人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)不同移植途徑治療肝硬化大鼠模型的效果比較

邱英麒， 王宏偉， 朱宏巖， 於洪亮， 謝 凡， 姜翠寶

1 海口市人民醫(yī)院臨床研究中心， ?？?570208； 2 上海泉生生物工程有限公司， 上海 201401通信作者： 姜翠寶， jiangcuibao@xibaozhiliao.cn（ ORCID： 0000-0001-6213-0829）

肝硬化是由多種原因引起的，形態(tài)學上表現(xiàn)為彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和肝實質(zhì)及血管結(jié)構(gòu)的扭曲［1-2］。目前的治療手段尚無法全面阻止肝硬化進展，終末期階段行異體肝移植亦受到肝源缺乏、并發(fā)癥多、排異反應和價格昂貴等諸多因素影響，難以在臨床廣泛應用，因此亟須開拓更多新的治療方案［3-5］。干細胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的細胞［6-7］，在特定條件下可誘導分化為肝細胞［8-11］，為肝硬化的治療提供了新的選擇。人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）是一種從人類臍帶中提取的新型間充質(zhì)干細胞（MSC），可在體內(nèi)修復損傷組織和進行免疫調(diào)節(jié)，還有多向分化潛能，能夠改善肝硬化模型大鼠的肝功能指標及病理學改變［12］。本研究將探討兩種不同hUC-MSC制劑（冷凍細胞制劑/新鮮細胞制劑）通過兩種給藥途徑（門靜脈/尾靜脈）移植對肝硬化大鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 水合氯醛，CCl4（國藥集團化學試劑有限公司，國藥編碼：ZA051842、XW05623502），橄欖油（歐麗薇蘭，商品編號：958796），hUC-MSC注射液（浙江泉生生物科技有限公司，批號：QSC1012019101101），40%高脂實驗料（上海普路騰生物科技有限公司，貨號：PSY1102），北京紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，5 L，56°）。

1.2 實驗儀器 ES-300-1 包埋機，ES-300-2C 冷臺（金華市華速科技有限公司），RM2235石蠟切片機（德國萊卡公司），BX-9030A 電熱鼓風干燥箱（上海柏欣儀器設(shè)備廠），DK-8D 三溫三控水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），Countstar Rigel S2 智能一體化熒光分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物 雄性SD 大鼠［生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2019-0002，使用許可證編號：SYXK（滬）2018-0027］，6～8 周，220 g 左右，由上海交通大學實驗動物中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 肝硬化大鼠造模及分組 70 只SPF 級健康雄性SD大鼠隨機分組：正常組13只，予以普通自來水及普通鼠糧喂養(yǎng)；肝硬化模型組57 只，給予CCl4/橄欖油溶液（體積比1∶1）混合液3 mL/kg，每周2次，皮下多點注射造模，期間給予高脂飼料和10%乙醇水溶液充當飲用水，以增強CCl4肝臟毒性效應。第8周觀察2組大鼠的生長狀況，取正常組及模型組小鼠各3 只行組織病理學檢查，明確肝硬化形成。選取50只肝硬化模型組大鼠，按隨機數(shù)字表法分為模型組、門靜脈（新鮮細胞制劑）組、門靜脈（冷凍細胞制劑）組、尾靜脈（新鮮細胞制劑）組、尾靜脈（冷凍細胞制劑）組，每組10只。采取大鼠眼眶靜脈血，檢測肝功能指標。

1.4.2 大鼠肝硬化模型hUC-MSC 移植 尾靜脈移植組：用75%乙醇反復擦拭大鼠尾部，使尾靜脈充分顯露，注射0.1 mL細胞懸液，脫脂棉球輕輕按壓1 min。門靜脈移植組：給予大鼠10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，無菌條件下常規(guī)消毒、備皮、鋪巾，選上腹縱切口，暴露肝臟，于門靜脈注入0.1 mL 細胞懸液，壓迫片刻后關(guān)腹；模型組：給予尾靜脈注射復方電解質(zhì)液0.1 mL。

給藥方式：尾靜脈注射hUC-MSC，2×107個/kg，1 次/周，連續(xù)4 周；門靜脈注射hUC-MSC，1×107個/kg，共1次。給藥后觀察4周［13-15］。

1.4.3 常規(guī)檢查 所有大鼠每周稱重一次，記錄體質(zhì)量；觀察行為、皮毛和精神狀態(tài)等，了解大鼠大體狀態(tài)。

1.4.4 肝功能檢測 對模型大鼠實施hUC-MSC 移植術(shù)后4 周（第12 周實驗結(jié)束時），所有大鼠12 h 禁食后腹主動脈取血各5 mL，3 500 r/min 離心10 min，提取血清。檢測ALT、AST、TBil及ALP水平，了解肝臟合成代謝功能，另外觀察腹腔有無腹水存在。

1.4.5 組織病理學檢查 移植后4周，大鼠脫頸椎處死后打開腹腔取肝組織，PBS 清洗血跡后，取2塊肝大葉中部約1 cm×1 cm 大小肝組織分別置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，行HE、Masson 和天狼星紅染色，觀察病理變化；剩余肝組織取材部分，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化 正常組大鼠體質(zhì)量一直保持穩(wěn)定的上升趨勢，模型組和給藥組大鼠體質(zhì)量增加趨勢低于正常組（圖1）。

2.2 第8 周大鼠肝功能指標比較 造模第8 周，肝硬化模型組大鼠均出現(xiàn)腹水。正常組和肝硬化模型組大鼠ALT、AST、TBil、ALP 水平對比差異均有統(tǒng)計學意義（P值均<0.001），且差距較大，符合實驗預期（表1）。

表1 第8周大鼠肝功能檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of liver function test results of rats at the 8th week

2.3 第8周大鼠的肝組織病理變化 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴張，肝細胞排列正常，肝細胞正常。肝硬化模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，被粗細不等的纖維組織包繞，肝細胞排列紊亂，胞漿疏松，細胞變性、壞死，可見炎性細胞浸潤，符合肝硬化診斷標準；Masson、天狼星紅染色切片光鏡下可見肝小葉被粗細不同的纖維組織分隔包繞，形成假小葉（圖2）。

圖2 模型組和正常組的HE、Masson、天狼星紅染色結(jié)果Figure 2 H&E ，Masson and Sirus red staining results of model group and normal group

2.4 第12周實驗結(jié)束時大鼠肝功能指標的變化 5組間大鼠ALT、AST、TBil、ALP 水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均<0.001）（表2、圖3）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示，模型組ALT、AST、TBil、ALP 水平均顯著高于正常組（P值均<0.01）；門靜脈（新鮮細胞制劑）組、門靜脈（冷凍細胞制劑）組、尾靜脈（新鮮細胞制劑）組、尾靜脈（冷凍細胞制劑）組ALT、AST、TBil、ALP 水平均顯著低于模型組（P值均<0.01）。

表2 第12周大鼠肝功能檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison of liver function test results of rats at the 12th week

圖3 第12周終點各組肝功能指標結(jié)果比較Figure 3 Comparison the indicators of liver function among groups at the 12th week

2.5 第12 周實驗結(jié)束時大鼠的肝組織病理變化各組染色結(jié)果見圖4。光鏡下觀察HE染色結(jié)果：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)疏松，發(fā)生少許脂肪變，部分細胞變性、壞死，炎癥細胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)分界不清，形成大小不等的多個假小葉結(jié)構(gòu)；門靜脈給藥組有較多肝細胞脂肪變性，結(jié)構(gòu)基本恢復，炎癥細胞少見；尾靜脈給藥組與門靜脈給藥組結(jié)果相近，但有較多的脂肪變性。

Masson 染色結(jié)果：正常組大鼠幾乎未見藍色纖維化帶；模型組大鼠可見明顯藍色纖維化（沉積）條帶；門靜脈給藥組幾乎未見藍色纖維化帶，僅有少量淺藍色的著色部分；尾靜脈給藥組仍然存在部分藍色纖維化帶。

天狼星紅染色結(jié)果：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴張，肝細胞排列正常；模型組可見大量肝小葉被粗細不同的纖維組織分隔包繞，形成假小葉；門靜脈（新鮮細胞制劑）組和門靜脈（冷凍細胞制劑）組少見假小葉，肝中央靜脈之間有纖維間隔相連；尾靜脈（新鮮細胞制劑）組和尾靜脈（冷凍細胞制劑）組的纖維組織較粗和數(shù)量較多，假小葉稍明顯。

3 討論

目前，臨床尚無肝硬化的根治方法，僅通過病因治療、抗纖維化延緩疾病進展［16-17］。在長期以來的研究中，MSC 成為肝硬化或肝纖維化治療的關(guān)注熱點。首先從骨髓MSC 治療肝硬化探索［18］，后續(xù)人臍帶MSC［19-21］、脂肪MSC等［22-24］治療肝硬化的研究相繼出現(xiàn)，且研究結(jié)果積極。既往研究［25］通過大鼠實驗嘗試采用尾靜脈、門靜脈和肝動脈移植骨髓MSC治療肝硬化，結(jié)果顯示不同途徑移植治療效果無顯著差異。而hUC-MSC不僅具有MSC的共性，而且具有更穩(wěn)定的生物學特性，相對容易獲得，來源豐富，抗原性低，不存在倫理問題，是治療肝纖維化和肝硬化的良好選擇，同種異體來源的MSC注射液使用是安全的［26］。

MSC 移植途徑的選擇，可能直接影響移植細胞在肝臟內(nèi)的定植［27］，Huang 等［28］研究結(jié)果表明局部給藥（注入靶組織可提高歸巢效率）后，定植在肝臟的干細胞數(shù)量會比全身給藥多；與靜脈注射MSC 相比，并未產(chǎn)生更好的結(jié)果，這可能與組織和炎癥狀態(tài)有關(guān)［29-30］；以往研究及本研究結(jié)果表明，局部或全身給藥，治療效果無顯著差異。另外有關(guān)資料［31］顯示：新鮮分離的MSC具有較強的歸巢效率和組織修復作用，而臨床試驗中使用的MSC通常是低溫保存的，這損害了MSC的歸巢能力，縮短了其在體內(nèi)和組織修復的耐久性。有文獻［32］報道：新鮮培養(yǎng)的和低溫保存的骨髓MSC 在臨床前的體內(nèi)原代效力和體外傳代效力結(jié)果之間沒有顯著差異。局部和全身給藥的干預效果相近；冰凍保存后對干細胞歸巢和修復作用有一定影響，但是療效和新鮮細胞制劑相比無明顯差異。所以從使用的方便性、安全性與簡繁程度來看，靜脈給予冷凍制劑是符合臨床應用需要的，也可能是未來干細胞制劑的主要類型之一。

hUC-MSC治療肝硬化的可能機制主要基于細胞的旁分泌作用、轉(zhuǎn)分化能力［33］和免疫調(diào)節(jié)功能［34］。其中報道較多是通過TGF-β1/Smad類似信號通路以旁分泌方式發(fā)揮抗纖維化功能［35-36］，抑制TGFβ1/Smad信號通路的激活，起到抗纖維化作用。

綜上，hUC-MSC移植是一種有效的治療肝硬化的方法。經(jīng)外周靜脈途徑移植或門靜脈注射移植（冷凍細胞制劑和新鮮細胞制劑）均可有效改善肝硬化，且兩種移植途徑和兩種細胞制劑治療效果無明顯差異。但結(jié)合實際臨床操作的難易程度及治療費用等問題，更傾向于選擇外周靜脈途徑移植冷凍細胞制劑。隨著未來更多深入的研究，hUC-MSC有望在肝硬化的治療方面發(fā)揮更大作用，成為肝硬化治愈的希望所在，并為以后臨床應用提供參考和依據(jù)。

倫理學聲明：本研究方案于2018年11月12日經(jīng)由上海交通大學實驗動物倫理委員會審批，批號：20181112，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：邱英麒負責課題研究和設(shè)計；姜翠寶負責研究數(shù)據(jù)收集分析，論文撰寫；謝凡、朱宏巖參與研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程；王宏偉提供指導意見，以及論文修改與定稿；於洪亮負責文章校核與修訂。