桔霉素分子印跡預組裝體系的量子化學模擬及吸附性能研究

周康熙，吳 俐，呂旭聰，倪 莉*

（1 福州大學石油化工學院 福州350108 2 福州大學食品科學技術研究所 福建省食品生物技術創(chuàng)新工程技術研究中心 福州 350108）

真菌毒素桔霉素（Citrinin，CIT）是一種由青霉或曲霉產(chǎn)生的聚酮類次級代謝產(chǎn)物[1]，對生物體內(nèi)多種臟器具有毒性[2-4]，因此桔霉素的檢測對于該類發(fā)酵食品的安全性評估尤為重要[5]。當前桔霉素的檢測方法有高效液相色譜法（HPLC 法）[6]、熒光分光光度法[7]、免疫分析法[8]等，其中HPLC 法是檢測桔霉素最為常用的方法，也被多個標準所使用。由于桔霉素的限量較低，因此當前對于痕量濃度的樣品僅靠HPLC 的分析檢測略顯不足[9]。桔霉素新國標GB 5009.222-2016《食品安全國家標準食品中桔青霉素的測定》 是在舊國標GB/T 5009.222-2008《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定》的基礎上進行改進，在樣品前處理階段增加了免疫親和柱凈化操作，能夠起到除雜和富集的效果，其定量限由1 mg/kg 改進至80 μg/kg，提高了檢測靈敏度，然而免疫親和柱的成本較為高昂[10]，因此有必要開發(fā)一種低成本的替代方法。

分子印跡技術使用化學合成方法人為構(gòu)建具有特殊識別位點的聚合物（分子印跡聚合物，Molecular imprinted polymer，MIP），該聚合物能夠模擬抗體對抗原的識別功能，在特異性吸附的基礎上實現(xiàn)對目標物的分離純化或分析檢測[11-12]。MIP 常用的構(gòu)建方法是：以目標物為模板分子，將具有聚合作用的功能單體與模板分子之間進行共價或非共價結(jié)合，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑對功能單體進行交聯(lián)聚合，最后將模板分子洗脫，從而形成對目標物具有吸引力的多孔穴印跡聚合物[13-14]。當前已有基于分子印跡技術開發(fā)用于桔霉素的提純或檢測的固相萃取柱（Solid phase extraction column）的報道[15-16]。在構(gòu)建桔霉素分子印跡聚合物時，洗脫溶劑無法完全清除聚合物深層的模板分子，在痕量分析時可能會發(fā)生模板泄露[17]。為避免模板泄露帶來的檢測失準問題，需要使用與目標物結(jié)構(gòu)相似的假模板[18-19]。然而，當前缺乏桔霉素與假模板分子的同時檢測方法，在預組裝桔霉素分子印跡聚合物時挑選功能單體也較為盲目，不利于快速構(gòu)建桔霉素分子印跡聚合物。

基于此，本文以1-羥基-2-萘甲酸（1-Hydroxy-2-naphthoic acid，1H2NA）為假模板分子，構(gòu)建同時檢測CIT 和1H2NA 的方法，基于量子化學計算方法篩選桔霉素分子印跡聚合物的功能單體，用響應面優(yōu)化該聚合物的最佳組裝工藝，同時分析該聚合物對桔霉素的吸附性能，旨在為分子印跡聚合物的構(gòu)建和桔霉素富集與檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能紅曲（Fermentum Rubrum）FHQ2 取自福建寧德；CIT（色譜純級），上海源葉生物科技有限公司；1H2NA、2，6-二氨基吡啶（2，6-Diaminopyridine，2，6-DAP）、甲基丙烯酸（Methacrylic acid，MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）等試劑（分析純級），阿拉丁試劑（上海）有限公司；磷酸、三乙胺、四氫呋喃等試劑（分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純級），德國默克公司；桔霉素免疫親和柱，美國VICAM 公司。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000 UHPLC 液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ZWY-2102C 型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；DLSB-5/10 低溫冷卻循環(huán)泵，予華儀器有限責任公司；V-100 型步琦真空泵，瑞士BUCHI 有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CIT 和1H2NA 的同時檢測

1.3.1.1 標品的配置 以75%乙醇為溶劑，配制成同時含有500 ng/mL 的CIT 和4 000 ng/mL 的1H2NA 的混標母液，將母液與75%乙醇分別按1∶4、2∶3、3∶2、4∶1 的體積比稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的標品溶液。

1.3.1.2 樣品的處理 對于分子印跡樣品，取分子印跡聚合物清洗液或者吸附試驗的樣品于12 000 r/min 離心5 min，取上清液用0.22 μm 濾膜過濾后待測；對于紅曲樣品，取0.5 g 樣品加入75%乙醇20 mL，60 ℃提取120 min，4 500 r/min 離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜后待測。

1.3.1.3 自建液相色譜的檢測條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm，樣品進樣量20 μL，流動相：A 相為同時含有0.02%三乙胺、0.32%四氫呋喃和0.1%磷酸的水溶液，B 相為100%的乙腈，流動相的洗脫梯度條件見表1。

表1 HPLC 流動相的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase of HPLC

1.3.2 基于量子化學計算篩選功能單體 以1H2NA 為假模板分子，以MAA 等20 個常見的功能單體為對象，用量子化學相關軟件優(yōu)化假模板分子與備選功能單體的最低能量構(gòu)象圖及計算各原子電荷分布，推測其可能的主要質(zhì)子給出點和電子給出點，初篩合適的功能單體，再將假模板分子與之進行分子對接并優(yōu)化其結(jié)合物的最低能量構(gòu)象，根據(jù)式（1）計算兩者之間的結(jié)合能（ΔE），以此來篩選適合制備CIT 分子印跡聚合物的功能單體。

式中，EAB——結(jié)合物單點能，kJ/mol；n——功能單體數(shù)量；EA——功能單體單點能，kJ/mol；EB——模板分子單點能，kJ/mol。

量子化學的計算過程如下：首先使用Gaussian 16 軟件在B3LYP/6-31g**em=gd3bj 水平進行優(yōu)化，并在相同水平做振動分析以確保沒有虛頻。所有構(gòu)型的單點能均在B3LYP/def2tzvp em=gd3bj 水平進行。結(jié)合構(gòu)型搜索以及優(yōu)化采用molclus 軟件[20]產(chǎn)生最可能的50 個吸附結(jié)構(gòu)，并使用xtb 軟件[21]進行初步優(yōu)化并進行去除能量重疊，得到能量最低的6 種構(gòu)型。將6 種構(gòu)型在B3LYP/6-31g** em=gd3bj 水平進一步優(yōu)化，在相同水平做振動分析以確保沒有虛頻，并在B3LYP/def2tzvp em=gd3bj 水平進行單點計算。該部分數(shù)據(jù)的計算委托中科科翼（北京）科技有限公司代為執(zhí)行。

1.3.3 分子印跡聚合物的制備 以1H2NA 為假模板分子、2，6-DAP 為功能單體、二甲亞砜為致孔劑、β-環(huán)糊精為輔助致孔劑，EGDMA 為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑制備桔霉素分子印跡聚合物MIP1。MIP1 的具體制備步驟與參考文獻[22]所述一致。MIP1 的優(yōu)化指標為1H2NA、2，6-DAP 和EGDMA 添加的物質(zhì)的量，這三者的初始添加物質(zhì)的量分別為1，2，2 mmol，單因素優(yōu)化在此基礎上將每種物質(zhì)添加的物質(zhì)的量分別替換為1，2，3，4，5，6 mmol，基于單因素優(yōu)化結(jié)果使用Design-Expert V8.0.6.1 軟件進行三因素三水平響應面優(yōu)化。在MIP1 最優(yōu)合成條件下，以不加1H2NA 的聚合物為NIP1；在MIP1 最優(yōu)合成條件下，將2，6-DAP 替換為MAA 即得MIP2；在MIP2 制備工藝的基礎上不加1H2NA 的聚合物即得NIP2。

1.3.4 聚合物的動態(tài)吸附性考察 稱取制備好的MIP1、NIP1、MIP2 和NIP2 各0.25 g 分別均勻分散于100 mL 錐形瓶內(nèi)的30 mL 200 ng/mL 桔霉素溶液中，將各個吸附體系在30 ℃、120 r/min 條件下振蕩180 min，從第0 分鐘開始每隔30 min 取樣1 mL 并迅速進行高速離心（12 000 r/min 離心5 min）和過膜（0.22 μm 濾膜）處理，分析上清液中剩余桔霉素濃度，按式（2）計算不同分子印跡聚合物對桔霉素的吸附載量（Q）。

式中，C0——桔霉素的初始質(zhì)量濃度，ng/mL；Ct——t 時刻樣品溶液中桔霉素質(zhì)量濃度，ng/mL；V——所取桔霉素溶液的體積，mL；m——聚合物的質(zhì)量，g。

1.3.5 聚合物的靜態(tài)吸附性考察 以100 mL 錐形瓶為容器，制備好的聚合物MIP1、NIP1、MIP2和NIP2 每種各準備7 份，每份0.25 g，將每種聚合物分別均勻分散于7 個不同質(zhì)量濃度梯度（0，100，200，300，400，500，600 ng/mL）的30 mL 桔霉素溶液中，再將各個吸附體系在30 ℃、120 r/min條件下振蕩150 min，吸附結(jié)束后進行高速離心（12 000 r/min 離心5 min）和過膜（0.22 μm 濾膜）處理，分析上清液中剩余桔霉素質(zhì)量濃度，按式（2）計算不同分子印跡聚合物對桔霉素的吸附載量（Q）。

1.3.6 聚合物對紅曲樣品中桔霉素的吸附效果考察 稱取0.25 g 制備好的MIP1、NIP1 和MIP1 分別填裝于SPE 空柱中，封裝后分別加入75%乙醇潤濕，直至不再流出液體，向柱子內(nèi)加入1 mL 樣品溶液，收集過濾液直至液體不再流出，將液體12 000 r/min 離心5 min 后過膜用HPLC 繪制圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔霉素和1-羥基-2-萘甲酸同時檢測方法的構(gòu)建

在構(gòu)建分子印跡聚合物時，洗脫溶劑無法將深埋于聚合物內(nèi)部的模板分子完全洗脫，為避免模板泄露帶來的檢測失準問題，需要使用與目標物結(jié)構(gòu)相似的假模板。1H2NA 與CIT 分子結(jié)構(gòu)較為相似，均具有熒光顯色反應的聚酮環(huán)，兩者的聚酮環(huán)上均具有鄰位羥基和羧基，適宜作為CIT 的假模板[16]。對CIT 和1H2NA 同時檢測方法的構(gòu)建有助于同時監(jiān)測CIT 的吸附與假模板的洗脫。

由圖1 可知，新構(gòu)建的HPLC 檢測方法能夠?qū)IT 和1H2NA 相分離，兩者峰形良好，不相干擾、不拖尾、標曲線性好（R2＞0.999），能夠?qū)崿F(xiàn)對這2 種質(zhì)的同時檢測。以甲醇對分子印跡聚合物的清洗液為對象，添加一定質(zhì)量濃度的CIT 作為待測樣品，經(jīng)檢測2 種目標物的質(zhì)量濃度后再做加標回收率試驗，加標回收率均在95%～100%之間（表2），說明該方法能為后續(xù)CIT 分子印跡聚合物的構(gòu)建提供檢測基礎，尤其是檢驗聚合物對樣品吸附過程中是否有模板泄露問題。此外，由于這兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)過于相似，其經(jīng)過C18 柱的保留時間相差較短（0.48 min），驗證了1H2NA 可作為替代CIT 作為分子印跡模板的可行性。

圖1 CIT 及1H2NA 的液相色譜圖（a）及其標準曲線（b、c）Fig.1 Liquid chromatogram（a）and standard curve（b，c）of CIT and 1H2NA

表2 CIT 和1H2NA 同時檢測方法的加標回收率Table 2 The recovery rate of standard addition of the simultaneous detection method for CIT and 1H2NA

2.2 基于量子化學計算篩選功能單體

基于量子化學方法優(yōu)化假模板分子1H2NA與20 種功能單體的最低能量構(gòu)象及計算各原子電荷分布，推測其主要質(zhì)子給出點和電子給出點（表3）。原子電荷大小與其電子交換能力有關，所帶負電荷越大，電子越多，越能結(jié)合質(zhì)子；所帶正電荷越大，給質(zhì)子能力越強。雖然所有物質(zhì)均存在質(zhì)子給出點和電子給出點，但兩者的強度有所差異。相比于1H2NA，4-乙烯基咪唑、苯乙烯、對二乙烯基苯和對乙基苯乙烯主要質(zhì)子給出點和電子給出點處的電荷較小，對目標物的結(jié)合能力較弱；MAA 和2-（三氟甲基）丙烯酸給質(zhì)子能力雖較強，但給電子能力較弱，2-（甲基丙烯氧基）-N，N，N，-三甲基乙烷-1-胺、烯丙胺、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡啶、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯則給質(zhì)子能力不足，這兩類物質(zhì)與1H2NA 的結(jié)合穩(wěn)定性較低。初步篩選出較為合適的功能單體亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、2，6-DAP。

表3 假模板分子與各功能單體的主要質(zhì)子給出點和電子給出點Table 3 The main proton-giving points and electron-giving points of pseudo-template molecules and functional monomers

以此為基礎，再次運用量子化學預測初篩后的功能單體與1H2NA 按物質(zhì)的量比2∶1 結(jié)合后的最低能量構(gòu)象模擬圖（圖2），并根據(jù)式（1）計算結(jié)合能（ΔE）。結(jié)合能越高，預組裝的MIP 就越穩(wěn)定。從表4 中可看出，1H2NA 與2，6-DAP 的結(jié)合最為穩(wěn)定，因此選擇2，6-DAP 作為功能單體。

圖2 假模板分子與備選功能單體的最低能量構(gòu)象模擬圖Fig.2 Simulation diagram of the lowest energy conformation of pseudo-template molecule and alternative functional monomer

表4 假模板分子與備選功能單體的結(jié)合能理論計算結(jié)果Table 4 Theoretical calculation results of binding energy between pseudo-template molecule and alternative functional monomer

2.3 響應面優(yōu)化CIT 分子印跡聚合物的合成工藝

模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的添加比例需要均衡，當模板分子比例太低或交聯(lián)劑比例太高時，可能會形成較多的非印跡空穴，當模板分子比例太高或交聯(lián)劑比例太低時，可能會導致印跡聚合物結(jié)構(gòu)松散，在研磨或超聲處理時其印跡空穴的結(jié)構(gòu)被破壞。以桔霉素吸附載量為指標，采用響應面法優(yōu)化構(gòu)建桔霉素分子印跡聚合物所需的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的最優(yōu)配比，參考單因素優(yōu)化結(jié)果（圖3）3 種物質(zhì)所選添加物質(zhì)的量優(yōu)化范圍為1～4 mmol，響應面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表5。

圖3 MIP1 組裝體系的單因素優(yōu)化Fig.3 Single factor optimization of MIP1 assembly system

圖4 MIP1 組裝體系的響應面優(yōu)化Fig.4 Response surface optimization of MIP1 assembly system

表5 響應面優(yōu)化桔霉素分子印跡聚合物制備工藝的試驗方案Table 5 Test scheme for optimizing the preparation process of citrinin molecularly imprinted polymer by response surface methodology

擬合方程：

Y=-295.01879 +89.62513X1+2.92325X2+220.21301X3+6.09235X1X2-5.61967X1X3-20.96920X2X3-17.31930X12+10.25023X22-28.89983X32

其中，Y——吸附載量，ng/g；X1——假模板分子用量，mmol；X2——功能單體用量，mmol；X——交聯(lián)劑用量，mmol。

當X1=2.95 mmol，X2=4 mmol，X3=2.07 mmol時，該分子印跡聚合物對桔霉素的吸附載量最大，其理論最大值為190.31 ng/g。經(jīng)過試驗驗證，該聚合物對桔霉素的實際吸附載量為（195.10±13.21）ng/g，符合理論模型，相比于優(yōu)化前【假模板分子用量1 mmol、功能單體用量2 mmol、交聯(lián)劑用量2 mmol，吸附載量（109.04±1.49）ng/g】提高了0.79倍。

2.4 CIT 分子印跡聚合物的吸附特性研究

以功能單體MAA 為對照，對比量子化學篩選的最優(yōu)功能單體2，6-DAP 對桔霉素的吸附效果。從圖5 可看出，無論是動態(tài)吸附還是靜態(tài)吸附，用2，6-DAP 合成的MIP1 對桔霉素的吸附載量都要大于以MAA 合成的MIP2，說明量子化學方法對功能單體篩選具有實用性。對于MIP1，當吸附時間超過120 min 時，其吸附載量已趨近飽和，在150 min 時吸附載量最大，為（197.95±1.40）ng/g；由靜態(tài)吸附曲線可知，當桔霉素含量低于400 ng/mL 時，MIP1 能夠快速吸附桔霉素，當其質(zhì)量濃度大于400 ng/mL 時，MIP1 對桔霉素的吸附已接近飽和，在桔霉素質(zhì)量濃度為500 ng/mL 時，其最大吸附載量為（207.05±1.97）ng/g，其結(jié)果接近于動態(tài)吸附最大吸附載量，也接近于響應面優(yōu)化結(jié)果，說明MIP1 的吸附性能較為穩(wěn)定。

圖5 各聚合物的動態(tài)吸附曲線（a）和靜態(tài)吸附曲線（b）Fig.5 Dynamic adsorption curve（a）and static adsorption curve（b）of each polymer

MIP1 對功能紅曲FHQ2 醇提液中桔霉素的吸附效果（圖6）顯示，桔霉素峰形良好無干擾，說明桔霉素和1H2NA 的同時檢測方法也適用于桔霉素的分離檢測。MIP1 對桔霉素的吸附能力均優(yōu)于MIP2 和NIP1，其吸附后的溶液中桔霉素的峰面積較原液下降了82.98%，大于MIP2 的26.89%和NIP1 的7.72%；同時，MIP1 和MIP2 這兩種印跡聚合物對桔霉素都有一定的識別吸附能力，因此在紅曲醇提液中MIP1 和MIP2 對桔霉素吸附量的比值（3.09 倍）與桔霉素標品溶液中MIP1 和MIP2 對桔霉素吸附量的比值（3.03 倍）基本一致。

圖6 各聚合物對功能紅曲醇提液中桔霉素的吸附效果Fig.6 Adsorption effect of polymers on CIT in alcohol extract of functional Hongqu

3 討論

計算機分子模擬技術是量子化學理論的進一步升華，將其應用于分子印跡技術能夠預測不同分子之間的結(jié)合位點及結(jié)合能力[23]，從而在篩選合成原料[24]、確定不同合成原料之間比例[25]、選擇合適致孔劑[26]等方面發(fā)揮作用，還能為印跡聚合物對目標物的識別機理提供理論解釋[27]，有利于節(jié)約試驗物資成本和時間成本。然而，使用不同程序進行計算有可能得出不同的結(jié)果，量子化學計算結(jié)果只能提供理論參考，最終優(yōu)化結(jié)果還需要通過試驗進行驗證。

雖然本研究所合成的MIP1 對CIT 具有良好的吸附特性，但從靜態(tài)吸附特性曲線中可知，在吸附體系中，當1 g MIP1 添加60 μg CIT 時，MIP1對CIT 的吸附載量為207.05 ng/g，目標物與印跡聚合物的識別空穴結(jié)合能力較低，這也是分子印跡聚合物可能存在的缺陷[28-30]。為克服該缺陷，除了優(yōu)選制備原料和制備工藝外，通常會將聚合物盡可能地研磨和過篩，以此在洗脫過程中脫除“包埋”過深的模板，盡量暴露出隱藏在聚合物內(nèi)部的識別位點，減少目標物在被識別過程中的運動阻礙，以提高聚合物的吸附載量[31-32]。然而，研磨操作也可能會破壞所構(gòu)建的具有識別能力的空間結(jié)構(gòu)，增加了非目標物的競爭吸附。表面分子印跡技術能夠在基質(zhì)材料表面建立一層分子印跡聚合物[33]，該聚合物比表面積較大[34]，能夠避免聚合物研磨帶來的問題，然而目前表面分子印跡技術尚處于發(fā)展階段，這種聚合物本身對目標物的結(jié)合容量小，僅能對目標物進行分析檢測，對其富集能力略顯不足[35]。就當前技術而言，開發(fā)檢測和富集兼?zhèn)涞姆肿佑≯E技術仍有很大的發(fā)展空間。

4 結(jié)論

基于HPLC 的CIT 和1H2NA 的同時檢測方法能夠滿足對印跡聚合物構(gòu)建過程中樣品的分析檢測，也適用于功能紅曲中CIT 的分離檢測。響應面優(yōu)化MIP1 的制備工藝能使最優(yōu)配方下的MIP1對CIT 吸附載量提高0.79 倍。基于量子化學方法優(yōu)選出的功能單體2，6-DAP 所構(gòu)建的MIP1 相比于常用功能單體MAA 所構(gòu)建的MIP2 對CIT 吸附能力更佳，其吸附載量是后者的3 倍。