吳海玥,閆忠心,任海佳,楊啟霞,郭婭慧

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016)

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1],其主要的代謝物為乳酸,它可以將碳水化合物發(fā)酵成乳酸,是一類微生物的統(tǒng)稱[2]。乳酸菌的分布比較廣泛,在所有動植物及微生物中都能找到它,肉、奶及蔬菜等食品及其加工制品中也有乳酸菌存在[3]。傳統(tǒng)發(fā)酵制備的酸奶不僅營養(yǎng)豐富,具備增強人體免疫力的功效,還可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,緩解乳糖不耐受引起的腹脹、腹瀉等癥狀,調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng),緩解神經(jīng)緊張,防止骨質(zhì)疏松及有效地降低血液中的膽固醇含量等[4-9]。

青海省擁有豐富的牦牛奶源。牦牛乳的特性與高寒地區(qū)的自然環(huán)境及牧區(qū)牧民的生活息息相關(guān)[10],牦牛酸奶更是牧區(qū)的重要經(jīng)濟來源之一,其營養(yǎng)成分比普通牛奶高[11],當(dāng)?shù)氐哪撩袷来赜脗鹘y(tǒng)的自然發(fā)酵方法,所制作的酸奶中含有性能優(yōu)良的乳酸菌群,風(fēng)味獨特,口感鮮美,組織形態(tài)完整,是青藏高原地區(qū)的人們廣泛食用的一種綠色有機酸奶[13]。本實驗采集傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶,對其中的乳酸菌種進行分離純化及鑒定,為我省牦牛乳資源的加工及可持續(xù)發(fā)展提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[15]。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗樣品 實驗樣品為牧區(qū)牧民家庭的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶,采自青海省果洛藏族自治州班瑪縣2份、甘德縣2份、瑪沁縣2份和瑪多縣2份。

1.1.2主要試劑 MRS培養(yǎng)基,購自杭州百思生物技術(shù)有限公司;草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、番紅染色液、香柏油、甘油,均購自上海尚寶生物科技有限公司;95%乙醇,購自天津市富宇精細化工有限公司;生化鑒定試劑盒,購自上海滬崢生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 電子天秤(YP402N),購自廣東香山衡葉集團股份有限公司;電磁爐(C22-RT22E01),購自廣東美的生活電器制造有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS),購自上海申安醫(yī)療器械廠;CO2恒溫培養(yǎng)箱(HF240),購自浙江納德科學(xué)儀器有限公司;磁力攪拌器(78-1),金壇市大地自動化儀器廠;顯微鏡(OLYMPUS-IX71),購自上海普赫光電科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品的采集 采集青海省果洛藏族自治州4縣傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸奶樣品,分別存于采樣管中,標(biāo)注采集地名、編號及來源等信息,在0～4℃冷藏條件下帶回實驗室。

1.2.2培養(yǎng)基制備

1.2.2.1MRS瓊脂/肉湯培養(yǎng)基的制備 分別稱取MRS瓊脂/肉湯培養(yǎng)基置于燒杯中,加入對應(yīng)量的蒸餾水進行水浴加熱,并用玻璃棒攪拌至溶解。

1.2.2.2滅菌 先將溶解好的培養(yǎng)液和培養(yǎng)皿等實驗用品置于高壓蒸汽滅菌鍋中,在121℃條件下滅菌15～20 min,然后置于超凈工作臺上用紫外線照射30 min,滅菌、通風(fēng)15 min。

1.2.2.3固體培養(yǎng)基制備在滅菌后的培養(yǎng)皿中加入約15 mL 的滅菌MRS瓊脂液,其冷卻凝固后即成培養(yǎng)基。

1.2.3菌液的配置 取10 mL樣品加入裝有90 mL蒸餾水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000～10 000 r/min磁力攪拌器均質(zhì)1～2 min。取1 mL上述菌懸液置于9 mL的無菌水中,將其振蕩混合均勻形成10-1的稀釋液,并按照10倍系列梯度稀釋,依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的稀釋菌懸液。

1.2.4菌株分離純化 用無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各0.20 mL,分別對應(yīng)接種于3個MRS瓊脂培養(yǎng)基中。將菌液均勻涂布于平板上,每個稀釋度做2個平行,靜置20 min后,將其倒置放在37℃的 CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)基觀察菌落,用接種環(huán)挑取有透明環(huán)的,不同形狀、大小及顏色的單個菌落,分區(qū)劃線接種在MRS瓊脂培養(yǎng)基上,于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進一步純化菌株。待平板上的菌落形成后,取出培養(yǎng)平板,選擇菌落分布較好的平板進行觀察,挑選形態(tài)不同的菌落在MRS瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)進行分離純化,直至培養(yǎng)基表面生長的菌落一致。對菌株進行編號,并記錄顏色、形態(tài)、大小、表面突起程度等特征。

1.2.5菌落形態(tài)學(xué)鑒定 從分離純化的菌株中選擇表面光滑有光澤、邊緣整齊、有凸起的白色菌落,進行革蘭氏染色并鏡檢,染色結(jié)果呈藍紫色的為革蘭氏陽性菌[16,17]。通過溶菌環(huán)、菌落的形狀及大小、革蘭氏染色情況等特征,初步判定為乳酸菌。

1.2.6乳酸菌生化鑒定 根據(jù)菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果,參照《伯杰細菌鑒定手冊》[18,19]對菌株進行生理生化試驗,根據(jù)GB4789.35-2023[20]的乳酸菌檢驗標(biāo)準(zhǔn),利用生化鑒定試劑盒對從中分離到的乳酸菌進行菌種的鑒定。

1.2.7MRS肉湯培養(yǎng)基擴增培養(yǎng) 將滅菌冷卻后的MRS肉湯培養(yǎng)基分裝到試管中,每個試管分裝約5 mL,挑選反復(fù)純化后的單一菌落至試管中,放置在37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.8菌株保藏 在凍存管中加入300 μL甘油和700 μL菌液,將其混合均勻后在凍存盒中進行標(biāo)注分裝,于-80℃條件下凍存。

2 實驗結(jié)果

2.1 分離菌株鑒定結(jié)果

2.1.1分離菌株菌落形態(tài)特征 青海果洛地區(qū)4縣的8份牦牛酸奶樣品中共分離了16株菌株,在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈圓形,顏色為白色或乳白色,中部凸起或扁平,表面有的光滑有的粗糙,邊緣有的整齊有的不齊,與乳酸菌菌落形態(tài)基本一致。(見圖1～圖4、表1)。

表1 果洛州4縣牦牛酸奶菌株菌落的形態(tài)特征

圖1 班瑪縣牦牛酸奶菌株菌落形態(tài)

圖2 甘德縣牦牛酸奶菌株菌落形態(tài)

圖3 瑪沁縣牦牛酸奶菌株菌落形態(tài)

圖4 瑪多縣牦牛酸奶菌株菌落形態(tài)

2.1.2革蘭氏染色鏡檢結(jié)果 對分離株進行染色、鏡檢,結(jié)果顯示,分離得到的16株菌全部為革蘭氏陽性菌,其中8株為鏈球菌,8株為桿菌(如圖5-8、表2)。結(jié)合對其生長特征及形態(tài)的顯微鏡中觀察,初步判定分離的16株菌為乳酸菌。

表2 菌株鏡檢形狀

圖6 甘德縣酸奶菌株鏡檢結(jié)果

圖7 瑪沁縣酸奶菌株鏡檢結(jié)果

圖8 瑪多縣酸奶菌株鏡檢結(jié)果

2.1.3生化鑒定結(jié)果 對分離篩選出的8株桿狀乳酸菌和8株鏈球狀乳酸菌進行進一步鑒定。鑒定結(jié)果見表3、表4。結(jié)果表明,從班瑪縣所采集樣品分離的4株菌中,1株為嗜熱鏈球菌、1株為羅伊氏乳酸桿菌、2株為干酪乳酸桿菌;從瑪多縣所采集樣品分離的4株菌中,1株為德氏乳酸桿菌、1株為羅伊氏乳酸桿菌、2株為嗜熱鏈球菌;從甘德縣所采集樣品分離的4株菌中,2株為嗜熱鏈球菌、2株為德氏乳酸桿菌;從瑪沁縣所采集樣品分離的4株菌中,3株為嗜熱鏈球菌、1株為嗜酸乳桿菌。

表3 乳桿菌生化鑒定結(jié)果

表4 鏈球菌生化鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實驗從果洛州班瑪縣、甘德縣、瑪沁縣和瑪多縣4個地區(qū)的8份牦牛酸奶樣品中共分離出16株乳酸菌,其中3株為德式乳酸桿菌、2株為干酪乳酸桿菌、2株為羅伊氏乳桿菌、1株為嗜酸乳桿菌、8株為嗜熱鏈球菌。4個不同地區(qū)樣品的乳酸菌中,均有嗜熱鏈球菌;甘德縣和瑪多縣的樣品中有德式乳酸桿菌,班瑪縣和瑪多縣的樣品中有羅伊氏乳酸桿菌,班瑪縣的樣品中有干酪乳桿菌,瑪沁縣的樣品中有嗜酸乳桿。從上述結(jié)果中可看出,不同地區(qū)的酸奶中乳酸菌的種類有所不同,這可能與青海省不同地區(qū)地理環(huán)境的差異較大有關(guān),地區(qū)海拔分布以及氧氣含量的不同,使得微生物菌群的生長環(huán)境出現(xiàn)差異。此外,同一地區(qū)樣品中的乳酸菌種也存在差異性,這可能是由制作原料及工藝的不同所造成的,還有待于進一步的研究。