代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)β-煙酰胺單核苷酸

安俊俠，王倩倩，王昭穎，劉 歡，徐慶陽，范曉光

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

β-煙酰胺單核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，β-NMN）屬維生素B族衍生物，廣泛存在于蔬菜、真菌、肉類和蝦類等天然食物中，參與人體內(nèi)多種生化反應(yīng)，與免疫、代謝調(diào)控息息相關(guān)[1-2]。在人體中，β-NMN作為輔酶I NAD＋的前體，直接參與NAD＋的合成，并通過NAD＋體現(xiàn)其功能[3-4]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，β-NMN對(duì)緩解老年退行性疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂和衰老等方面具有較好的作用[5-6]。β-NMN的食品安全性較高，日本、歐美等國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)其作為新食品原料[7-8]。與NAD＋相比，β-NMN更容易進(jìn)入細(xì)胞，因此適合在食品、飲料、保健品中使用。

根據(jù)2013年我國(guó)第五次國(guó)家衛(wèi)生服務(wù)調(diào)查分析報(bào)告中的老年人生活照料調(diào)查統(tǒng)計(jì)[1]數(shù)據(jù)顯示(以城市老年人生活照料分析為主)，11.9%的在城市生活的老人在近30天的生活起居方面需要照顧時(shí)，49%由配偶照顧；47.4%由子女或?qū)O子女照顧；0.8%由親戚、朋友、鄰居照顧；0.2%由社區(qū)提供照顧服務(wù)；1.8%是其他受助渠道獲取照顧服務(wù)或者是沒有人照顧，生活照顧需要自己獨(dú)立完成，具體見表1。

目前，β-NMN的生產(chǎn)方法主要分為化學(xué)合成法和酶催化法?；瘜W(xué)合成法工藝成熟，是β-NMN的主要生產(chǎn)方法，但存在合成路線繁瑣、反應(yīng)條件嚴(yán)苛、產(chǎn)物手性分離困難、使用有機(jī)溶劑等問題，導(dǎo)致產(chǎn)品售價(jià)較高[9-10]。酶催化法安全環(huán)保，產(chǎn)品旋光性單一，更容易被消費(fèi)者接受[11]。酶催化法可以分為3 種路線，第1種是以煙酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）為底物，以ATP為磷酸供體，在煙酰胺核糖激酶的作用下生成β-NMN[12]；第2種是以煙酰胺（nicotinamide，NAM）和5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate，PRPP）為底物，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，Nampt）的作用下生成β-NMN[13]；第3種是以煙酸和PRPP為底物，在煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下先生成煙酸單核苷酸（nicotinic acid mononucleotide，NaMN），然后在β-NMN合成酶的作用下生成β-NMN[14-15]。酶催化法的問題在于原料成本較高，酶活性和轉(zhuǎn)化效率較低，因此限制了工業(yè)級(jí)應(yīng)用放大[16]。

大部分微生物可以通過自身代謝合成PRPP，因此理論上通過系統(tǒng)代謝改造，可以實(shí)現(xiàn)以NAM或煙酸為前體發(fā)酵生產(chǎn)β-NMN[17]。本研究以生長(zhǎng)周期較短、遺傳背景清晰的野生型大腸桿菌（Escherichia coli）W3110作為出發(fā)菌株，設(shè)計(jì)模塊化代謝改造策略（圖1）。首先，分析并減弱底盤細(xì)胞中與NAM和β-NMN降解相關(guān)酶的表達(dá)，減少底盤細(xì)胞對(duì)前體和產(chǎn)物的額外消耗；其次，引入NAM輸入蛋白（BcNiaP）、β-NMN輸出蛋白（BmPnuC）、PRPP合成酶（PRPP synthetase，Prs）和Nampt，敲除調(diào)節(jié)蛋白PurR，實(shí)現(xiàn)了β-NMN的初步積累；此后，考察了不同來源的Nampt，篩選得到了酶活性較高且對(duì)底盤細(xì)胞負(fù)擔(dān)較小的催化用酶；最后，強(qiáng)化β-NMN輸出蛋白和Prs的表達(dá)水平，大幅提升了β-NMN的發(fā)酵產(chǎn)率。本研究通過基因組編輯和組成型質(zhì)粒表達(dá)方式，構(gòu)建1 株遺傳背景清晰、無營(yíng)養(yǎng)缺陷、無需誘導(dǎo)的大腸桿菌基因工程菌，以期實(shí)現(xiàn)NAM為前體發(fā)酵生產(chǎn)β-NMN。

圖1 代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)β-NMN策略Fig.1 Metabolic engineering strategies for β-NMN fermentation in E.coli

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

綜上所述，經(jīng)過長(zhǎng)期的發(fā)展，政府引導(dǎo)基金在撬動(dòng)社會(huì)資本、政府意愿體現(xiàn)、政府參與公司治理能力和多階段投資引導(dǎo)能力等方面為新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)行了以FOF為代表的制度創(chuàng)新，但現(xiàn)有模式在考慮新興產(chǎn)業(yè)融資的多階段性、行業(yè)不對(duì)稱性等方面仍有較大不足，推動(dòng)新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要對(duì)融資特征進(jìn)行準(zhǔn)確定義，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建創(chuàng)新融資模式。

本研究使用的菌株和質(zhì)粒分別見表1、2。其中，E.coliDH5α用于質(zhì)粒構(gòu)建，E.coliW3110 ΔlacI作為出發(fā)菌株用于構(gòu)建β-NMN生產(chǎn)菌株。

翻轉(zhuǎn)課堂是常用的教學(xué)方法，高中物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，也采用了翻轉(zhuǎn)課堂的方法，這種教學(xué)方法相比于傳統(tǒng)的教學(xué)方法有很多優(yōu)點(diǎn).首先，它把課堂的大多數(shù)時(shí)間都?xì)w還給學(xué)生，學(xué)生成為課堂的重心.翻轉(zhuǎn)課堂的提出，改變了傳統(tǒng)的授課模式，最大限度劃分課堂時(shí)間，合理配置教學(xué)資源，更好地為學(xué)生服務(wù).這種教學(xué)模式在高中物理實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，不僅提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)效率，而且還促進(jìn)了教育事業(yè)的改革.

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.3 引物

業(yè)務(wù)流程優(yōu)化指中小出版企業(yè)通過自主研發(fā)和外購(gòu)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)采、編、印、版、售等技術(shù)創(chuàng)新，聚焦于出版產(chǎn)業(yè)全鏈數(shù)字化輔助技術(shù)，促進(jìn)綠色印刷業(yè)務(wù)的開拓。“四維傳媒”基于“云計(jì)算”，將數(shù)字出版技術(shù)與移動(dòng)平臺(tái)技術(shù)順利嫁接，形成每個(gè)在線服務(wù)技術(shù)模塊，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程創(chuàng)意、中央圖庫、在線編輯、遠(yuǎn)程批注、色彩管理、遠(yuǎn)程打樣、綠色印刷以及在線全媒體閱讀等全鏈整合，極大地提高了數(shù)字出版效率。截至2017年年底，“四維傳媒”的“綠色出版”系統(tǒng)已經(jīng)獲得多項(xiàng)海外機(jī)構(gòu)認(rèn)證，并與歐美4個(gè)國(guó)家建立了戰(zhàn)略合作伙伴關(guān)系。“龍?jiān)磾?shù)媒”不斷創(chuàng)新和迭代觸控閱讀和互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，提高了產(chǎn)品“按需出版”的能力，為新增公共文化產(chǎn)品線預(yù)留了出版空間。

在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)β-NMN的發(fā)酵生產(chǎn)，需要考慮3 個(gè)方面的問題，一是前體NAM和產(chǎn)物β-NMN的轉(zhuǎn)運(yùn)；二是前體PRPP的供應(yīng)；三是催化β-NMN合成關(guān)鍵酶Nampt的活力。Shoji等[27]發(fā)現(xiàn)Burkholderia cenocepacia來源的煙酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BcNiaP）以及Bacillus mycoides來源的NR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BmPnuC）可以分別提高大腸桿菌對(duì)NAM的攝取和β-NMN的外排。BcNiaP和BmPnuC均為膜蛋白，表達(dá)過強(qiáng)將會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，因此將niapBc和pnuCBm基因整合至工程菌N-8基因組ilvG和ygaY位點(diǎn)上，并使用組成型Ptrc啟動(dòng)子控制其表達(dá)，獲得工程菌N-9和N-10。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉5 g/L，無水檸檬酸2 g/L，甲硫氨酸0.5 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO410 mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12各1 mg/L，pH 7.0～7.5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母粉6 g/L，無水檸檬酸2 g/L，甲硫氨酸0.3 g/L，KH2PO45.5 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO420 mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，苯酚紅8 mg/L，pH 7.0～7.5。

NAM 是β-NMN 合成的重要前體，大腸桿菌中pncA編碼的煙酰胺酶可以催化NAM脫酰胺生成煙酸，是NAM 的主要支路代謝[19]。因此，首先敲除pncA基因，減少底盤細(xì)胞對(duì)NAM的額外消耗，構(gòu)建出工程菌N-1。

1.1.2 培養(yǎng)基

引物由安升達(dá)（天津）生物科技有限公司合成。

1.1.4 試劑

蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司；無水檸檬酸、甲硫氨酸、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、(NH4)2SO4、NaCl 國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；NAM、β-NMN 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純）美國(guó)賽默飛世爾科技公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；限制性內(nèi)切酶、Primer STAR HS DNA聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；單片段快速克隆試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC-1148型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；U3000高效液相色譜儀、Hypersil? ODS-2 C18色譜柱 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SBA-40D生物傳感器分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

對(duì)于快遞包裝回收，國(guó)家有關(guān)部門制定了一個(gè)時(shí)間表。2017年，國(guó)家十部門聯(lián)合發(fā)布的《關(guān)于協(xié)同推進(jìn)快遞業(yè)綠色包裝工作的指導(dǎo)意見》明確，到2020年，可降解的綠色包裝材料應(yīng)用比例將提高到50%，基本淘汰重金屬等特殊物質(zhì)超標(biāo)的包裝物料，基本建成專門的快遞包裝物回收體系。主要快遞品牌協(xié)議客戶電子運(yùn)單使用率達(dá)到90%以上，平均每件快遞包裝耗材減少10%以上，推廣使用中轉(zhuǎn)箱、籠車等設(shè)備，編織袋和膠帶使用量進(jìn)一步減少?；窘⒖爝f業(yè)包裝治理體系。2019年1月1日實(shí)施的《電商法》中第五十二條規(guī)定，快遞物流服務(wù)提供者應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定使用環(huán)保包裝材料，實(shí)現(xiàn)包裝材料的減量化和再利用。

本研究所用質(zhì)粒pTrc99a自身含有表達(dá)乳糖操縱子阻遏物的lacI基因，在表達(dá)該質(zhì)粒時(shí)，需添加異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，但I(xiàn)PTG易影響菌體生長(zhǎng)，因此構(gòu)建組成型質(zhì)粒QI-pTrc99a。通過設(shè)計(jì)兩端攜帶酶切位點(diǎn)ApaI的引物，利用PCR擴(kuò)增出不含lacI的線性化pTrc99a載體，再通過重組酶Exnase?II的作用使其自身環(huán)化，構(gòu)建出組成型質(zhì)粒QI-pTrc99a，該質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖2。根據(jù)目的基因選擇適宜的酶切位點(diǎn)，對(duì)質(zhì)粒QI-pTrc99a進(jìn)行雙酶切，利用PCR擴(kuò)增獲得含酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子的目的基因片段，將酶切、PCR產(chǎn)物回收后利用Exnase?II重組，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定后獲得重組質(zhì)粒。

圖2 組成型質(zhì)粒QI-pTrc99a構(gòu)建方法Fig.2 Flow chart for the construction of the constitutive plasmid QI-pTrc99a

1.3.2 基因組編輯

本研究利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9）介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)對(duì)菌株基因組進(jìn)行改造[18]。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由pREDCas9和pGRB兩個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成。溫敏型質(zhì)粒pREDCas9主要由λ噬菌體的RED重組系統(tǒng)、Cas9蛋白表達(dá)系統(tǒng)和pGRB質(zhì)粒消除系統(tǒng)組成，含奇霉素抗性（工作質(zhì)量濃度100 mg/L，32 ℃）。質(zhì)粒pGRB以質(zhì)粒pUC18為骨架，由啟動(dòng)子J23100、gRNA-Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域和終止子組成，含氨芐青霉素抗性（工作質(zhì)量濃度100 mg/L，37 ℃），該質(zhì)粒是針對(duì)某一靶位點(diǎn)利用gRNA設(shè)計(jì)工具CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/）選定gRNA序列后設(shè)計(jì)出的重組質(zhì)粒。pGRB能夠轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的gRNA，與pREDCas9表達(dá)出的Cas9蛋白結(jié)合后形成復(fù)合物并識(shí)別到靶位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)該靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂；此時(shí)，外源提供的根據(jù)待編輯基因設(shè)計(jì)出的重疊DNA片段（整合片段：上游同源臂-待整合基因-下游同源臂；敲除片段：上游同源臂-下游同源臂）可在重組酶作用下，與斷裂的雙鏈DNA發(fā)生同源重組，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因組改造。

通過紫外分光光度計(jì)（OD600nm）測(cè)定菌體生物量。通過SBA生物傳感儀測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度。通過高效液相色譜儀檢測(cè)β-NMN質(zhì)量濃度，色譜條件：色譜柱為Hypersil? ODS-2 C18（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為95% 20 mmol/L乙酸銨∶5%乙腈（V/V），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相總流速1 mL/min。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

課堂教學(xué)中教師可以利用平臺(tái)針對(duì)某個(gè)知識(shí)點(diǎn)或者一節(jié)課的所有知識(shí)點(diǎn)，做一次課堂檢測(cè)，由于平臺(tái)可以同步看到學(xué)生的答題情況，匯總統(tǒng)計(jì)答題的結(jié)果，這樣教師就能夠根據(jù)隨堂練習(xí)的反饋結(jié)果及時(shí)把握學(xué)生的掌握情況，及時(shí)對(duì)學(xué)生進(jìn)行分層式的個(gè)性化指導(dǎo)，也便于后面教學(xué)內(nèi)容的調(diào)整。

重組菌株通過試管斜面培養(yǎng)基傳代活化后，接種至30 mL種子培養(yǎng)基中（500 mL圓底瓶），37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h后，按10%接種量轉(zhuǎn)接至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL擋板瓶），37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。發(fā)酵期間根據(jù)酸堿指示劑苯酚紅的變色情況，適當(dāng)補(bǔ)加氨水或60 g/100 mL葡萄糖溶液。發(fā)酵培養(yǎng)基初始時(shí)添加0.1 g/L NAM，此后通過流加的方式保證發(fā)酵結(jié)束時(shí)共加入0.4 g/L NAM。

1.3.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

重組菌株通過茄型瓶斜面培養(yǎng)基傳代活化后，接種至2 L種子培養(yǎng)基（5 L發(fā)酵罐）中，培養(yǎng)期間通過流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 7.0左右，37 ℃培養(yǎng)，維持溶氧在20%～40%之間，通風(fēng)量在2～4 L/h之間，攪拌轉(zhuǎn)速在200～700 r/min之間。當(dāng)OD600nm達(dá)到10～20時(shí)，按15%的接種量接入3 L發(fā)酵培養(yǎng)基（5 L發(fā)酵罐）中，維持發(fā)酵液pH 7.0左右，37 ℃培養(yǎng)，溶氧在10%～35%之間，通風(fēng)量在2～4 L/h之間，攪拌轉(zhuǎn)速400～900 r/min，發(fā)酵周期38 h。當(dāng)罐內(nèi)的葡萄糖耗盡時(shí)，開始以一定速率流加80 g/100 mL的葡萄糖溶液，維持罐內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～5 g/L之間。發(fā)酵培養(yǎng)基初始時(shí)添加0.5 g/L NAM，此后以一定速率流加NAM，保證在發(fā)酵結(jié)束時(shí)共加入5 g/L NAM。

將超聲技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)阻滯進(jìn)程中，能促使周圍神經(jīng)可視化，進(jìn)而促使神經(jīng)阻滯的有效率相應(yīng)提升。當(dāng)下，超聲技術(shù)在神經(jīng)阻滯麻醉應(yīng)用范疇不斷拓展，其具有二維分辨率高的優(yōu)勢(shì)，多普勒效應(yīng)能檢測(cè)出低血流信號(hào)，超聲技術(shù)聯(lián)合神經(jīng)刺激儀進(jìn)行神經(jīng)阻滯，能夠協(xié)助麻醉醫(yī)生全過程均能看到針的移動(dòng)情況，觀察麻醉的散布情況，有助于明顯提升阻滯神經(jīng)定位的精確性，對(duì)血管、神經(jīng)基本不產(chǎn)生影響，術(shù)前準(zhǔn)備時(shí)間較為短暫。對(duì)于股神經(jīng)，閉孔神經(jīng)等位置相對(duì)較淺的神經(jīng)，若單獨(dú)使用神經(jīng)刺激儀，那么神經(jīng)具體位置確認(rèn)難度較大、阻滯成功率較低、術(shù)前準(zhǔn)備時(shí)間較長(zhǎng)、神經(jīng)阻滯見效時(shí)間較長(zhǎng)且并發(fā)癥發(fā)生率較高[2]。

1.3.5 檢測(cè)與分析

滑坡穩(wěn)定性計(jì)算及滑坡推力計(jì)算，其目的是為滑坡在不同工況條件下的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)及滑坡防治提供設(shè)計(jì)依據(jù)。計(jì)算荷載考慮滑體自重、地表荷載、暴雨、動(dòng)荷載、地震等因素。按《滑坡防治工程設(shè)計(jì)與施工技術(shù)規(guī)范》(DZ/T0219-2006)，滑坡治理根據(jù)其危害對(duì)象程度及潛在經(jīng)濟(jì)損失，滑坡穩(wěn)定性計(jì)算工況、荷載組合及抗滑穩(wěn)定安全系數(shù)見表3。

在重組菌株構(gòu)建時(shí)，同時(shí)將pGRB質(zhì)粒和重疊DNA片段電轉(zhuǎn)至已導(dǎo)入pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇2 h后涂布于含100 mg/L氨芐青霉素和奇霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含10 mmol/L阿拉伯糖和奇霉素的LB液體培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)pREDCas9中的pGRB質(zhì)粒消除系統(tǒng)表達(dá)，通過菌落PCR篩選已丟失pGRB的陽性菌株轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)12 h，消除溫敏性質(zhì)粒pREDCas9，最終經(jīng)過菌落PCR篩選出無質(zhì)粒的重組菌株。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖分析，使用Adobe Photoshop 2020和Visio 2019對(duì)圖片進(jìn)行處理組合和繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 減少底盤細(xì)胞對(duì)前體和產(chǎn)物的額外消耗

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母粉6 g/L，無水檸檬酸2 g/L，甲硫氨酸0.3 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO420 mg/L，(NH4)2SO42 g/L，VB1、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，微量元素2 mL/L，pH 7.0～7.5。

目標(biāo)產(chǎn)物β-NMN作為NAD＋的直接前體物，在大腸桿菌中的代謝較為活躍，因此需要對(duì)其支路代謝途徑進(jìn)行改造。β-NMN的支路代謝主要分為3 種（表3），一是通過pncC編碼的煙酰胺核苷酸酰胺水解酶轉(zhuǎn)化為NaMN[20]；二是通過nadR編碼的煙酰胺核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為NAD＋[21]；三是通過一系列的核苷酸酶降解為NR。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與β-NMN降解相關(guān)核苷酸酶基因包括ushA、aphA、nagD、yjjG、surE[22-26]等。

表3 大腸桿菌中β-NMN的主要支路代謝Table 3 Major β-NMN shunt metabolic pathways in E.coli

在工程菌N-1的基礎(chǔ)上，對(duì)β-NMN支路代謝途徑中的酶進(jìn)行逐一敲除，獲得工程菌N-2～N-8。將上述菌株放到含有0.5 g/Lβ-NMN的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，考察改造后細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的消耗情況，結(jié)果如圖3所示。敲除pncC和nadR基因并不會(huì)減少細(xì)胞對(duì)β-NMN的降解，說明β-NMN向NaMN和NAD＋的支路代謝并不活躍。敲除ushA后，底盤細(xì)胞對(duì)β-NMN的消耗量從100%顯著降低至25.16%，說明大腸桿菌內(nèi)β-NMN向NR的轉(zhuǎn)化是β-NMN的主要支路代謝。繼續(xù)敲除其他核苷酸酶基因aphA、nagD、yjjG和surE后，底盤細(xì)胞對(duì)β-NMN的消耗量持續(xù)降低。最終，工程菌N-8對(duì)產(chǎn)物β-NMN的消耗量?jī)H為4.57%，生物量與N-1相比下降了8.84%。通過上述一系列的基因改造，獲得了能夠用于β-NMN積累的優(yōu)良底盤。

圖3 底盤細(xì)胞改造對(duì)產(chǎn)物β-NMN消耗以及菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of chassis cell modification on β-NMN consumption and cell growth

2.2 構(gòu)建β-NMN的合成代謝途徑

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

彈幕(Barrage)顧名思義是子彈多而形成的幕布，在軍事上是指大量密集的炮火攻擊。在彈幕視頻中指的是大量的評(píng)論在屏幕上劃過，像是幕布一樣。最早也是最著名的彈幕網(wǎng)站是日本的Niconico動(dòng)畫網(wǎng)站，其最大特點(diǎn)是實(shí)時(shí)彈幕發(fā)送，發(fā)送后3s就顯示在屏幕上，使得觀眾有一起參與的感覺，取得了空前成功。國(guó)內(nèi)先引進(jìn)彈幕技術(shù)的是Acfun彈幕視頻網(wǎng)和Bilibili動(dòng)漫網(wǎng)站，隨后主流視頻網(wǎng)站如土豆、愛奇藝和優(yōu)酷等也相繼引入彈幕技術(shù)。這種實(shí)時(shí)交流，產(chǎn)生共鳴的體驗(yàn)感，越來越受到各個(gè)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

PRPP是β-NMN合成的重要前體，主要是由Prs催化ATP上的焦磷酸基轉(zhuǎn)移到5-磷酸核糖的1-羥基位而產(chǎn)生[28]。為了強(qiáng)化大腸桿菌中PRPP的合成代謝，首先將內(nèi)源的prsA基因整合至工程菌N-10基因組gapC位點(diǎn)上，并使用其內(nèi)源Pprs啟動(dòng)子控制其表達(dá)，獲得工程菌N-11。調(diào)節(jié)基因purR對(duì)大腸桿菌嘌呤生物合成途徑所有結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)起著負(fù)調(diào)控作用[29]。因此本研究敲除工程菌N-11的purR基因以促進(jìn)prsA基因的表達(dá)，獲得工程菌N-12。

在上述代謝改造的基礎(chǔ)上，將使用組成型質(zhì)粒（1.3.1節(jié)）表達(dá)Chitinphaga pinensis來源的Nampt，保證關(guān)鍵酶的拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒QI-pTrc99a-namptCp分別轉(zhuǎn)化至N-9～N-12菌株，獲得工程菌N-9’～N-12’，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)試。發(fā)酵過程中添加0.5 g/L前體NAM，發(fā)酵周期24 h，結(jié)果如圖4所示。引入BcNiaP菌株N-9’的發(fā)酵液中只檢測(cè)到0.01 g/L的β-NMN，而引入BmPnuC后，菌株N-10’能夠產(chǎn)生0.16 g/L的β-NMN，說明大腸桿菌自身并不存在β-NMN外排系統(tǒng)，必須依賴外源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BmPnuC才能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的胞外積累。強(qiáng)化prs基因表達(dá)以及敲除purR基因能夠使β-NMN的產(chǎn)量提高1.1 倍（0.34 g/L），說明上述基因改造能夠有效提高PRPP供應(yīng)，為β-NMN合成提供更充足的前體。但是，prs基因過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生物量下降7.8%。

圖4 β-NMN的合成代謝途徑構(gòu)建對(duì)菌株生長(zhǎng)和β-NMN發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of the construction of β-NMN anabolic pathway on cell growth and β-NMN fermentation

2.3 篩選高活性的Nampt

Nampt是β-NMN合成的限速酶，篩選高活性的Nampt是提升β-NMN發(fā)酵產(chǎn)量的關(guān)鍵。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，挑選5 個(gè)能夠在大腸桿菌中表達(dá)的Nampt，分別來自于Chitinphaga pinensis、Comamonadaceae bacterium、Meiothermus ruber、Haemophilus ducreyi和Vibriobacteriophage KVP40[30-31]。將不同來源的nampt基因分別與組成型質(zhì)粒（1.3.1節(jié)）QI-pTrc99a連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至N-12菌株，獲得工程菌N-12′～N-16，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)試。發(fā)酵過程中添加0.5 g/L前體 NAM，發(fā)酵周期24 h，結(jié)果如圖5所示。引入VpNampt菌株N-16的β-NMN產(chǎn)量最高（0.90 g/L），但生物量最低，這可能與該酶是噬菌體來源有關(guān)。與之相比，引入CbNampt菌株N-13的β-NMN產(chǎn)量達(dá)到0.88 g/L，但生物量與N-16相比提高了1.3 倍。廖一波[32]利用分子對(duì)接手段，測(cè)定了不同來源Nampt與NAM的對(duì)接效果，發(fā)現(xiàn)CbNampt和MrNampt是細(xì)菌來源中評(píng)分最高的，但CbNampt的kcat/km值更高，達(dá)到9.86×106s－1。研究進(jìn)一步證實(shí)，Comamonadaceae bacterium來源的Nampt在大腸桿菌中的作用效果最好，能夠在保證細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)提升β-NMN的發(fā)酵產(chǎn)量。

圖5 不同來源Nampt對(duì)菌株生長(zhǎng)和β-NMN發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of Nampts from different sources on cell growth and β-NMN fermentation

2.4 加強(qiáng)PRPP供應(yīng)及產(chǎn)物外排對(duì)β-NMN的影響

根據(jù)化學(xué)計(jì)量方程，在搖瓶發(fā)酵中添加0.5 g/L前體NAM，理論上能夠獲得1.37 g/L的β-NMN。但N-13菌株搖瓶發(fā)酵只產(chǎn)生了0.88 g/L的β-NMN，為理論轉(zhuǎn)化率的64.2%。菌株N-13中關(guān)鍵酶Nampt是以質(zhì)粒形式表達(dá)的，而Prs和BmPnuC是以基因組整合方式表達(dá)，因此推測(cè)可能是前體PRPP供應(yīng)或產(chǎn)物外排不足限制了β-NMN的合成。在質(zhì)粒Z-2的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了namptCb-prsA雙基因串聯(lián)質(zhì)粒Z-6，以及namptCb-prsA-pnuCBm三基因串聯(lián)質(zhì)粒Z-7，并將其分別轉(zhuǎn)化至N-12菌株，獲得工程菌N-17和N-18。對(duì)上述菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)試，發(fā)酵過程中添加0.5 g/L前體 NAM，發(fā)酵周期24 h，結(jié)果如圖6所示。強(qiáng)化prsA基因表達(dá)后，菌株N-17的β-NMN產(chǎn)量比N-13提高了44.3%（1.27 g/L），但生物量下降了55.1%。強(qiáng)化pnuCBm基因表達(dá)后，菌株N-18的β-NMN產(chǎn)量進(jìn)一步提高，達(dá)到1.36 g/L，接近理論轉(zhuǎn)化率，但生物量比N-13下降了48.7%。發(fā)酵結(jié)果表明，加強(qiáng)PRPP供應(yīng)及產(chǎn)物外排能夠有效提高β-NMN的發(fā)酵產(chǎn)量，但相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度需要嚴(yán)格控制，減少其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)面影響。

圖6 加強(qiáng)PRPP供應(yīng)及產(chǎn)物外排對(duì)菌株生長(zhǎng)和β-NMN發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of strengthening of PRPP supply and product efflux on cell growth and β-NMN fermentation

2.5 工程菌N-18分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-NMN

為了測(cè)試菌株N-18的發(fā)酵性能，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵過程中添加5 g/L前體NAM，結(jié)果如圖7所示。4～26 h，隨著菌體生長(zhǎng)，β-NMN產(chǎn)量不斷增加，并保持較高的合成速率。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌體的攝糖速率變慢，β-NMN的合成速率有所降低。發(fā)酵36 h，β-NMN產(chǎn)量達(dá)到10.2 g/L，NAM到β-NMN的摩爾轉(zhuǎn)化率為74.5%。此外，發(fā)酵液中存在1.2 g/L的副產(chǎn)物煙酸，說明除了PncA以外，大腸桿菌內(nèi)可能存在未知的煙酰胺酶。

圖7 工程菌N-18在5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵曲線Fig.7 Time course of fed-batch fermentation of the engineered strain N-18 in a 5 L bioreactor

目前，已有一些發(fā)酵法生產(chǎn)β-NMN的報(bào)道，發(fā)酵方式主要為全細(xì)胞催化或者流加NAM發(fā)酵，但都需要在產(chǎn)酶或者發(fā)酵階段添加誘導(dǎo)劑（表4）。Huang Zhongshi等[31]證明噬菌體來源的VpNampt效果最好，強(qiáng)化PRPP供給和產(chǎn)物外排后，工程菌能夠發(fā)酵產(chǎn)生16.2 g/L的β-NMN，NAM到β-NMN的摩爾轉(zhuǎn)化率為97%，均為已有報(bào)道的最高水平。對(duì)比了不同來源的Nampt，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌來源的CbNampt效果與VpNampt相差不大，且對(duì)菌體的生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)較小。在5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵過程中，無需添加誘導(dǎo)劑即可實(shí)現(xiàn)β-NMN發(fā)酵生產(chǎn)，菌體生物量較高。但是，由于副產(chǎn)物煙酸的產(chǎn)生，限制了底物向β-NMN的轉(zhuǎn)化。值得注意的是，在搖瓶發(fā)酵中并沒有檢測(cè)到煙酸積累，煙酰胺幾乎完全轉(zhuǎn)化為β-NMN。但在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，當(dāng)菌體濃度較高時(shí)，煙酸開始形成，β-NMN生產(chǎn)速率顯著下降。根據(jù)上述現(xiàn)象，后續(xù)可以從代謝工程和發(fā)酵工程角度提升工程菌的發(fā)酵水平：一是通過啟動(dòng)子和RBS序列優(yōu)化Nampt、Prs和BmPnuC的表達(dá)水平，并利用生物信息學(xué)篩選未知的煙酰胺酶；二是調(diào)整底物流加方式和流加時(shí)間，防止過量補(bǔ)加NAM；三是調(diào)整補(bǔ)糖速率和溶氧水平，防止菌體的過度生長(zhǎng)，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

表4 不同β-NMN發(fā)酵方法對(duì)比Table 4 Comparison of β-NMN production using different fermentation methods

3 結(jié)論

研究以野生型大腸桿菌為底盤細(xì)胞，通過系統(tǒng)代謝工程改造，實(shí)現(xiàn)了β-NMN的發(fā)酵生產(chǎn)。主要策略包括：1）對(duì)NAM和β-NMN的支路代謝涉及的8 個(gè)酶進(jìn)行失活，減少底盤細(xì)胞對(duì)前體和產(chǎn)物的額外消耗；2）引入外源NAM和β-NMN的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及Nampt，增強(qiáng)胞內(nèi)PRPP供給，實(shí)現(xiàn)了β-NMN的初步積累（0.34 g/L）；3）比較篩選了酶活力較高且對(duì)底盤細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)較小的Nampt，通過進(jìn)一步優(yōu)化PRPP供應(yīng)和產(chǎn)物外排，β-NMN的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量提高至1.36 g/L。工程菌N-18于5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵38 h，β-NMN產(chǎn)量可達(dá)10.2 g/L，NAM到β-NMN的摩爾轉(zhuǎn)化率為74.5%。研究構(gòu)建的β-NMN發(fā)酵菌株具有遺傳背景清晰、無營(yíng)養(yǎng)缺陷、無需誘導(dǎo)等優(yōu)勢(shì)，可為β-NMN的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)及菌株改良提供理論依據(jù)。