應不足和ROS 失調[27]。COX3 作為人類高保守基因，在復合體Ⅳ活性調節(jié)中發(fā)揮作用，同時復合體Ⅳ參與形成的超復合物結構又可以減少ROS 的產生[28-29]，而AT9934A 是該位點缺失一個核苷酸導致的移碼突變，由此引起的氨基酸順序錯亂，可能造成復合體Ⅳ的活性或穩(wěn)定性受損。值得關注的是，ATP6 的A8812T 突變使得該位點編碼的蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸，其在對照組中的發(fā)生率為44.19%，但在弱精癥組中卻未檢測到，因此我們推測該突變可能對精子活力起保護作用。

綜上所述，精子mtDNA ATP6、ATP8 和COX3 突變與弱精癥存在一定的關系，其中A8962C、AT9934A 突變與弱精癥的發(fā)生有關，而A8812T 突變可能對精子活力起保護作用。