基于非靶向代謝組學(xué)研究呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦體內(nèi)氨基脲的代謝

陳霞霞，張 祎，項(xiàng)德勝，胡 詩(shī)，陳雪昌，張小軍,*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；3.浙江大洋興和食品有限公司，浙江 舟山 316014）

呋喃西林是一種價(jià)格低廉的抗生素，由于其具有潛在的致畸性、誘變性、致癌性[1-3]，目前已被列為三類(lèi)致癌物，禁止在水產(chǎn)領(lǐng)域使用[4]。而氨基脲是呋喃西林的代謝殘留標(biāo)志物，在進(jìn)入代謝后極易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的產(chǎn)物殘留在體內(nèi)[5-6]。目前歐盟、美國(guó)和我國(guó)均以氨基脲作為標(biāo)志殘留物，對(duì)呋喃西林進(jìn)行殘留檢測(cè)和監(jiān)控[3,7-8]。2003年，歐盟通過(guò)了2003/181/EC委員會(huì)決議，建立了水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物氨基脲的各種檢測(cè)方法，并規(guī)定檢測(cè)限為1 μg/kg[9]。然而據(jù)報(bào)道，大量未使用抗生素的貿(mào)易產(chǎn)品中也檢測(cè)到氨基脲[10-12]，這使各研究對(duì)氨基脲的來(lái)源重新進(jìn)行探索，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為部分水產(chǎn)品中有內(nèi)源性氨基脲的存在，尤其是甲殼類(lèi)水產(chǎn)品[13-14]。2001年，Christof等[15]得出羅氏沼蝦中確實(shí)存在內(nèi)源性氨基脲，后續(xù)又對(duì)不同種類(lèi)甲殼類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中內(nèi)源性氨基脲的存在。

基于氨基脲對(duì)甲殼類(lèi)水產(chǎn)品的毒理作用，必須從不同角度去探討氨基脲的產(chǎn)生來(lái)源。而代謝組學(xué)在近年來(lái)顯示出巨大的潛力，其為生物標(biāo)志物的鑒定、毒理學(xué)機(jī)制和疾病的治療提供了新的技術(shù)手段[19]。Gu Chenhui等[20]通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)大鼠進(jìn)行研究，揭示藥物二丸妙方對(duì)高尿酸血癥的作用機(jī)制。Amoah等[21]通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù)鑒定了蓖麻粕誘導(dǎo)幼年雜交石斑魚(yú)體內(nèi)腸炎的潛在生物標(biāo)志物。Muhammad等[22]通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究了氟化物對(duì)人體的潛在危害，通過(guò)分析氟化物在人血清中的代謝，發(fā)現(xiàn)氟化物代謝的相關(guān)途徑及代謝物質(zhì)?？梢?jiàn)，代謝組學(xué)已在食品藥品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，借助該技術(shù)有助于探究氨基脲在甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中的產(chǎn)生及代謝途徑。

目前關(guān)于甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中氨基脲的產(chǎn)生機(jī)制及轉(zhuǎn)化途徑方面的研究仍較少，雖然多數(shù)研究均將氨基脲指向精氨酸，但仍缺乏直接相關(guān)的體內(nèi)轉(zhuǎn)化途徑，并且氨基脲在甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中的代謝機(jī)制也尚未被闡明。因此，本研究以呋喃西林作為目標(biāo)脅迫污染物，克氏原螯蝦為脅迫主體，開(kāi)展外源污染物呋喃西林及其代謝產(chǎn)物氨基脲的蓄積實(shí)驗(yàn)及代謝組學(xué)研究，以期為氨基脲后續(xù)研究提供可能的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活克氏原螯蝦于2022年7月一批次購(gòu)買(mǎi)于浙江舟山豐茂菜場(chǎng)。從中挑選出附肢完整，大小一致的克氏原螯蝦150 只，分別暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖箱中。實(shí)驗(yàn)前對(duì)養(yǎng)殖水體及飼料進(jìn)行呋喃西林原藥及氨基脲檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)呋喃西林及氨基脲干擾。在20～25 ℃室溫養(yǎng)殖1 周，養(yǎng)殖期間持續(xù)充氧。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用淡水養(yǎng)殖，每日于8:00、17:00統(tǒng)一進(jìn)行喂食，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前禁食2 d，并去除死蝦。

呋喃西林（純度＞98.5%）南昌白云藥業(yè)有限公司；同位素標(biāo)記的氨基脲（SEM·HCl-13C-15N2）標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸氨基脲標(biāo)準(zhǔn)品、2-硝基苯甲醛 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；醋酸銨（優(yōu)級(jí)純）、無(wú)水磷酸氫二鉀、偏磷酸、鹽酸、甲酸、?；撬?、次?；撬?、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)）、乙酸乙酯 德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N-EVAP-11634氮?dú)獯蹈蓛x 美國(guó)Organomation公司；Heraeus Fresco17離心機(jī)、UltiMate 3000超高液相色譜儀、Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW電子天平 德國(guó)Sartorius公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱、HLB固相萃取柱 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 脅迫實(shí)驗(yàn)

因甲殼類(lèi)動(dòng)物的特殊性，通過(guò)口服、注射等方式難以達(dá)到預(yù)期的給藥效果，實(shí)驗(yàn)采取浸泡法測(cè)定短時(shí)間內(nèi)原藥及其代謝物在克氏原螯蝦體內(nèi)的變化情況。實(shí)驗(yàn)前將已禁食的克氏原螯蝦隨機(jī)均分為6 組，每組20 只，隨機(jī)設(shè)定為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不添加呋喃西林，實(shí)驗(yàn)組采用10 mg/L的呋喃西林溶液浸泡克氏原螯蝦。實(shí)驗(yàn)組分別于藥物浸泡4、8、16、24、48 h采集樣品，每次隨機(jī)采集12 只，用水沖洗干凈體表，取非表皮的腹部肌肉。樣品分成2 份，一份迅速放入液氮中保存，用于代謝組學(xué)分析。另一份放入－60 ℃冷凍保存，用于測(cè)定呋喃西林和其代謝物氨基脲濃度變化。

1.3.2 呋喃西林原藥檢測(cè)

參照DB37/T 1779—2011《水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類(lèi)原藥殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。色譜條件：色譜柱ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子模式，電離電壓2 500 kV，霧化溫度350 ℃，霧化氣流速700 L/h；碰撞能量10 eV，掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；m/z197.1＞80.1，m/z197.1＞124.112 4。

1.3.3 代謝物氨基脲檢測(cè)

參照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—1—2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。樣品水解及衍生化：分別稱取2 g蝦肉于50 mL離心管中，加入0.05 mL SEM·HCl-13C-15N2內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s后，在恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。樣品的提取：加入1 mol/L磷酸氫二鉀將混合物pH值調(diào)整至7～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，均勻混合。6 000 r/min離心10 min，吸取上清液，為充分提取再次重復(fù)上述操作，合并上清液在40 ℃氮吹，加入2 mmol/L乙酸銨溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）復(fù)溶，過(guò)0.45 μm濾膜待測(cè)。

色譜條件：色譜柱采用ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣體積5 μL；樣品室溫度10 ℃；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的2 mmoL/L乙酸銨溶液，B為甲醇。質(zhì)譜條件：電離模式為ESI＋，噴霧電壓4 100 V，輔助氣流量3 L/min，離子傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)，同位素標(biāo)記的氨基脲衍生物為m/z212.1＞192.1（碰撞能量10 eV）；氨基脲衍生物為m/z209.1＞192.1（碰撞能量12 eV）；m/z209.1＞166.1（碰撞能量12 eV）。

1.3.4 代謝組學(xué)檢測(cè)

1.3.4.1 樣品前處理

將脅迫0、4、24 h的肌肉樣品置于冰上解凍，取20 mg樣品加入120 μL 50%甲醇溶液，渦旋1 min后，在室溫孵育10 min；然后將提取混合物在－20 ℃保存過(guò)夜。4 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，－80 ℃保存待測(cè)。

1.3.4.2 超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive-MS）檢測(cè)條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫條件：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～7 min，95%～0% A、5%～100% B；7～8 min，0% A、100% B；8～8.1 min，0%～95% A、100%～5% B；8.1～10 min，95% A、5% B。每個(gè)樣品的注射量為4 μL。

質(zhì)譜條件：ESI＋，采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式掃描，掃描范圍m/z70～1 050，以分辨率70 000收集前體光譜，最大注入時(shí)間100 ms；以分辨率17 500收集碎片光譜，最大進(jìn)樣時(shí)間80 ms。

1.3.5 模擬氨基酸代謝途徑下氨基脲檢測(cè)

采用H2O2、VC、FeCl3組成的模擬氧化體系[23]，結(jié)合尿素模擬蝦體內(nèi)氨基酸代謝。分別配制0.1 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L VC和100 mmol/L H2O2的溶液于容量瓶中備用。分別稱取0.4 g牛磺酸、次?；撬?、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺于50 mL離心管中，分別加入0.4 g尿素，用10 mL水充分溶解，然后分別加入200 μL 0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L VC溶液，100 μL 100 mmol/L H2O2溶液氧化3 h。氧化結(jié)束后，分別加入0.05 mL SEM·HCl-13C-15N2內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s后，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。后續(xù)操作同1.3.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用人類(lèi)代謝數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物注釋，解釋代謝物的物理化學(xué)性質(zhì)、生物功能。利用metaX軟件對(duì)代謝物進(jìn)行定量和差異代謝物篩選。采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）代謝物的變化。基于t檢驗(yàn)檢測(cè)2 個(gè)表型之間代謝物水平的差異顯著性。通過(guò)metaX進(jìn)行監(jiān)督PLS-DA，以區(qū)分組間的不同變量。差異代謝物的篩選設(shè)定閾值為變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1.0、P＜0.05，隨后將差異代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 呋喃西林及氨基脲在克氏原螯蝦肌肉組織中的質(zhì)量濃度變化

如圖1所示，由于呋喃西林在進(jìn)入蝦體內(nèi)后代謝十分迅速，隨著呋喃西林脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基脲在克氏原螯蝦肌肉中的殘留量逐漸增加，氨基脲質(zhì)量濃度從（6.91±1.25）ng/mL上升到（214.98±4.59）ng/mL。但呋喃西林的含量則呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢(shì)。4 h后，呋喃西林質(zhì)量濃度為（159.35±28.96）ng/mL，這一變化可能是由于4 h時(shí)呋喃西林進(jìn)入蝦體內(nèi)，隨后呋喃西林開(kāi)始轉(zhuǎn)化成氨基脲，導(dǎo)致8 h時(shí)呋喃西林含量降低而氨基脲含量升高，至16 h時(shí)氨基脲和呋喃西林之間的轉(zhuǎn)化趨于穩(wěn)定，24 h時(shí)同步積累。徐英江等[24]對(duì)櫛孔扇貝體內(nèi)氨基脲的生物富集進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨海水中氨基脲濃度的增加，扇貝體內(nèi)氨基脲的積蓄量也逐漸增加，且各組織中氨基脲含量與曝污濃度呈正相關(guān)。任憲云[25]研究多環(huán)芳烴苯并芘對(duì)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)積蓄毒性效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦各組織中苯并芘的積累量隨海水中苯并芘濃度以及曝露時(shí)間的變化而變化，脅迫1 d的鰓和肝胰腺中苯并芘的檢出量增多，在3 d時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，后續(xù)又呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。這一趨勢(shì)與本研究中克氏原螯蝦經(jīng)呋喃西林脅迫后的積蓄趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)先增后減再升高的趨勢(shì)。對(duì)此，猜測(cè)是由于呋喃西林在甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中的代謝十分迅速，進(jìn)入蝦肌肉組織4 h后就開(kāi)始轉(zhuǎn)化生成氨基脲，隨后氨基脲的檢測(cè)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。因此，4 h可能是呋喃西林在蝦體內(nèi)代謝旺盛的一個(gè)重要時(shí)間點(diǎn)，基于此，后續(xù)的代謝組學(xué)分析選取0、4 h及24 h的肌肉組織樣品進(jìn)行研究。

圖1 呋喃西林原藥及代謝物氨基脲不同時(shí)間在克氏原螯蝦肌肉組織中的積蓄情況Fig.1 Accumulation of nitrofurazone and semicarbazide in muscle tissue of Procambarus clarkii at different time points

2.2 PLS-DA

PLS-DA是通過(guò)偏最小二乘回歸建立的代謝物表達(dá)量與樣本類(lèi)別之間的關(guān)系模型，在有監(jiān)督模式下進(jìn)行樣本分析，實(shí)現(xiàn)樣本間更有效地分離[26]。在構(gòu)建的PLS-DA模型中，=0.781、=0.93、Q2=0.487和R2=0.878，表現(xiàn)出良好的擬合和預(yù)測(cè)能力（圖2）。所有組間在進(jìn)行200 次交叉驗(yàn)證下表現(xiàn)出Q2＜0，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合的情況，差異代謝物分析比較準(zhǔn)確。

圖2 正離子模式下PLS-DA得分圖（A～C）及置換檢驗(yàn)圖（D～F）Fig.2 PLS-DA score plot (A-C) and permutation test (D-F) in the positive ion mode

2.3 代謝差異物質(zhì)鑒定

為研究呋喃西林組與對(duì)照組的差異，通PLS-DA并結(jié)合t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)的代謝物。找到同時(shí)滿足P＜0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于2或小于0.5，且VIP＞1的特征代謝物，即是呋喃西林誘導(dǎo)代謝紊亂和毒性機(jī)制的相關(guān)標(biāo)志物。4 h組與對(duì)照（0 h）組相比，在肌肉組織中共發(fā)現(xiàn)166 種代謝物發(fā)生顯著變化（P＜0.05），F(xiàn)C為0.18～24.61，其中99 種代謝物上調(diào)。4 h組與24 h組相比，肌肉組織中共存在249 種差異代謝物（P＜0.05），F(xiàn)C為0.03～53.08，其中109 種代謝物上調(diào)。24 h組與0 h組相比，差異代謝物數(shù)量明顯較少，共55 種（P＜0.05），其中22 種代謝物上調(diào)。蔣原等[27]研究硝基呋喃類(lèi)藥物在克氏原螯蝦組織中的消除規(guī)律發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL呋喃西林給藥1 h后即可檢測(cè)到400 μg/kg以上的代謝物氨基脲，說(shuō)明克氏原螯蝦在脅迫狀態(tài)下1 h內(nèi)就發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化。此外，尤宏?duì)幍萚28]對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)進(jìn)行短途運(yùn)輸脅迫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脅迫對(duì)其生理機(jī)能不會(huì)產(chǎn)生持久性影響，在受到脅迫后168 h血清部分生理指標(biāo)即趨于脅迫前水平，說(shuō)明水產(chǎn)品在受到外界脅迫后會(huì)首先發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，此后在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)恢復(fù)到正常。因此，0 h vs.4 h和4 vs.24 h差異代謝物數(shù)量較多的原因可能是呋喃西林在進(jìn)入蝦體內(nèi)后迅速代謝，短時(shí)間內(nèi)體內(nèi)積蓄的代謝物增多，但至24 h，呋喃西林與其代謝物之間的轉(zhuǎn)化趨于動(dòng)態(tài)平衡，蝦中部分循環(huán)機(jī)制已適應(yīng)當(dāng)前生存環(huán)境開(kāi)始趨于穩(wěn)定，但與未受呋喃西林脅迫的0 h樣品相比體內(nèi)代謝物質(zhì)已發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此仍存在一定差異物質(zhì)。通過(guò)HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)在0 h vs.4 h和4 h vs.24 h這兩組中共注釋到52 種差異代謝物質(zhì)。0 h vs.4 h中鑒定到23 種代謝物，其中14 種物質(zhì)上調(diào)，9 種下調(diào)；4 h vs.24 h中有39 種代謝物，其中22 種物質(zhì)上調(diào)，17 種下調(diào)。這些代謝物分別屬于脂質(zhì)和類(lèi)脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物、核苷、核苷酸和類(lèi)似物、有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)氧化合物、苯類(lèi)、均相非金屬化合物及苯丙烷和聚酮化合物。圖3直觀地表達(dá)了不同時(shí)間樣品中代謝物的差異，圖中每個(gè)點(diǎn)代表一種代謝物?？梢园l(fā)現(xiàn)4～24 h的差異代謝物最多，其中表達(dá)上調(diào)的差異代謝物有22 種，包括精氨琥珀酸、L-谷氨酸、甘氨酰亮氨酸等，表達(dá)下調(diào)的有17 種，包括1-酮糖、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、?；撬帷⒋闻；撬岬?。

圖3 不同時(shí)間克氏原螯蝦肌肉組織中呋喃西林差異代謝物火山圖Fig.3 Volcanic map of differential metabolites from nitrofurazone in muscle tissue of P.clarkii at different time points

2.4 代謝通路分析

為進(jìn)一步確定呋喃西林脅迫下蝦體內(nèi)相關(guān)代謝通路的變化，結(jié)合差異物質(zhì)分析及生物體實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，使用MetaboAnalyst 5.0對(duì)4 h vs.24 h差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。根據(jù)VIP＞1、P＜0.05進(jìn)行篩選，與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些代謝差異物質(zhì)主要富集在23 條代謝通路中（圖4）。

圖4 4 h vs.24 h克氏原螯蝦肌肉組織中呋喃西林代謝通路富集分析Fig.4 Metabolite pathway enrichment analysis of nitrofurazone in muscle tissue of P.clarkii at 4 vs.24 hours

如圖5和表1所示，依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，以－lgP＞0.5且影響因子大于0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)主要有4 條代謝通路受影響，分別為?；撬岷痛闻；撬岽x（影響因子0.714 3），精氨酸生物合成（影響因子0.233 5），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（影響因子0.218 8）及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（影響因子0.5）。

表1 代謝通路分析結(jié)果Table 1 Results of metabolic pathway analysis

圖5 呋喃西林在克氏原螯蝦體內(nèi)的代謝通路拓?fù)浞治鰵馀輬DFig.5 Topological analysis of metabolic pathways significantly enriched with differential metabolites of nitrofurazone

如表2所示，呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織中?；撬峒按闻；撬岬暮匡@著下降。牛磺酸是一種具有多種細(xì)胞保護(hù)活性的β-氨基酸，屬于巰基氨基酸和半胱氨酸的衍生物，廣泛分布于海洋動(dòng)物的組織和細(xì)胞中，是一種條件必需氨基酸[29]。研究表明?；撬嵩诩?xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化保護(hù)機(jī)制，并且具有抗炎作用。次?；撬崾桥；撬岷蛠喤；撬岽x途徑中半胱胺雙加氧酶的產(chǎn)物，在生物系統(tǒng)中次?；撬嵬瑯幽軌虬l(fā)揮抗氧化作用[30-31]。本研究中?；撬岷痛闻；撬岷烤档?，說(shuō)明蝦在受到呋喃西林脅迫后機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體自身的抗氧化活性下降。Tian Xiuhui等[32]研究表明日本刺參暴露于氨基脲后會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，肌肉及腸道組織中的超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活性發(fā)生變化，均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。?；撬峥梢苑乐箍寡趸傅膿p傷從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示?；撬嵩谠撏分惺艿揭种?，提示蝦在受到脅迫后產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

表2 4 h vs.24 h差異代謝物鑒定結(jié)果Table 2 Identification of differential metabolites at 4 vs.24 hours

在本研究中，呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織中精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑發(fā)生變化。研究表明，生物體在應(yīng)對(duì)外界脅迫時(shí)，可通過(guò)提高自身氨基酸水平從而為機(jī)體供能[33-34]。呋喃西林脅迫誘導(dǎo)調(diào)節(jié)谷氨酸、精氨琥珀酸、5-羥基-L-色氨酸、甘氨酰亮氨酸、丙氨酰絲氨酸及酪氨酰酪氨酸及其代謝物的水平，說(shuō)明呋喃西林脅迫下蝦肌肉組織的能量代謝發(fā)生紊亂。在精氨酸生物合成途徑中，L-谷氨酸及精氨琥珀酸顯著上調(diào)，谷氨酸是動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的快速興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，說(shuō)明在短時(shí)脅迫條件下，蝦體內(nèi)釋放大量神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝。內(nèi)源性氨基脲與精氨酸有一定關(guān)聯(lián)性，Yu Wenlong等[17]對(duì)凡納濱對(duì)蝦全生長(zhǎng)周期中的氨基酸進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與氨基脲相關(guān)性最強(qiáng)的氨基酸為精氨酸。精氨琥珀酸作為精氨酸的前體物質(zhì)，在受到呋喃西林脅迫后其量顯著上升，進(jìn)一步影響尿素循環(huán)中其他代謝物。

2.5 模擬氨基酸代謝途徑下氨基脲含量變化

根據(jù)代謝組學(xué)通路分析可知，呋喃西林的代謝涉及?；撬峒按闻；撬岽x，精氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺代謝以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑。氨基酸代謝過(guò)程中包括尿素循環(huán)這一過(guò)程，并且尿素循環(huán)與氨基酸之間關(guān)系密切，如精氨酸直接參與尿素循環(huán)[35]。氨基酸的一般代謝均包括脫氨基、氮代謝過(guò)程，而尿素循環(huán)是主要通過(guò)排泄氮以維持生命活動(dòng)的一種代謝方式，因此在氨基酸代謝過(guò)程中離不開(kāi)尿素的參與[36]。此外，由于蝦類(lèi)中還天然存在H2O2[17]，因此氧化性也是呋喃西林代謝途徑中必須考慮的因素。為確定與這些通路相關(guān)的氨基酸與代謝物氨基脲生成之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬生物代謝進(jìn)行驗(yàn)證。如圖6所示，氨基酸與尿素結(jié)合后經(jīng)H2O2氧化體系處理，精氨酸、丙氨酸、?；撬?、次牛磺酸、天冬氨酸及D-谷氨酰胺代謝后均不同程度檢出氨基脲的存在。其中，牛磺酸和丙氨酸的氨基脲產(chǎn)生量最高，分別達(dá)到（72.05±6.5）ng/mL和（59.08±0.10）ng/mL。其次是精氨酸、D-谷氨酰胺，檢測(cè)量分別為（7.73±1.55）、（7.46±0.11）ng/mL。以上結(jié)果表明，受影響代謝通路中相關(guān)的氨基酸在尿素及氧化條件下能夠產(chǎn)生氨基脲，表明氨基酸在蝦生物體循環(huán)過(guò)程中可能會(huì)轉(zhuǎn)化為氨基脲。代謝通路中?；撬?、丙氨酸、精氨酸和D-谷氨酰胺4 種物質(zhì)可能是產(chǎn)生氨基脲的關(guān)鍵中間體。這一結(jié)果與代謝組學(xué)具有一致性，說(shuō)明蝦體內(nèi)氨基脲的檢出與氨基酸代謝途徑關(guān)系密切。

圖6 模擬條件下與代謝組學(xué)相關(guān)氨基酸的氨基脲轉(zhuǎn)化情況Fig.6 Conversion of amino acids associated with metabolomics into semicarbazide under simulated conditions

3 結(jié)論

采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并通過(guò)體外模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了與代謝通路相關(guān)物質(zhì)和氨基脲產(chǎn)生之間的聯(lián)系。結(jié)果表明，在不同脅迫時(shí)間下，氨基脲及呋喃西林在肌肉組織中的含量具有顯著差異，呋喃西林脅迫影響克氏原螯蝦的?；撬峒按闻；撬岽x和氨基酸代謝途徑。通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，精氨酸、丙氨酸、?；撬?、次?；撬帷⑻於彼峒癉-谷氨酰胺在尿素結(jié)合下氧化后能夠產(chǎn)生氨基脲，證實(shí)了代謝組學(xué)中的結(jié)果。在應(yīng)對(duì)呋喃西林抗生素時(shí)，動(dòng)物機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，使自身的抗氧化能力下降。與此同時(shí)，脅迫后蝦的能量代謝紊亂，氨基酸水平發(fā)生變化。本研究結(jié)果為呋喃西林代謝物氨基脲在甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中的研究提供了一定的方向及理論依據(jù)。