PRRS 和PCV2 共感染對豬場的影響及免疫策略

汪志恒 ，向金梅 ，陳文欽 ，楊茂春 ，于福來 ，賴慶光 ，張苗苗 ，萬春云 1，＊

（1.長江大學，湖北 荊州 434000；2.浙江美保龍生物技術(shù)有限公司，浙江 金華 321000；3.羅牛山畜牧股份有限公司，海南 ?？?70000；4.湖北生物科技職業(yè)學院，湖北 武漢 430000）

豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）和豬藍耳病（PRRS）已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在我國流行趨勢更加復(fù)雜，即使在養(yǎng)豬很少的區(qū)域，也容易看到這兩個疾病的存在或共感染的情況，香港地區(qū)生豬保有量很低，有學者統(tǒng)計了香港特別行政區(qū)（HKSAR）PRRSV 和PCV2 的流行病學數(shù)據(jù)，從2020年2月3日至2021年3月11日，對香港特別行政區(qū)40 個豬場中的29 個進行了一項調(diào)查，用實時PCR 檢測了來自7 個年齡組（代表關(guān)鍵生產(chǎn)階段）的豬只。根據(jù)所有農(nóng)場所有豬只的匯總結(jié)果，48%、86%和79%的農(nóng)場證實存在PRRSV 歐洲株（PRRSV1）、PRRSV 北美株（PRRS2） 和PCV2。PRRSV1 和PRRSV2 在年輕豬只中更為流行，8 周齡豬只的患病率最高，分別為32.1%和51.5%。相比之下，PCV2流行率在各年齡組之間的分布似乎更為對稱，12 周齡至24 周齡的豬只報告了較高的流行率，但較年輕的豬只和母豬的流行率較低。這項研究的結(jié)果表明，PRRSV1、PRRSV2 和PCV2 在香港特別行政區(qū)的養(yǎng)豬場廣泛傳播。

養(yǎng)殖密集的地方形勢更加不容樂觀，我國早在2003年就有PRRS和PCV2 混合感染的明確報道，隨后多年一直有混合感染的病例報道，并且提高了豬病控制上的難度。有研究對從中國八個省市采集的病死豬樣本進行了評估，結(jié)果表明PRRSV、豬瘟病毒、PCV2 和PCV3的共感染率達到15.72%，另一項關(guān)于增殖性和壞死性肺炎（PNP）病變的研究表明，PRRSV 和PCV2 的共感染更常見于斷奶仔豬，共感染率為42%。此外，51.9%的PMWS病例中檢測到PRRSV。在發(fā)生病變的豬舍中觀察到涉及PRRSV 和PCV2 的高并發(fā)感染率，甚至可以假設(shè)PRRSV 和PCV2 的共同感染是PCVAD（圓環(huán)病毒相關(guān)?。┑闹饕蛑?。

總之，目前在我國PRRS 和PCV2 共感染已經(jīng)是一個明確并且沒法回避的問題，兩個病毒共感染會使病情更復(fù)雜，控制也更難，但是究竟共感染之后有哪些復(fù)雜性和影響，如何免疫對這種共感染情況更有效等問題，依然尚未明確。筆者總結(jié)了近年來能查到的文獻，試圖對此做出一些回答。

但是，總體來看目前關(guān)于兩者共感染的研究并不太深入，而且不同的研究結(jié)果似乎存在一些差異，這可能與PRRS 是單宿主病原體限制了其研究方法和其自身極高的突變率有比較大的關(guān)系。目前已經(jīng)有人統(tǒng)計了共感染試驗研究中，不同的PRRSV 毒株或感染序列、動物模型和易感細胞等都影響觀察結(jié)果（表1）。

表1 PRRS 和PCV2 的共感染

1 PRRS和PCV共感染帶來的影響

從目前已知的情況來看，共感染很容易發(fā)生，有人對加拿大患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的7 個農(nóng)場進行了分析，以評估PCV2 和PRRSV 感染的流行率以及PCV2 和PRRSV共感染的影響因素。試驗結(jié)果顯示，母豬PCV2 陽性感染與仔豬PCV2 感染之間存在極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。在PCV2 抗體滴度較低的母豬所產(chǎn)的仔豬中，PCV2 和PRRSV 共感染的風險是中高滴度母豬的1.85 倍（P=0.03），而且在豬群密度較高時，共感染風險大大增加。此外，PRRSV 和PCV2 都針能對宿主的免疫細胞，破壞其免疫功能，導(dǎo)致對主要和次要病原體的易感性增加，這可能影響宿主的生長性能以及相關(guān)疾病的發(fā)病率和致死率，可以推測共感染會比單獨感染給豬場帶來更大的影響，但是實際的共感染影響直到2000年后才被關(guān)注。

2006年，美國啟動了一個診斷項目，用以確定受PCVAD 影響的農(nóng)場中的共同感染因素有哪些，他們首先建立了PCV2 DNA 實時聚合酶鏈反應(yīng)定量（qPCR）的方法，并以此對美國共23 個養(yǎng)豬場的血清進行了PCV2 病毒載量檢測，分析了這些豬場PRRSV 疫苗的接種情況及其可能對該PCV2 載量的可能影響。統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示，與未接種PRRS 疫苗的動物相比，接種PRRS 疫苗導(dǎo)致13 周或以上的動物PCV2 病毒載量顯著降低，但接種豬PRRS 疫苗對4 ～12 周齡豬PCV2 的qPCR 結(jié)果沒有影響。說明在適當控制PRRS 的群體，比沒有疫苗控制PRRS 的群體，PCV2載量更低，群體更穩(wěn)定。

PCV2 與PRRSV 感染途徑也被研究，這兩種病毒都通過鼻腔進入，鼻咽相關(guān)淋巴組織（NALT）充當黏膜免疫系統(tǒng)和第一道屏障。有研究對PCV2 和PRRSV 共感染的豬只的NALT 進行組織學檢查。對6頭豬只進行尸檢，并采集其NALT、扁桃體和腸系膜淋巴結(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共感染導(dǎo)致NALT 中巨噬細胞、淋巴細胞耗竭減少、多核巨細胞、胞漿內(nèi)包涵體和中性粒細胞浸潤增加。原位雜交顯示所有豬只的NALT 中PCV2 信號陽性，一半的豬只NALT 中PRRSV 陽性信號。PCV2 陽性巨噬細胞主要見于濾泡，而PRRSV 陽性組織主要見于隱窩周圍和上皮正下方。定量PCR 顯示NALT 中有108-1010拷貝的PCV2 DNA/μL 和102-104拷貝的PRRSV DNA/μL。因此兩種病毒在NALT和扁桃體中的共感染和復(fù)制可能抑制宿主免疫并促進與其他病原體的共同感染。

為比較PCV2 不同基因型的毒株和PRRSV-2 混合感染，與單獨感染PCV2 的致病力的差異，研究者用三種基因型PCV2（a、b 和d）單獨與混合PRRS 感染試驗豬，發(fā)現(xiàn)混合感染和單獨感染PCV2 在病毒血癥水平、肺和淋巴病變嚴重程度以及淋巴病變中PCV2 抗原載量方面都出現(xiàn)明顯差異。證實無論PCV2 基因型如何，與單獨接種PCV2 的豬只相比，混合感染PCV2/PRRSV 的豬只具有顯著更嚴重的臨床癥狀、更低的平均日增重、更高水平的PCV2 病毒血癥以及更嚴重的耳和淋巴病變。從不同PCV2 的基因型共感染來看，PCV2d/PRSV2 的共感染豬只具有明顯更高的PCV2 病毒血癥水平、更嚴重的肺部和淋巴病變，組化結(jié)果顯示淋巴病變內(nèi)有更多的PCV2 陽性細胞，提示PCV2 的載量增加更明顯，共感染PCV2a/PRSV2 和PCV2b/PRRSV2 的豬只相比2d 基因型的共感染相對輕微，而這三種基因型的PCV2 單獨感染豬只，在病毒血癥和相關(guān)淋巴病變之間沒有發(fā)現(xiàn)差異，這個試驗的結(jié)果表明，PCV2a/PRSV2、PCV2b/PRRSV2 和PCV2d/PRSV2 的共感染之間的毒力存在顯著差異。另外一項研究也得到了類似的結(jié)果，在該試驗中比較了4 種PCV2 基因型（2a、2b、2d 和2e）在單獨感染這4 種PCV2 基因型中的1 種的豬只和同時感染豬圓環(huán)病毒的豬只中的毒力4 種PCV2 基因型中的1種與PRRSV2 的組合。根據(jù)血液和淋巴結(jié)中PCV2 負荷的水平以及淋巴病變的嚴重程度來確定毒力。在單個感染組中，PCV2a、PCV2b 和PCV2d 導(dǎo)致彼此相似的毒力，并且都比PCV2e 組更具毒力。在雙重感染組中，PCV2d 和PRRSV 的組合比其他3 種PCV2 基因型（2a、2b和2e）更具毒力，每種基因型都與PRRSV 組合。PCV2a+PRSV 和PCV2b+PRSV 在雙感染豬只中的毒力均高于PCV2e+PRSV。與其他3種PCV2 基因型（2a、2b 和2e）相比，PCV2d 的毒力增加可能歸因于PCV2d 開放閱讀框2（ORF2）內(nèi)發(fā)現(xiàn)的額外氨基酸（賴氨酸殘基）。相反，與其他3 種PCV2 基因型（2a、2b 和2d）相比，ORF2 中的額外氨基酸可能會降低PCV2e 的毒力。這個試驗結(jié)果表明，PCV2d 是與PRRSV 共感染的豬只中毒力最強的PCV2 基因型。結(jié)果還表明，PCV2 ORF2 的遺傳差異可能影響PCV2基因型的毒力。尤其需要注意的是，目前我國田間流行的PCV2 目前已經(jīng)逐步過渡到以PCV2d 基因型為主，在這種情況下，和PRRS 出現(xiàn)混合感染其癥狀可能比以往會更加嚴重，致死率更高。

為了確定兩種時間和基因上不同的2 型PRRSV 分離株在體內(nèi)感染動力學的差異，同時感染和不感染PCV2a 或2b 型，62 頭豬隨機分為7 組：陰性對照組（n=8）；同時感染PRRSV 毒株（VR-2385） 和PCV2a（CoI-92-2a；n=9）、同時感染VR-2385 和PCV2b（CoI-922b；n=10）、同時感染2006年P(guān)RRSV病毒毒株（NC16845b）和PCV2a（CoI-06-2a；n ＝9）、 同時感染NC16845b 和PCV2b（CoI-06-2b；n=1）、感染VR-235（n=9）和感染NC16845（n=9）等組。在接種前和接種后第3、6、9 和12 d（dpi）采集血樣，并測試PRRSV 抗體和核酸、PCV2 抗體和核酸、全血計數(shù)和干擾素γ（IFN-γ）水平。無論是否并發(fā)PCV2 感染，VR-2385 感染能以較高水平復(fù)制，并在dpi 6 達到峰值復(fù)制水平。與感染NC16845b 的豬只相比，感染VR-2385 的豬只在dpi 3 和dpi 6 的血清中的病毒核酸顯著更高。NC16845b 病毒復(fù)制高峰出現(xiàn)在dpi 9 和dpi 12 之間，并與這些豬只的抗PRRSV 抗體反應(yīng)延遲有關(guān)。與單獨感染PRRSV 的豬只相比，PCV2 共感染導(dǎo)致更嚴重的宏觀和微觀肺部損傷，并且抗PRRSV IgG 反應(yīng)更強。

Chun Kuen 對臺灣一家養(yǎng)豬場發(fā)生的繁殖障礙事件進行了調(diào)查。通過組織病理學、聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化的試驗，發(fā)現(xiàn)PCV2 和PRRSV 共感染更容易造成繁殖礙。

為觀察豬只相繼感染PRRS 和PCV2 這兩種病毒的致病性，有試驗將豬只分為：HP-PRSV/PCV2（第1 組，接種HP-PRSV，一周后接種PCV2）、PCV2/HP-PRSRSV（ 第2組，接種PCV2，一周之后接種HPPPRRSV）、HP-PRSV+PCV2（ 第3組，同時接種HP-PRSV 和PCV2），PRRS（ 第4 組， 接 種PRRS），PCV2（第5 組，接種PCV2）和對照組（第6 組，未感染），試驗持續(xù)了28 d。接種后每天記錄臨床癥狀和直腸溫度，每周記錄體重，獲取血清樣本用于病毒核酸定量和抗體滴定。通過流式細胞術(shù)測定CD3+、CD4+、CD8-、CD3+、CD3- 和CD8+細胞、自然殺傷（NK）細胞和單核細胞的變化。測定血清中干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白介素10（IL-10）和巨噬細胞粒細胞集落刺激因子（GMCSF）的濃度，記錄試驗感染豬只不同組織的病理變化。結(jié)果顯示，先感染PRRS 再感染PCV2 的仔豬病毒載量最高，抗體滴度最低，臨床癥狀最嚴重，死亡率最高，與其他HP-PRSV 感染組相比，該組的間質(zhì)性肺炎更嚴重。血清IFN-γ、TNF-α、IL-10 和GM-CSF 水平在第1 組中變化最為廣泛（增加或減少），每個免疫細胞亞組也是如此。提示HP-PRSV 和PCV2 共感染增強了兩種病毒在試驗仔豬中的復(fù)制，并導(dǎo)致更嚴重的臨床癥狀和病變，而豬只依次感染HP-PRSV 和PCV2使這兩者具有更大的協(xié)同效應(yīng)。

還有學者研究發(fā)現(xiàn)，PCV2a 和PCV2b 同時感染會增加PRRSV 在豬體內(nèi)連續(xù)傳代期間的氨基酸突變率，使PRRS 變得更復(fù)雜難以控制。

有研究者認為共感染病毒時DC（樹突狀細胞）誘導(dǎo)的Treg（調(diào)節(jié)性T 細胞）數(shù)量顯著高于單獨感染PCV2 的DC（P＜0.05），認為共感染時通過調(diào)節(jié)Treg 介導(dǎo)免疫抑制，使共感染比單獨感染更加嚴重可能是機制之一。

2 共感染的免疫策略

共感染的復(fù)雜性給很多豬場的疾病控制帶來難度，總體上免疫是不可缺少的一環(huán)，但是如何確定免疫的優(yōu)先性，免疫后的效果如何，都需要進一步研究。

Changhoon Park 等從病毒血癥、中和抗體、特異性IFN-γ-SCs，淋巴結(jié)和肺部的病變和抗原載量等方面評估使用PRRS 和PCV2 疫苗對兩者共感染的控制效力。結(jié)果顯示，接種PCV2 疫苗減少了共感染豬的PCV2 病毒血癥、PCV2 誘導(dǎo)的病變和PCV2 抗原載量。而接種PRRSV疫苗可能增加雙感染豬的PCV2 病毒血癥、PCV2 誘導(dǎo)的病變和PCV2抗原。因此，單獨使用PRRSV 疫苗并不能降低共感染豬中PRRSV引起的PCV2 損傷的增強（2013）。這提示在臨床上針對這類混合感染時，兩種疫苗都要進行免疫，但PCV2 疫苗要適當優(yōu)先于PRRS 疫苗，或者實行兩者共免疫。

Jiwoon 等根據(jù)在豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體和豬圓環(huán)病毒2 型等3 種病原體攻毒模型上進行了這3 種疫苗接種策略的研究，試驗中豬只在21 d 時同時接種豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬肺炎支原體和豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）疫苗，在42日齡時用PRRSV 和豬肺炎支原體攻毒，然后在56日齡時用PCV2 攻毒（0 dpc）。在臨床表現(xiàn)（平均日增重和臨床體征）、微生物學（病毒血癥和鼻腔脫落）、免疫學（抗體和干擾素-γ 分泌細胞）和病理（病變）結(jié)果方面，接種疫苗的攻毒組和未接種疫苗的攻毒組之間觀察到顯著差異。3 個接種疫苗的攻毒組在微生物學（豬肺炎支原體鼻脫落和PCV2 病毒血癥）和免疫學（豬肺炎鏈球菌和PCV2 特異性干擾素-γ 分泌細胞）結(jié)果方面存在顯著差異。顯示PRRSV 疫苗、豬肺炎支原體疫苗和PCV2 疫苗的接種方案對于控制PRRSV、豬肺炎鏈球菌和PCV2 從斷奶到保育結(jié)束期間的三重攻毒是有效的（2018）。

但是也有研究發(fā)現(xiàn)，豬只單獨接種PRRS 弱毒活疫苗，而不接種PCV 疫苗，在接種后采用PRRSV和PCV2 組合同時進行攻毒，結(jié)果顯示，在攻毒后早期，接種疫苗組中出現(xiàn)PRRSV 相關(guān)臨床癥狀的豬只數(shù)量減少，平均日增重（ADG）增加，證明了PRRS 疫苗對PRRS具有保護作用，但是，隨著時間的推移，免疫了疫苗的組中，更多的豬只表現(xiàn)出PCV2 病毒血癥增加、ADG 降低、PCVAD 臨床癥狀增加和死亡率增加。作者推測，在這種疾病模型中，PRRSV 疫苗接種的早期益處被PCVAD 的后期擴增所抵消導(dǎo)致這一現(xiàn)象。這個試驗側(cè)面顯示單獨免疫PRRS 而不免疫PCV2，隨養(yǎng)殖時間的延長其缺陷逐漸顯現(xiàn)和突出，并不可取。

需要注意的是，盡管廣泛使用PCV2 疫苗，能夠控制保育階段的PWMS 等問題，但PRDC 仍然是一個嚴重的呼吸道問題，尤其是育肥后期的PRDC 問題，控制難度很大，這和PCV2 免疫的保護時長可能有一定的關(guān)系，在育肥后期PRDC 嚴重的豬場，可以將排出PCV2 的免疫改為兩次。PRRS 的主要影響日齡在8 周齡左右，其次是16 周左右，兩者貌似時間間隔較大，但實際上由于PRRS 和PCV2 的協(xié)作性影響，在已經(jīng)免疫過PCV2 的豬場里，經(jīng)常也帶來保育8 周齡左右的PCVAD，并且難于控制。因此這兩者進行協(xié)同免疫也很重要，也可以嘗試進行這兩種滅活苗的聯(lián)合免疫。