龐佳昱， 魯艷杰，， 左彥珍， 張?chǎng)斡睿?靳順康， 李玉紅，

(1.承德醫(yī)學(xué)院 病理教研室， 河北 067000； 2.承德醫(yī)學(xué)院 腫瘤研究室， 河北 067000)

引言

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是威脅人類健康的重大疾病之一。在中國(guó)，結(jié)直腸癌標(biāo)化發(fā)病率和標(biāo)化死亡率均高于全球水平，疾病不僅嚴(yán)重威脅國(guó)民的生命健康，還給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。臨床上有一種常見現(xiàn)象，罹患惡性腫瘤的病人在得知病情后往往表現(xiàn)出焦慮、恐懼和抑郁等心理問題，甚至一蹶不振，身體每況日下。長(zhǎng)期慢性的心理壓力刺激機(jī)體所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)即為慢性應(yīng)激。越來越多的證據(jù)表明，慢性情緒壓力源可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生[2]，甚至影響腫瘤的轉(zhuǎn)移[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外有關(guān)慢性應(yīng)激促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究較少且不夠深入，且缺乏慢性應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)影響的相關(guān)研究。因此，針對(duì)慢性應(yīng)激影響免疫系統(tǒng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

近年人們逐漸認(rèn)識(shí)到，腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)是支持腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散不可或缺的體系[6]。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是影響結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的主要成分。在募集到腫瘤部位的固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞十分豐富，并且存在于腫瘤進(jìn)展的各個(gè)階段。巨噬細(xì)胞在癌癥中具有抗腫瘤和促進(jìn)腫瘤的雙重功能。TAMs可分為M1和M2亞型，CD80是M1的生物標(biāo)記，CD163是M2的生物標(biāo)記[7]，CD163的升高提示巨噬細(xì)胞向M2極化[8-10]。

由于慢性應(yīng)激狀態(tài)可能參與影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，通過篩選數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果提示，CCL2-CCR2軸在結(jié)直腸癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。因此，在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展過程中，CCL2-CCR2信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞極化中的作用有待進(jìn)一步研究。本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌慢性應(yīng)激患者與非應(yīng)激患者腫瘤組織中CCL2與M1、M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)及其相關(guān)性，探討CCL2與M2型巨噬細(xì)胞極化在慢性應(yīng)激影響結(jié)直腸癌中的作用和機(jī)制。從免疫微環(huán)境角度尋找慢性應(yīng)激影響結(jié)直腸進(jìn)展的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)，為結(jié)直腸癌的診療及預(yù)后提供關(guān)鍵靶點(diǎn)和治療新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年7月至2023年2月，于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科進(jìn)行結(jié)直腸癌手術(shù)患者的50例結(jié)直腸癌標(biāo)本(男30例，女20例，年齡18～80歲)。其中應(yīng)激患者25例，非應(yīng)激患者25例。所有患者均于手術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)直腸癌。所有患者初次入院通過腫瘤患者焦慮自評(píng)量表(SAS)[11]和抑郁自評(píng)量表(SDS)[12]住院的結(jié)直腸癌患者的慢性應(yīng)激進(jìn)行等級(jí)分類。本研究通過承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批(倫理審批受體編號(hào)：202215)。

1.2 主要儀器與試劑

兔抗人CCL2單克隆抗體(批號(hào)：00039244)購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗人CD80單克隆抗體(批號(hào)：10033179)購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗人CD163單克隆抗體(批號(hào)：00123179)購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體(批號(hào)：AA54151)購(gòu)于美國(guó)Earthox生物科技公司；羊抗鼠單克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體購(gòu)于武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：2171D0817)購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色系統(tǒng)(批號(hào)：2010A1118)購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)。

1.3 患者慢性應(yīng)激等級(jí)的分類

慢性應(yīng)激的等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)William W.K. Zung編制的焦慮自評(píng)量表(SAS)評(píng)定焦慮狀態(tài)，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)分50分及以上為焦慮狀態(tài)。根據(jù)William W.K.Zung編制的抑郁自評(píng)量表(SDS)評(píng)價(jià)抑郁狀態(tài)，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)分53分及以上為抑郁狀態(tài)。無焦慮和抑郁狀態(tài)的患者納入非慢性應(yīng)激組，存在焦慮和(或)抑郁狀態(tài)的患者納入慢性應(yīng)激組。

1.4 免疫組織化學(xué)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CCL2、CD163蛋白在石蠟包埋病理切片標(biāo)本的表達(dá)情況：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸緩沖液梯度微波修復(fù)抗原，3% H2O2封閉20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗兔抗人CCL2單克隆抗體(1∶100)，兔抗人CD163單克隆抗體(1∶1000)，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。滴加二抗，PBS洗后DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每例患者切片任意觀察3個(gè)中倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)總和后取均值。組化切片中的細(xì)胞按染色強(qiáng)度分級(jí)，并與背景著色對(duì)比，無著色為0分，淡黃色為1分，黃色或深黃色為2分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：1%<1分≤25%，25 %<2分≤50%，50%<3分≤75%，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)>75%為4分。兩者相乘之積，1～2分為陰性(-)，3～8分為陽性(+)。

1.5 CRCs組織中C80、CD163和CCL2 Western blot檢測(cè)

取出液氮凍存組織15例，加入裂解液后，用超聲破碎儀低溫破碎10 min，離心取上清后，利用BCA定量測(cè)蛋白濃度，加熱變性。SDS-聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。加一抗(CCL2 1∶1000；CD80 1∶2000；CD163 1∶1000；GAPDH 1∶5000)，放入4℃搖床過夜。TBST洗三次，加二抗，37℃孵育1 h，TBST洗三次，顯色，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用 Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生信數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示CCL2或可通過巨噬細(xì)胞影響結(jié)直腸癌預(yù)后

通過從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的各類癌腫數(shù)據(jù)集：在結(jié)腸癌(T=275，N=349)和直腸癌(T=92，N=318)疾病模型中比較，CCL2在腫瘤組織中含量顯著少于正常組織(圖1A)；Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢測(cè)了CCL2與結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CCL2高表達(dá)的患者預(yù)后差(P<0.05)(圖1B)。同時(shí)，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步的提取了ENSG 00000108691(CCL2)基因在各個(gè)樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選了樣本來源為Primary Blood Derived Cancer - Peripheral Blood、Primary Tumor的樣本，更進(jìn)一步的對(duì)每一個(gè)表達(dá)值進(jìn)行了log2(x+0.001)變換，最后剔除了單個(gè)癌種樣本中個(gè)數(shù)小于3個(gè)的癌種，最終獲得了26個(gè)癌種的表達(dá)數(shù)據(jù)。使用R軟件(version 3.6.4)計(jì)算了每個(gè)腫瘤中基因在不同臨床分期樣本中的表達(dá)差異，使用非配對(duì)的Student’s t-Test進(jìn)行兩兩之間的差異顯著性分析，利用方差分析進(jìn)行多組樣本的差異檢驗(yàn)，在結(jié)直腸腫瘤中觀察到了顯著差異COADREAD (T1=10，T2=57，T3=259，T4=50)(P<0.05)(圖1D)。說明CCL2高表達(dá)與結(jié)直腸癌不良分期有關(guān)。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CCL2與結(jié)直腸癌分期、預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

那么，CCL2是如何影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后和臨床分期的呢？在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)基因表達(dá)重新評(píng)估了每個(gè)腫瘤中B cell、T cell CD4、T cell CD8、Neutrophil、Macrophage、DC浸潤(rùn)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)CCL2高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增高(圖1C)。綜上，提示CCL2或可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞影響結(jié)直腸癌預(yù)后。

2.2 CCL2和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163在慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者組織中高表達(dá)

結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果提示，CCL2影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后。為了探究CCL2在慢性應(yīng)激的結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況。首先，本研究利用免疫組化方法檢測(cè)了CCL2在慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與非應(yīng)激組相比，應(yīng)激組結(jié)直腸癌患者中CCL2顯著高表達(dá)。(圖2A)；進(jìn)一步在應(yīng)激和非應(yīng)激組織中進(jìn)行M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163的染色，發(fā)現(xiàn)與非應(yīng)激組相比，應(yīng)激組結(jié)直腸癌患者中CD163也顯著高表達(dá)(圖2B)。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CCL2、CD163表達(dá)情況(免疫組化SP法，DAB顯色)

2.3 慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者中高表達(dá)的CCL2和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163存在正相關(guān)性

利用免疫組化方法，檢測(cè)了CCL2、CD163在慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況后，發(fā)現(xiàn)與非應(yīng)激組相比，應(yīng)激組結(jié)直腸癌患者中CCL2、CD163均顯著高表達(dá)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)；進(jìn)一步比較應(yīng)激和非應(yīng)激組織中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163和CCL2的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)呈正相關(guān)(r=0.8125 ，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析免疫組織化學(xué)CCL2、CD163表達(dá)情況

2.4 慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者組織中CCL2與M1、M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物的表達(dá)情況

利用Western blot，檢測(cè)了CD80、CD163、CCL2在慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況后，發(fā)現(xiàn)與非應(yīng)激組相比，應(yīng)激組結(jié)直腸癌患者中CCL2、CD163顯著高表達(dá)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與應(yīng)激組相比，非應(yīng)激組結(jié)直腸癌患者中CD80顯著高表達(dá)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義如圖4所示。

圖4 Western blot檢測(cè)CD80、CD163、CCL2表達(dá)情況及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 討論

近年來，隨著人們對(duì)心理學(xué)的認(rèn)識(shí)和逐漸重視，發(fā)現(xiàn)存在焦慮抑郁狀態(tài)的人群比例逐年增加，而隨著生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的逐步完善，心理因素在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后中的作用日益受到關(guān)注。據(jù)報(bào)道，人類長(zhǎng)時(shí)間的身體或心理壓力會(huì)對(duì)許多身體外周器官的功能產(chǎn)生短暫或持久的影響，尤其是下消化道[13-17]。慢性應(yīng)激可通過多方面途徑影響胃腸功能甚至腫瘤的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，焦慮、抑郁等慢性應(yīng)激可持續(xù)刺激應(yīng)激相關(guān)激素(腎上腺素、去甲腎上腺素等)的釋放[18]，課題組前期研究顯示，這一現(xiàn)象會(huì)進(jìn)一步加速腫瘤的生長(zhǎng)、上調(diào)，侵襲相關(guān)基因的表達(dá)并增加血管生成等，從而促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[19-22]。慢性應(yīng)激現(xiàn)象在臨床腫瘤患者中普遍存在，且伴有應(yīng)激相關(guān)激素水平的顯著升高。有研究表明，心理壓力等應(yīng)激使腎上腺激素增加會(huì)削弱免疫細(xì)胞執(zhí)行抗癌的能力，阻礙免疫系統(tǒng)防御腫瘤的過程[23]，從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特性并利于其生長(zhǎng)和擴(kuò)散[24]。

TAMs是腫瘤免疫微環(huán)境中極具吸引力的治療靶標(biāo)。基于多項(xiàng)結(jié)直腸癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，TAMs是腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)比例較高的免疫細(xì)胞亞型，且處在各細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)的核心環(huán)節(jié)，TAMs浸潤(rùn)較多預(yù)示著患者預(yù)后較差。TAMs主要通過3種機(jī)制促進(jìn)癌癥發(fā)展：①通過增強(qiáng)腫瘤血管生成潛在因子，并促進(jìn)淋巴血管生成；②重新編程腫瘤生長(zhǎng)；③腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和原發(fā)部位的內(nèi)滲TAMs用于內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的新生血管形成[25]。在腫瘤微環(huán)境中，浸潤(rùn)腫瘤實(shí)質(zhì)的巨噬細(xì)胞具有M1表型和M2表型[26]。多項(xiàng)研究也證實(shí)，TAMs介導(dǎo)膜上高表達(dá)抗炎作用的M2巨噬細(xì)胞受體CD163，低表達(dá)抑炎作用的M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80 ，多趨向巨噬細(xì)胞極化為具有促瘤作用的M2型巨噬細(xì)胞。鑒于M2在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，降低M2極化的比例可作為治療腫瘤的一種方式[27]。另一方面，M1具有促進(jìn)腫瘤免疫的抗腫瘤作用[28]。一些研究表明，慢性應(yīng)激通過激活外周促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號(hào)傳導(dǎo)的途徑改變腸道功能[29]。結(jié)腸中經(jīng)過修飾的免疫微環(huán)境可以通過增加細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力或加速血管生成來誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。以上提示，慢性應(yīng)激通過免疫功能影響結(jié)直腸癌進(jìn)展值得深入研究。通過生物信息學(xué)篩查得知，巨噬細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者中顯著增高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)50例患者進(jìn)行應(yīng)激與非應(yīng)激分組，通過收集患者術(shù)后病理組織、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)均提示，巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記物CD163在應(yīng)激與非應(yīng)激患者中顯著差異。這一結(jié)果表明，在應(yīng)激的結(jié)直腸腫瘤患者中，巨噬細(xì)胞更偏向M2方向極化，從而影響腫瘤發(fā)展。巨噬細(xì)胞的極化受腫瘤微環(huán)境的影響，表明巨噬細(xì)胞有能力成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

研究證實(shí)，細(xì)胞因子CCL2的分泌可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的重編程。有研究指出，當(dāng)CCL2-CCR2軸被阻斷時(shí)，TAMs在腫瘤中的積聚被消除[30-31]。阻斷CCL2/CCR2軸可以阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[32]。因此，結(jié)直腸癌潛在有效治療的方式之一是調(diào)控TAMs極化狀態(tài)，阻止TAMs 向M2型極化，調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。本研究證實(shí)，應(yīng)激患者CCL2、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163表達(dá)顯著升高，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80表達(dá)顯著降低，且CCL2與CD163表達(dá)呈顯著正相關(guān)。綜上表明，慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者組織中，CCL2介導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化水平的升高，可能參與了慢性應(yīng)激促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的過程，如圖5所示。

圖5 慢性應(yīng)激結(jié)直腸癌患者CCL2影響巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)模式圖

4 結(jié)論

腫瘤免疫微環(huán)境的變化正逐漸成為當(dāng)下研究者的關(guān)注熱點(diǎn)，并成為探討結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要焦點(diǎn)。本文重點(diǎn)圍繞巨噬細(xì)胞作為分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分，探究慢性應(yīng)激對(duì)結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的影響，這對(duì)結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后有極為重要的影響。綜上所述，針對(duì)CCL2的分泌機(jī)制和M2巨噬細(xì)胞極化作用機(jī)制，抑制CCL2分泌或抑制CCR2 活性，在改變巨噬細(xì)胞極化方向中顯得尤為重要。所以CCL2可能是治療結(jié)直腸癌患者的一個(gè)有前景的作用靶點(diǎn)。但本研究仍存在一定的局限性，未來需深入探究慢性應(yīng)激通過何種機(jī)制影響CCL2的分泌以及CCL2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞功能學(xué)直接影響的相關(guān)問題。未來需從心身醫(yī)學(xué)的新視角入手，希望通過靶向心理調(diào)節(jié)和免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)的防治策略，為延緩CRC的進(jìn)展提供理論依據(jù)。