于茜雅，魯 騫，吳昌正,3，王阿利，黃桂東,*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528000；3.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528500）

醬油是一種以大豆為主要原料的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品[1]，其加工工藝主要包括傳統(tǒng)日曬夜露發(fā)酵、高鹽稀態(tài)發(fā)酵和低鹽固態(tài)發(fā)酵3 種[2]。廣式醬油作為中式醬油華南地區(qū)的代表，其通常采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝自然發(fā)酵制成[3]，即在高鹽微酸的開放環(huán)境中經(jīng)過制曲、醬醪發(fā)酵、壓榨出油、調(diào)配滅菌等步驟制成成品醬油，而已發(fā)酵成熟的醬醪經(jīng)壓榨過濾出的油被稱為“原油”[4]。原油是成品醬油的基礎(chǔ)，醬油的香氣及滋味主要源于原油，其品質(zhì)不僅取決于發(fā)酵工藝，還與其原料的選擇、發(fā)酵時間、發(fā)酵環(huán)境以及微生物區(qū)系等諸多因素密切相關(guān)[5]。因此探究醬油釀造過程中原油理化指標(biāo)的動態(tài)變化，有利于成品醬油的質(zhì)量控制。

高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油通常由多種耐鹽微生物協(xié)同發(fā)酵3～6 個月[6]，其分泌的豐富酶系將體系中的大分子物質(zhì)降解成氨基酸及還原糖[7]，同時產(chǎn)生酯、酸、醛、酚等風(fēng)味物質(zhì)[8]，使醬油醬香濃郁，風(fēng)味獨(dú)特。開放的發(fā)酵方式使多種環(huán)境因素成為影響醬油品質(zhì)的關(guān)鍵，發(fā)酵環(huán)境會在不同程度上影響體系中微生物代謝、酶解[9]以及美拉德反應(yīng)等生化反應(yīng)[10]，進(jìn)而改變醬油的品質(zhì)。廣東大多數(shù)地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)性氣候，該氣候的特點(diǎn)為夏熱冬溫，夏季月平均高溫可達(dá)35 ℃，而冬季月平均低溫可低至9 ℃（該數(shù)據(jù)來自中國氣象網(wǎng)）。季節(jié)性變化引起的環(huán)境溫度差異導(dǎo)致不同批次發(fā)酵的醬油品質(zhì)穩(wěn)定性欠佳[11]，因此明晰發(fā)酵溫度對廣式醬油原油品質(zhì)的影響，可以為優(yōu)化廣式醬油發(fā)酵穩(wěn)定性工藝提供理論依據(jù)。

本研究從模擬四季環(huán)境溫度出發(fā)，通過監(jiān)測不同發(fā)酵溫度原油理化指標(biāo)變化，分析原油風(fēng)味物質(zhì)含量差異，確定影響風(fēng)味的主要差異標(biāo)志物，并結(jié)合感官評分評定原油品質(zhì)，將有利于提升廣式醬油品質(zhì)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 醬醪

曲料由廣東省某調(diào)味品公司提供。將成熟曲料碾碎后與18%飽和鹽水以1∶2的體積比混合。模擬嶺南地域四季溫度設(shè)定發(fā)酵溫度為37、30、15 ℃進(jìn)行小試發(fā)酵，并與自然發(fā)酵條件（溫度為20～25 ℃）作對比。以成曲混合鹽水入罐起記為0 d，發(fā)酵周期為60 d，期間定期攪拌醬醪，每隔5 d測定一次醬醪中心溫度，取樣時間為發(fā)酵第5、15、25、35、60天。將醬醪充分?jǐn)嚢韬笕?，取樣后將醬醪進(jìn)行過濾，濾后的原油于－80 ℃冰箱保存待用。

1.1.2 試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色液 福州飛凈生物科技有限公司；甲醛（分析純）廣州化學(xué)試劑廠；NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）深圳市博林達(dá)科技有限公司；三氯乙酸（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；2-辛醇（標(biāo)準(zhǔn)品）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyTMH1多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek儀器有限公司；PHscan40筆形pH計 上海般特儀器制造有限公司；905自動電位滴定儀 瑞士萬通中國有限公司；LA8080型氨基酸分析儀 日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技（中國）有限公司；5804R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

將1.1.1節(jié)原油樣品冷卻到室溫，并于10 000 r/min離心5 min，收集上清液用于下述理化指標(biāo)測定。還原糖：采用DNS顯色法；總酸和氨基酸態(tài)氮：按照酸堿滴定法和甲醛滴定法，通過自動電位滴定儀分別測定總酸以及氨基酸態(tài)氮的含量；pH值：直接通過pH計測定。

1.3.2 游離氨基酸含量測定

取2 mL原油樣品，用5 g/100 mL三氯乙酸溶液定容至40 mL。靜置0.5 h后，25 ℃、8 000 r/min離心15 min。取5 mL上清液用超純水定容至50 mL，取2 mL稀釋液過0.22 μm濾膜后注入樣品瓶中，即為待測樣液。參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》對上述待測樣液進(jìn)行處理，用氨基酸分析儀進(jìn)行測定[12]。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

采用固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測原油中的揮發(fā)物質(zhì)成分。

樣品處理：吸取5 mL原油和25 μL質(zhì)量濃度為3.35×10－3mg/mL的2-辛醇溶液（內(nèi)標(biāo)物）于20 mL頂空瓶中，在孵化器中于40 ℃平衡10 min，然后在40 ℃用CAR/PDMS固相微萃取頭頂空萃取30 min。萃取完成后在進(jìn)樣口于250 ℃解吸1 min完成進(jìn)樣。

GC條件：HP-INNOWax毛細(xì)色譜柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫條件為40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min。載氣為氦氣，流速1.2 mL/min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，四極桿和傳輸線溫度分別為200 ℃和220 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 u。

1.3.4 感官評價

采用定量描述分析法——數(shù)字評估法評價不同原油樣品感官特征差異。將1.1.1節(jié)所濾原油經(jīng)巴氏殺菌處理，挑選25 位有鑒評經(jīng)驗(yàn)的感官品評人員，對原油的體態(tài)、色澤、風(fēng)味、香氣及綜合喜好度進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。將各指標(biāo)評分取平均值，并繪制雷達(dá)圖。

表1 感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of soy sauce

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 24對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；用軟件Graph Prism 9.4.1繪制折線圖及柱狀圖；用軟件Origin繪制雷達(dá)圖；將揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，用軟件Rstudio軟件進(jìn)行熱圖繪制，并結(jié)合軟件Simca進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），繪制得分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪發(fā)酵過程中溫度變化

本次小試發(fā)酵從11月末起至次年1月，該時期室內(nèi)溫度變化范圍為20～25 ℃，自然發(fā)酵樣品于通風(fēng)良好的室內(nèi)發(fā)酵。4 種溫度發(fā)酵的醬醪樣品中心溫度變化如圖1所示，該數(shù)據(jù)為后續(xù)醬油理化指標(biāo)、游離氨基酸組成及風(fēng)味物質(zhì)等變化提供了依據(jù)。

圖1 發(fā)酵過程中醬醪中心溫度的變化Fig.1 Temperature variation of moromi during fermentation process

2.2 發(fā)酵溫度對原油pH值和總酸的影響

醬油中的酸類物質(zhì)主要是在微生物代謝過程中產(chǎn)生，生成的有機(jī)酸可以與原油中醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)[13]，以此賦予醬油醇厚濃郁的風(fēng)味。因此，原油的pH值和總酸可以作為評價醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)。

由圖2 可知，發(fā)酵溫度對原油的pH 值影響顯著（P＜0.05）。在整個發(fā)酵過程中原油的pH值呈持續(xù)下降趨勢，且在4 個原油樣品中HT樣品的pH值最低，LT樣品的pH值最高。這可能是因?yàn)镠T樣品發(fā)酵溫度為37 ℃，該溫度條件下適宜乳酸菌生長繁殖，乳酸菌代謝產(chǎn)生大量有機(jī)酸[14]，使發(fā)酵體系pH值大幅度下降。4 個樣品的總酸整體呈上升趨勢，其原因可能是原料中的蛋白質(zhì)和脂肪被米曲霉酶系水解及其他微生物的共代謝作用，使有機(jī)酸、谷氨酸和脂肪酸等酸類物質(zhì)在體系中大量生成[15]。HT樣品和LT樣品在發(fā)酵過程中總酸含量持續(xù)上升，其中HT樣品在發(fā)酵60 d的總酸含量最高，達(dá)到1.51 g/100 mL。MT樣品和NT樣品在發(fā)酵15 d總酸增速減緩，25 d總酸含量略有下降，35 d又緩慢上升，這可能由于發(fā)酵15 d起體系中的酸類物質(zhì)與醇發(fā)生酯化反應(yīng)[16]，促使總酸含量下降，發(fā)酵后期由于體系中芽孢桿菌的作用使得總酸含量略有上升[13]?？傮w而言，37 ℃發(fā)酵有利于原油體系中總酸的生成，相對較高的溫度賦予了醬油酸味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 發(fā)酵過程中原油pH值（a）及總酸含量（b）的變化Fig.2 Changes of pH (a) and total acid content (b) in base soy sauce during fermentation process

2.3 發(fā)酵溫度對原油中氨基酸態(tài)氮含量的影響

醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸是鮮味的主要來源，因此氨基酸態(tài)氮為鑒定醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)[9]。氨基酸態(tài)氮主要由游離氨基酸和肽的氮元素構(gòu)成，其含量越高，說明當(dāng)前原料的水解反應(yīng)越徹底，即有更多的呈味氨基酸生成[17]。由圖3可知，按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的醬油等級評價標(biāo)準(zhǔn)[18]，發(fā)酵末期4 個樣品的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度均高于0.8 g/100 mL，已達(dá)到特級醬油標(biāo)準(zhǔn)。隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸態(tài)氮含量整體呈上升趨勢。醬醪發(fā)酵前期，發(fā)酵溫度對原油中氨基酸態(tài)氮含量影響極顯著（P＜0.01）；而發(fā)酵末期，溫度對原油中氨基酸態(tài)氮含量的影響不顯著。這可能由于一定程度的高溫可促進(jìn)米曲霉蛋白酶酶解，且醬醪發(fā)酵前期微生物分泌的蛋白酶活力強(qiáng)[19]，加速了原料中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸，且乳酸菌的胞外蛋白水解也可生成游離氨基酸[20]。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行體系pH值下降，蛋白酶活力逐漸降低，且發(fā)酵中期微生物處于相對優(yōu)勢生長階段，其代謝會消耗部分氨基酸并轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)[21]，致使發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮上升趨勢變緩。發(fā)酵溫度越高，原油初始氨基酸態(tài)氮含量越高，HT初始氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度可達(dá)到0.84 g/100 mL，LT的初始氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度僅為0.42 g/100 mL，但在整個發(fā)酵時期中，LT樣品的氨基酸態(tài)氮生成速率最高，發(fā)酵結(jié)束其質(zhì)量濃度升至0.98 g/100 mL。相比其他發(fā)酵溫度，一定程度的低溫可延長蛋白酶催化水解時間[22]，使發(fā)酵末期其氨基酸態(tài)氮含量與其他體系基本持平。因此，溫度變化對發(fā)酵末期原油氨基酸態(tài)氮含量無明顯影響。

圖3 發(fā)酵過程中原油氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino nitrogen content in base soy sauce during fermentation process

2.4 發(fā)酵溫度對原油中還原糖含量的影響

還原糖作為評價醬油質(zhì)量指標(biāo)之一，可以反映出不同發(fā)酵體系中淀粉酶水解程度及微生物代謝情況[13]。還原糖既可以賦予發(fā)酵食品甜味，也可作為碳源參與各種生化反應(yīng)[23]。由圖4可知，發(fā)酵溫度對體系中還原糖含量的變化影響顯著。發(fā)酵初期，原料被淀粉酶水解生成大量葡萄糖、果糖等還原糖[24]，此時4 個樣品的還原糖含量均呈上升趨勢。LT和NT樣品在整個發(fā)酵過程中均為上升趨勢，而HT樣品和MT樣品在發(fā)酵中期還原糖含量出現(xiàn)明顯波動，其中MT樣品在發(fā)酵至25 d還原糖含量開始下降，發(fā)酵至60 d低至4.36 g/100 mL，與其他3 個樣品差異顯著（P＜0.05），產(chǎn)生這種差異的原因可能是30 ℃發(fā)酵體系中酵母菌等微生物代謝旺盛，將大量還原糖轉(zhuǎn)化為醇類及酸類物質(zhì)[25]，使還原糖的消耗率大于生成率。HT樣品在發(fā)酵后期還原糖含量略有提升，推測在前期乳酸菌的活躍使體系pH值降低，當(dāng)pH值較低時會促淀粉酶的活力[11]，將未發(fā)酵完全的原料進(jìn)行進(jìn)一步酶解，使還原糖的生成率增加。上述研究表明，中溫30 ℃發(fā)酵促進(jìn)體系中微生物對還原糖的利用率，有利于原油風(fēng)味物質(zhì)的形成。

圖4 發(fā)酵過程中原油還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar content in base soy sauce during fermentation process

2.5 發(fā)酵溫度對原油中游離氨基酸含量的影響

醬油體系中由蛋白質(zhì)水解所生成的游離氨基酸是評價醬油滋味的重要指標(biāo)[26]。如表2所示，醬醪發(fā)酵至60 d，原油HT、MT、LT和NT樣品總游離氨基酸質(zhì)量濃度依次為6.542、6.968、6.820 g/100 mL和6.374 g/100 mL，且發(fā)酵溫度對不同原油中各游離氨基酸含量（除纈氨酸）影響顯著（P＜0.05），其中MT樣品總游離氨基酸含量最高，可能由于該條件下可參與水解蛋白質(zhì)和多肽的酶活力較強(qiáng)[27]；HT樣品由于高溫促進(jìn)美拉德反應(yīng)消耗氨基酸[9]，從而降低了總游離氨基酸含量。

表2 發(fā)酵末期原油游離氨基酸組成Table 2 Free amino acid composition of base soy sauce at the end of fermentation

根據(jù)氨基酸的呈味性，可將游離氨基酸分為鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、甜味氨基酸（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸）、苦味氨基酸（纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸）和無味氨基酸（胱氨酸）4 種[28]。天冬氨酸和谷氨酸兩種鮮味氨基酸含量相對較高，其中谷氨酸為醬油鮮味的主要呈味物質(zhì)[29]。MT樣品的鮮味氨基酸總含量高于其余3 組，LT樣品谷氨酸含量最高，達(dá)到了1.264 g/100 mL，但除組氨酸和精氨酸外，其余苦味氨基酸含量在LT樣品中均為最低水平，MT組苦味氨基酸含量比LT組提高了4.08%，該結(jié)果與Hoang等[30]的研究結(jié)果一致，推測溫度是影響苦味氨基酸形成的關(guān)鍵因素?？辔栋被岷扛卟坏韧跇悠房辔逗裰?。醬油發(fā)酵體系復(fù)雜，多種呈味物質(zhì)共同作用構(gòu)成醬油鮮美醇厚的滋味[31]。甜味氨基酸中，MT樣品中絲氨酸和LT樣品中蘇氨酸含量較高，而HT樣品蘇氨酸含量低，這可能由于絲氨酸和蘇氨酸會參與乳酸菌及其他細(xì)菌的代謝[32]。NT樣品的鮮味氨基酸、甜味氨基酸及苦味氨基酸均處較低水平。上述研究表明：自然發(fā)酵相對不利于游離氨基酸的形成，而高溫發(fā)酵會促進(jìn)體系中游離氨基酸的利用。

2.6 發(fā)酵溫度對原油風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

2.6.1 原油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成定量分析

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對4 種溫度條件發(fā)酵的原油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出234 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，將其分為9 大類：醇、酯、酮、醛、酸、酚、含硫化合物、呋喃（酮）和吡嗪。包括醇類34 種、酯類61 種、酮類48 種、醛類29 種、酸類20 種、酚類7 種、含硫化合物2 種、呋喃（酮）類20 種、吡嗪類7 種以及其他化合物6 種。

根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量（圖5a）來看，HT樣品與其他樣品相比吡嗪及醛酮類物質(zhì)種類較多，而醇類物質(zhì)種類較少；MT樣品中醇類及酸類物質(zhì)種類高于其他3 個樣品；LT樣品除醇類物質(zhì)外，其他風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量均處于低水平；NT樣品風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量與其他樣品差異不顯著。

圖5 不同溫度發(fā)酵的原油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)（a）及含量（b）差異Fig.5 Differences in the types (a) and concentrations (b) of volatile flavor compounds among base soy sauce samples

根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量（圖5b）來看，MT樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，LT樣品風(fēng)味物質(zhì)總含量最低。HT樣品中醇類及酚類物質(zhì)含量較少，而含硫化合物及吡嗪類物質(zhì)含量高；MT樣品中醇類及酚類物質(zhì)含量高；LT樣品呋喃（酮）類物質(zhì)含量豐富；根據(jù)不同溫度發(fā)酵的原油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，原油發(fā)酵的溫度與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及組成有著密切的關(guān)系，因此可以通過改變醬醪發(fā)酵的溫度改善原油的風(fēng)味。

2.6.2 原油特征性風(fēng)味物質(zhì)熱圖聚類分析

為了探究4 種原油樣品風(fēng)味物質(zhì)的差異，將4 種樣品中檢測到的物質(zhì)與文獻(xiàn)[33-35]報道的特征性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比對，將其含量標(biāo)準(zhǔn)化后聚類分析，并以熱圖形式展示（圖6）。

圖6 不同溫度發(fā)酵原油中特征性風(fēng)味物質(zhì)熱圖及聚類分析Fig.6 Heatmaps and cluster analysis of characteristic flavor substances in base soy sauce fermented at different temperatures

醇類物質(zhì)是形成原油風(fēng)味的主要揮發(fā)性化合物，在9大類化合物中含量最高。4 個樣品中，MT樣品最易形成乙醇以及部分高級醇，這與MT樣品中酵母菌消耗大量還原糖有關(guān)，其通過Ehrlich途徑代謝生成高級醇[36]。MT樣品生成的異戊醇、3-戊醇、3-甲硫基丙醇和1-辛烯-3-醇等醇類物質(zhì)處于較高水平，異戊醇具有麥芽香氣；3-戊醇呈甜香；3-甲硫基丙醇具有烤土豆香氣。1-辛烯-3-醇賦予原油蘑菇香氣，為醬油中的特征性醇類物質(zhì)，其含量在MT中約高于其他樣品的3～9 倍。HT樣品中具有玫瑰香氣的苯乙醇含量較高，同時NT樣品也含有少量高級醇，但LT樣品中大部分高級醇均處于較低水平。

酸類物質(zhì)的含量與發(fā)酵末期原油總酸（圖2）趨勢基本一致，HT樣品總含量最高，以2-甲基丁酸、異丁酸（奶酪香）為主的酸類化合物可能使高溫樣品酸性較強(qiáng)。酸類物質(zhì)又可與高級醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類化合物。酯類是表征醬油中花果香的重要風(fēng)味物質(zhì)，可以中和醬油的鮮味，使香氣更加醇厚飽滿[37]。在30 ℃發(fā)酵環(huán)境下，酵母菌作用促進(jìn)了MT樣品中多種醬油特征性酯類化合物的形成，如乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等，可賦予原油清甜的花果香氣。

醛酮類及吡嗪類化合物主要通過美拉德反應(yīng)生成[38]。結(jié)果表明，HT樣品中含有大量的醛酮類及雜環(huán)化合物，而LT樣品則處于較低水平，有研究表明醛類物質(zhì)也可由異亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸等氨基酸促進(jìn)生成[10]，這可能是造成LT樣品醛類物質(zhì)含量較少的主要因素之一。酚類物質(zhì)在MT樣品中占比最高，以呈麥芽香的2-甲基丁醛為主的醛類物質(zhì)可在酵母作用下進(jìn)一步生成產(chǎn)生煙熏香的酚類物質(zhì)[39]。吡嗪類物質(zhì)如2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等主要呈堅(jiān)果香、焙烤香；呋喃（酮）類物質(zhì)如糠醛及5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）等可賦予焦糖香氣，二者共同為HT樣品提供醬香風(fēng)味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，不同溫度發(fā)酵的原油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大，HT樣品中大量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可為原油提供醬香風(fēng)味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)；MT樣品由于酵母菌的代謝作用使其醇類、酯類及酚類物質(zhì)極為豐富，使原油風(fēng)味呈現(xiàn)酯香濃郁且醇厚柔和；而LT樣品中大量醛酮及吡嗪類物質(zhì)的缺失，造成原油醬香不足。

2.6.3 原油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OPLS-DA模型分析

為了進(jìn)一步探究發(fā)酵溫度對原油風(fēng)味的影響，從234 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中篩選出差異顯著的風(fēng)味物質(zhì)（P＜0.05），再利用OPLS-DA模型監(jiān)督分析并量化4 個樣品間的差異程度，選出變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）大于1的差異代謝物[40]。經(jīng)OPLS-DA計算出和和Q2分別為0.962、0.998、0.989，其中和接近1證明該模型擬合度較好，且Q2＞0.5表明模型有較好的預(yù)測能力，因此該模型可以用來分析組間差異標(biāo)志物[40]。從圖7可看出，LT樣品和NT樣品距離較近，而與HT和MT樣品間隔較遠(yuǎn)，這證明低溫發(fā)酵和自然發(fā)酵的原油風(fēng)味物質(zhì)及含量較為相似，而高溫發(fā)酵、中溫發(fā)酵和低溫發(fā)酵3 種樣品風(fēng)味成分及含量差異較大。根據(jù)篩選結(jié)果看VIP值大于1的差異代謝物共33 種（圖8），包括醇類6 種、酸類3 種、酯類8 種、醛類3 種、酮類6 種、酚類2 種、呋喃類4 種、吡嗪類1 種。MT樣品中差異代謝物種類最多且部分化合物含量顯著高于其他樣品，包括具有蘑菇香氣的1-辛烯-3-醇、呈果香的乙酸甲酯及乳酸乙酯、具有奶油香氣的3-羥基-2-丁酮等，上述物質(zhì)均為文獻(xiàn)中報道的醬油特征性風(fēng)味物質(zhì)，而這可能成為其他3 種樣品風(fēng)味缺失的關(guān)鍵因素。

圖7 不同溫度發(fā)酵的原油風(fēng)味物質(zhì)OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score plot of volatiles in base soy sauce fermented at different temperatures

圖8 VIP值大于1的風(fēng)味物質(zhì)Fig.8 VIP scores of volatiles (VIP ＞ 1)

2.7 感官評價

為了進(jìn)一步確定不同溫度發(fā)酵的原油品質(zhì)差異，對原油的體態(tài)、色澤、氣味及口感進(jìn)行感官評價。圖9表明，綜合評分MT樣品得分最高，較NT樣品總分提升了4.8%，其原因可能是該原油樣品中醬油特征性風(fēng)味成分較為豐富，如1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯以及HMF等賦予原油濃郁的醬香酯香，且各呈味氨基酸的結(jié)合使其滋味鮮美。HT樣品口感和氣味與MT樣品相比，分別下降了3.18%和5.4%，結(jié)合前面結(jié)果可知：醛酮類及吡嗪類化合物過多，且體系總酸含量較高，致使樣品產(chǎn)生焦糊味且酸味過重。LT樣品綜合得分最低，與MT相比降低了12.52%，這與前面結(jié)論相符。由于LT樣品揮發(fā)性物質(zhì)總含量最低，且在15 ℃低溫發(fā)酵條件不利于發(fā)生美拉德等褐變反應(yīng)致使原油樣品醬香味缺失，結(jié)合香氣-滋味交互作用可推測關(guān)鍵風(fēng)味缺失為樣品口感不佳的因素之一[41]。因微生物對還原糖未充分利用，形成風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)較少，故NT樣品香氣得分較低?？傮w而言，30 ℃控溫發(fā)酵對原油的口感、色澤及整體風(fēng)味有較大提升。

圖9 不同溫度發(fā)酵原油的感官評分雷達(dá)圖Fig.9 Radar plot of sensory evaluation scores of base soy sauce fermented at different temperatures

3 結(jié)論

通過控制醬油發(fā)酵溫度，分析不同溫度條件發(fā)酵的原油樣品中pH值、總酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢，分析發(fā)酵60 d原油游離氨基酸組成以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量差異。結(jié)果表明：自然發(fā)酵的原油游離氨基酸生成率較低；高溫37 ℃發(fā)酵的原油具有美拉德反應(yīng)及醬香味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)（酸類及吡嗪類），但不利于發(fā)酵末期游離氨基酸的形成且氣味不佳；30 ℃發(fā)酵具有形成醇厚柔和風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)（醇類及酯類），游離氨基酸生成量最高，且原油感官評分最佳；低溫15 ℃發(fā)酵的原油雖易形成鮮味氨基酸及甜味氨基酸，風(fēng)味物質(zhì)基礎(chǔ)較差且感官得分最低。綜上，30 ℃控溫發(fā)酵的原油品質(zhì)風(fēng)味最佳。該研究雖探究了不同溫度發(fā)酵的原油品質(zhì)差異，但目前影響原油品質(zhì)的機(jī)理尚不明確，后續(xù)研究需將醬醪體系中的微生物與相應(yīng)原油中各理化指標(biāo)結(jié)合分析，進(jìn)一步探究環(huán)境溫度對原油品質(zhì)的影響機(jī)制，為優(yōu)化醬油釀造工藝提供參考。