高曉雪，王剛，宮建輝，夏新月，董彥博

北京姿美堂生物技術(shù)股份有限公司（北京 100144）

硫酸軟骨素（chondroitiulfate，CS）作為一種具有天然活性的酸性黏多糖類物質(zhì)，其廣泛存在于動(dòng)物的軟骨和結(jié)締組織中[1]。在臨床應(yīng)用當(dāng)中其具有調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗衰老、治療關(guān)節(jié)炎、防治冠心病等多種療效，并且不良反應(yīng)少[2-5]。此外，硫酸軟骨素被廣泛應(yīng)用于食品及化妝品中，還具有改善口感、潤(rùn)滑度、吸濕性等作用[2-7]。因此，測(cè)定CS含量的分析方法對(duì)于保健食品和藥品原料及成品銷售的品質(zhì)控制非常重要。

硫酸軟骨素是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的多糖。測(cè)定CS含量的常用方法有分光光度法、高效液相法和電化學(xué)分析法等[1-6]。分光光度法主要是通過(guò)利用分光光度儀測(cè)定二糖在特定條件下與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)或沉淀。但由于糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)相似度高，且軟骨中富含多種黏多糖，干擾因素多，那么重現(xiàn)性差，而且該方法需要使用毒性較強(qiáng)的試劑，存在潛在危害[2,4]。電化學(xué)分析法對(duì)操作人員試驗(yàn)素質(zhì)要求高，且試驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，專屬性比較強(qiáng)[6]。高效液相法主要是將多糖分解后進(jìn)入色譜柱利用各組分間極性差異的性質(zhì)進(jìn)行分離后檢測(cè)，該方法測(cè)定對(duì)象單一，無(wú)雜質(zhì)干擾，靈敏度高，適用性廣。已有的GB/T 20365—2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定 液相色譜法》是通過(guò)用液相色譜測(cè)定硫酸軟骨素的方法[2-3,7-9]。

試驗(yàn)測(cè)試品選擇氨糖軟骨素奶粉，含有大量CS，除此之外還含有其他食品成分，對(duì)測(cè)定會(huì)有較大干擾。因此，有必要建立可快速準(zhǔn)確測(cè)定氨糖軟骨素奶粉中硫酸軟骨素含量的方法。試驗(yàn)以氨糖軟骨素奶粉為測(cè)試品，利用高效液相色譜儀，通過(guò)優(yōu)化提取方法、流動(dòng)相流速等色譜條件建立同時(shí)測(cè)定氨糖軟骨素奶粉中CS含量的方法，并完成方法學(xué)驗(yàn)證，以期更好地用于氨糖軟骨素奶粉的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀[島津儀器（蘇州）有限公司]；電子天平（d=0.01 mg，株式會(huì)社島津制作所日本京都）；電子天平[d=0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 材料與試劑

硫酸軟骨素鈉（批號(hào)140792-202003，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；D-鹽酸氨基葡萄糖（批號(hào)140649-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；無(wú)水乙醇（批號(hào)20201109，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；戊烷磺酸鈉（批號(hào)20180761，MREDA）；乙腈（批號(hào)021902，MREDA）；氯化鈉（批號(hào)20190818，北京市紅星化工廠）；中性氧化酶（批號(hào)515E011，Solarbio）；磷酸二氫鉀（批號(hào)20180117，北京化工廠）；氫氧化鈉（批號(hào)20170104，北京化工廠）；氨糖軟骨素奶粉（批號(hào)20220101，北京姿美堂生物技術(shù)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Nncleodur C18（用極性小分子封尾，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為戊烷磺酸鈉溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)192 nm時(shí)，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.1 流動(dòng)相優(yōu)化

中午回媽家，一進(jìn)門(mén)我先伸出腳來(lái)嚷嚷：“媽，快看看我的高跟鞋，漂亮不？”老媽瞄了一眼撇撇嘴，笑罵道：“熊孩子，又買高跟鞋?！睕](méi)等我坐下，老爸拿出一個(gè)紅包：“快過(guò)生日了吧？爸給錢(qián)，去買雙更好看的高跟鞋，我知道閨女就這一點(diǎn)嗜好。我和你媽的退休金花不完用不了，留著干啥?！?/p>

2.2.1 供試品溶液

為改善峰形、提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、保證成品質(zhì)量，對(duì)GB/T 20365—2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定 液相色譜法》規(guī)定的方法中的試樣流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，表1中序號(hào)1的流動(dòng)相比例為國(guó)標(biāo)規(guī)定的色譜相方法。由表1和圖1可知，根據(jù)不同流動(dòng)相色譜條件下硫酸軟骨素峰形及分離度，確定流動(dòng)相為乙腈+戊烷磺酸鈉2+98（V/V），其他色譜條件不變。在此條件下，色譜峰形、分離度會(huì)比較好。

圖1 不同色譜條件下的色譜圖

表1 不同流動(dòng)相條件考察結(jié)果

2.2 溶液的制備

遲恒去小店買了包三十幾塊一包的“紅塔山”，拆開(kāi)點(diǎn)燃抽了口，純，真煙，這種價(jià)的煙，在市里不熟的店子買，冷不丁就給你來(lái)包贗品。到尾砂庫(kù)東頭下游壩底后，遲恒結(jié)帳讓司機(jī)回了。河床似的、延伸很遠(yuǎn)的平地，上面只種菜，沒(méi)有建房，潰壩的話，砂流會(huì)順著河床沖跑，但河床兩旁都是房屋，地勢(shì)比河床高不了多少，如果大潰壩，從一百多米高處傾瀉而下的砂槳流勢(shì)能極大，一旦成扇型展開(kāi)，這些民房極有可能會(huì)被砂流沖埋。外省一個(gè)地方尾砂礦潰壩，一次淹死下游267個(gè)人。河灘左側(cè)有條很長(zhǎng)的渠，不像新修的，流出的水清澈，砂庫(kù)的積水、滲水一部分從這里導(dǎo)出。菜地長(zhǎng)出的菜綠綠的挺好看。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液

在文學(xué)作品中，環(huán)境描寫(xiě)能夠襯托人物的心理、推動(dòng)故事的發(fā)展。因此，在高中語(yǔ)文閱讀的教學(xué)中，教師要引導(dǎo)學(xué)生重視環(huán)境描寫(xiě)，通過(guò)環(huán)境的描寫(xiě)來(lái)分析人物。當(dāng)然，不能僅僅以自然環(huán)境為主要依托，環(huán)境描寫(xiě)分為自然環(huán)境和社會(huì)環(huán)境，自然環(huán)境指自然界的景物，社會(huì)環(huán)境指體現(xiàn)社會(huì)當(dāng)時(shí)的特點(diǎn)的建筑物、物品或者風(fēng)俗習(xí)慣等。以我們初中學(xué)過(guò)的《故鄉(xiāng)》為例，“時(shí)候既然是深冬；漸近故鄉(xiāng)時(shí)，天氣又陰晦了，冷風(fēng)吹進(jìn)船艙中，嗚嗚的響，從篷隙向外一望，蒼黃的天底下，遠(yuǎn)近橫著幾個(gè)蕭索的荒村，沒(méi)有一些活氣。我的心禁不住悲涼起來(lái)了”，這段運(yùn)用了環(huán)境描寫(xiě)，并且是自然環(huán)境。通過(guò)描寫(xiě)，渲染了故鄉(xiāng)凄涼的景象，并且通過(guò)環(huán)境描寫(xiě)也襯托了“我”悲涼的心情。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

稱取25.48 mg硫酸軟骨素鈉對(duì)照品于25 mL容量瓶中，加適量水超聲溶解，加水定刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。量取5 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，為對(duì)照品使用液。

where mais the mass which is equivalent to that of the actuator;Bais the damp coefficient which is equivalent to that of the actuator;Flis the load force acting on the actuator.

拯救還是懲罰？在寫(xiě)作中，卡夫卡又一次不可自拔地陷入了困境。卡夫卡從來(lái)不曾想到自己的文學(xué)可以給世界帶來(lái)什么，他甚至無(wú)法承認(rèn)自己的文學(xué)?？ǚ蚩床磺遄约?，看不清自己的世界，找不到真正可以寄托的東西。他在“弱者”和“兒子”的影響下不可自拔，找不到自己的位置和標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間。而這種拯救耗盡卡夫卡一生，卻無(wú)法給他指示明路。

取樣品，按2.2.1的方法制備供試品溶液，室溫放置0，2，4，6，8，10和12 h，按照2.1色譜條件測(cè)定，記錄硫酸軟骨素含量，SRSD為0.8%，表明該法重復(fù)性良好，表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 線性關(guān)系考察

稱取25.48 mg硫酸軟骨素對(duì)照品，按照2.2.2的方法制備對(duì)照品儲(chǔ)備液，依次量取1，2，3，4和5 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照該試驗(yàn)優(yōu)化好的流動(dòng)相色譜條件方法下測(cè)定，用峰面積（Y）對(duì)濃度（X）繪制硫酸軟骨素的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。如表2和圖2所示。

康川司法所向社區(qū)服刑人員發(fā)放手機(jī)，實(shí)行手機(jī)定位。在矯正工作開(kāi)始時(shí)，服刑人員繳納500元押金后便可免費(fèi)使用該手機(jī)。矯正工作結(jié)束時(shí)，服刑人員上交手機(jī)便可退還押金。

圖2 硫酸軟骨素線性范圍考察結(jié)果

表2 硫酸軟骨素的回歸方程及線性范圍

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精確稱取樣品，按2.2.2的方法制備供試品，按2.1.1的優(yōu)化后得色譜條件平行測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果硫酸軟骨素含量。表3測(cè)定結(jié)果表明，硫酸軟骨素的平均值（n=6）分別為2.03 g/100 g，SRSD為0.81%，表明該法精密度良好。

表3 精密度測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按供試品的處方工藝和配方比例制得缺硫酸軟骨素的陰性樣品。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品6份，分別按2.2.1的方法制備供試品溶液，按照2.1的色譜條件測(cè)定，硫酸軟骨素含量1.98 g/100 g，SRSD分別為3.7%。

2.4.4 回收率試驗(yàn)

將5 mg樣品溶解在10 mL水中，通過(guò)水超聲提取20 min；提取液使用微孔濾膜按10 000 r/min離心，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

平行分別稱取6份的樣品，各加入硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.4%）約12.8 mg，加入25 mL水，超聲20 min，按10 000 r/min離心10 min，取1 mL上微孔濾膜（3 000道爾頓），按10 000 r/min離心30 min，下清液棄去；在微孔濾膜上加入2.0 mL水，按10 000 r/min離心30 min，精確加入2.0 mL水，超聲5 min，取出過(guò)0.45 μm濾膜。按照2.1.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算硫酸軟骨素的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

當(dāng)前大部分民眾對(duì)金融知識(shí)不熟悉，而且缺乏法律意識(shí)，容易成為涉眾型經(jīng)濟(jì)犯罪的受害者。為了有效的預(yù)防金融問(wèn)題，我國(guó)已經(jīng)制定并頒布了《商業(yè)銀行法》等相關(guān)的金融法律。其中明確的規(guī)定沒(méi)有經(jīng)過(guò)中國(guó)人民銀行批準(zhǔn)的，擅自設(shè)置非法吸收存款或者設(shè)置商業(yè)銀行等行為都要追究相應(yīng)的法律責(zé)任，并對(duì)相關(guān)的行為制定罪名。但是部分民眾由于法律意識(shí)不足，對(duì)非法集資的行為認(rèn)識(shí)不清，將非法投資誤認(rèn)為是正常的投資行為，進(jìn)而成為非法集資的犧牲品。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.4.5 檢出限和定量限

取2.3的最低濃度的混合對(duì)照品溶液，用水逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，分別按2.1.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄信號(hào)強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度的比值，將信號(hào)強(qiáng)度和噪音強(qiáng)度之比約為3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限，硫酸軟骨素的檢出限為1.50 μg/mL，定量限為16.23 μg/mL。結(jié)果表明，試驗(yàn)方法測(cè)得的方法檢出限和方法定量限均小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限和定量限，試驗(yàn)方法測(cè)定硫酸軟骨素的靈敏度較高，能夠滿足含量測(cè)定的需要。

2.4.6 樣品含量測(cè)定

《雷雨》是曹禺先生在“沒(méi)有太陽(yáng)的日子里的產(chǎn)物”，無(wú)論是哪一個(gè)女性形象，都是以悲劇結(jié)局收尾。這場(chǎng)命中注定的雷雨，這場(chǎng)無(wú)法回避的悲劇，將人世間一切的丑惡揭露開(kāi)來(lái)，無(wú)論什么人都無(wú)法逃脫命運(yùn)的囹圄。好一場(chǎng)雷雨，于黑暗中訴說(shuō)了一個(gè)家庭的悲劇，展示了人性的扭曲，揭露了殘酷的現(xiàn)實(shí)！它是一場(chǎng)暴風(fēng)雨，是一場(chǎng)文字的雷雨，字字血淚，擲地有聲！四鳳死了，繁漪瘋了，侍萍生不如死。一場(chǎng)雷雨，花謝知多少？花非花，似花，非花無(wú)花，夢(mèng)中淚花，一場(chǎng)雷雨，夢(mèng)碎一場(chǎng)空；夢(mèng)非夢(mèng)，似夢(mèng)非夢(mèng)，無(wú)夢(mèng)，夢(mèng)碎一場(chǎng)空！三十年，走完一場(chǎng)悲哀。

取4批次樣品，分別按2.2.1的方法制備供試品溶液，每批平行3份，按2.1.1的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算硫酸軟骨素含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 供試品含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 供試品處理方法的優(yōu)化

試驗(yàn)根據(jù)硫酸軟骨素的理化性質(zhì)，分別考察不同提取溶劑（水、不同比例乙腈-水）、提取方法（超聲、酶解）。結(jié)果表明：水作為提取溶劑時(shí)，硫酸軟骨素的峰形較好；超聲成分含量影響無(wú)顯著性差異，并且超聲提取法提取效率高，時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，被廣泛用于供試品溶液的制備。最終確定：采用水超聲提取20 min；提取液使用微孔濾膜（3 000道爾頓）10 000 r/min離心作為提取條件。

3.2 色譜條件的選擇

由于硫酸軟骨素的檢測(cè)波長(zhǎng)為192 nm，而甲醇在低波長(zhǎng)處有較高的紫外吸收值，因此采用乙腈作為有機(jī)相。試驗(yàn)考察不同比例的乙腈-戊烷磺酸鈉溶液作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-戊烷磺酸鈉2+98（V/V）作為流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫時(shí)分離效果最佳，且可改善峰形。

3.3 對(duì)建立方法的總體評(píng)價(jià)

試驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫-波長(zhǎng)切換法對(duì)氨糖軟骨素奶粉中的硫酸軟骨素進(jìn)行含量測(cè)定，相比現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，影響因素少，且能真實(shí)反映硫酸軟骨素含量，對(duì)氨糖軟骨素奶粉的質(zhì)量控制有一定參考價(jià)值。