間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體治療自身免疫性肝炎的研究進(jìn)展

羅龍龍， 王麗菲， 鄭 英， 李 斌， 盧利霞， 李初誼， 于曉輝， 張久聰

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730050

自身免疫性肝炎（AIH）主要表現(xiàn)為高球蛋白血癥、自身抗體陽性和組織學(xué)上界面性肝炎及匯管區(qū)漿細(xì)胞浸潤等［1］。隨著人類生活環(huán)境的改變，診療水平的提高，以及生物制劑的廣泛使用，AIH 發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢，已成為繼病毒性肝炎和代謝脂肪性肝病之后的第三大類肝病［2］。目前臨床上主要采用激素類藥物，同時輔以硫唑嘌呤等藥物治療，但其長期應(yīng)用會引起嚴(yán)重的代謝綜合征、骨質(zhì)疏松、脊柱骨折等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。服用硫唑嘌呤的患者可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、發(fā)熱、胃腸道不適等，最嚴(yán)重的可表現(xiàn)為骨髓毒性。二線藥物適用于對一線治療反應(yīng)不佳或?qū)μ瞧べ|(zhì)激素或硫唑嘌呤的副作用不耐受的AIH 患者，如嗎替麥考酚酯、他克莫司均有較好療效。這些藥物不良反應(yīng)有：神經(jīng)反應(yīng)（震顫，頭痛），腎臟反應(yīng)（高血壓，腎功能不全）以及脫發(fā)等。另外，對于AIH 引起的急性肝衰竭，肝移植是一種有效的治療方法，但其缺陷主要有供體缺乏、手術(shù)創(chuàng)傷大、費用高等［3］。

因此，AIH需要新的治療措施，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）在AIH治療中的潛在優(yōu)勢逐漸突顯。有文獻(xiàn)［4］報道MSC 可向肝臟遷移，分化為肝細(xì)胞，替代受損細(xì)胞進(jìn)而恢復(fù)肝功能。MSC 還可通過其免疫調(diào)節(jié)功能促進(jìn)肝細(xì)胞存活進(jìn)而抑制炎癥。MSC來源外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有類似MSC 的功能，且具有更低的免疫原性、較長的循環(huán)半衰期、良好的滲透性和良好的生物相容性［5］。因此本文就MSC 和MSC-EXO 在自身免疫性肝炎中的研究進(jìn)展作一綜述，以期為AIH 的診治提供新的思路。

1 MSC及其外泌體概述

1.1 MSC MSC 源自出生前胚胎發(fā)育階段的中胚葉和外胚層，存在于多種組織器官，是一種可從骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶和胎盤、外周血以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中分離得到的具有多向分化潛能的干細(xì)胞［6］。MSC 可以調(diào)節(jié)其局部環(huán)境、細(xì)胞通信和釋放多種因子，并參與組織損傷的再生。此外，MSC 具有歸巢能力，可以遷移到損傷部位，具有分化為損傷部位局部成分的能力［7］，并能夠分泌有助于組織再生的趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子［8］。大量證據(jù)表明，MSC 可作用于自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞，通過抑制激活，增殖和分化為效應(yīng)細(xì)胞［9］。因為MSC具有自我復(fù)制、自我更新和無限繁殖的特性，并具有非常強大的免疫調(diào)控和再生的特征，被普遍應(yīng)用到移植物抗宿主疾病、心血管疾病、腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、糖尿病和退行性疾病中［10］。

1.2 外泌體 外泌體是一種直徑為40～160 nm的細(xì)胞外囊泡，富含DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，通過不同的信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞間通信。外泌體含有大量的膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81 和CD9）和 熱 休 克 蛋 白（如Hsp60、Hsp70 和Hsp90）［11］。外泌體由脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種健康細(xì)胞產(chǎn)生和釋放。此外，其還存在于腦脊液、滑膜、血液等多種體液中，在炎癥、抗原呈遞和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用［12］。

研究［13-14］表明，MSC-EXO 通過向受損細(xì)胞或組織傳遞信息參與組織再生，并發(fā)揮類似于MSC的生物活性。不同組織來源的MSC-EXO 具有不同的功能，如人臍帶MSC-EXO 可以表達(dá)標(biāo)志性蛋白CD9 及CD63，能夠通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg）和抑制輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）17參與自身免疫功能調(diào)節(jié)［15］。骨髓MSC-EXO 通過Wnt/β-catenin 途徑減少CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，促進(jìn)肝細(xì)胞再生［16］。因此，可利用MSC-EXO 修復(fù)受損組織，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和發(fā)揮抗炎作用來治療由免疫失衡介導(dǎo)的AIH，以及修復(fù)受損的肝細(xì)胞。

2 AIH的發(fā)病機制

AIH 的具體原因目前尚不明確，但其發(fā)生機制與其自身抗原呈遞后的免疫活化和機體的免疫耐受被打破有關(guān)。

2.1 自身抗原呈遞后的免疫活化 在AIH 期間，CD4+Th0在適當(dāng)?shù)墓泊碳ば盘柎嬖诘目乖蔬f過程中被激活。一旦被激活，Th0通過微環(huán)境中存在的細(xì)胞因子和抗原可以分化成不同的Th細(xì)胞群。在IL-12存在的情況下，Th0 分化為Th1，而IL-4 豐富的環(huán)境則有利于分化為Th2。此外，TGF-β、IL-1 和IL-6 促進(jìn)分化為Th17［17］。每個細(xì)胞亞群都釋放細(xì)胞因子，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致對肝細(xì)胞的自身免疫攻擊（圖1）。

圖1 AIH的發(fā)病機制Figure 1 The pathogenesis of AIH

分化的Th1 可產(chǎn)生IL-2 和IFN-γ，同時激活CTL，后者產(chǎn)生IFN-γ和TNF，肝細(xì)胞接觸IFN-γ會導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子和MHC Ⅱ類分子的異常表達(dá)，從而導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步激活和肝損傷［18］。Th2通過分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞，而B 淋巴細(xì)胞又分泌自身抗體以抗體依賴的細(xì)胞毒補體依賴的方式攻擊正常肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡［19］。Th17 可產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子IL-17、IL-22和TNF 并誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌IL-6 來促進(jìn)自身免疫［20］。但Th17在AIH中的其他作用仍在研究中。

2.2 免疫耐受被打破 自身免疫性疾病是由自我耐受機制的破壞所造成的。Treg在維持免疫耐受方面起著核心作用，并在自身免疫性疾?。òˋIH）中起著關(guān)鍵作用。Treg 作為免疫抑制細(xì)胞，通過分泌免疫抑制細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β和IL-35，以及顆粒酶和穿孔素，抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞和CTL 介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)［21］。Treg 的數(shù)量與疾病活動的標(biāo)志物（如抗可溶性肝抗原抗體和抗肝腎微粒體1抗體）滴度成反比［22］，表明Treg 數(shù)量的減少有利于AIH 發(fā)展。在AIH 中，Treg表達(dá)外核苷三磷酸二酯水解酶1（NTPDase 1，也稱為CD39）的數(shù)量減少，不能充分水解促炎癥的核苷酸，并且不能有效抑制效應(yīng)CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，說明AIH 免疫調(diào)節(jié)缺陷是由于Treg 數(shù)量和功能減少所引起的［23］。AIH 患者肝臟中叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（factor forkhead box P3，F(xiàn)oxP3）增加，特別是在疾病的活躍期，被稱為肝臟中Treg的富集［24］。

最新研究［25］表明濾泡輔助性T 淋巴細(xì)胞（T follicular helper，TFH）在AIH 發(fā)病中也起重要作用，TFH 是輔助性CD4+T 淋巴細(xì)胞的一個亞群，通過產(chǎn)生IL-21 和表達(dá)CD40 配體等刺激分子，能夠誘導(dǎo)成熟漿細(xì)胞中B 淋巴細(xì)胞的激活和分化，分泌免疫球蛋白。IL-21是通過mTOR途徑調(diào)節(jié)Treg的分化和功能，促進(jìn)Th17 的產(chǎn)生，并通過自分泌信號促進(jìn)TFH 的分化。嚴(yán)重的AIH 患者血清中IL-21 的水平非常高，并與疾病活動相關(guān)。

3 MSC移植治療AIH的作用機制

MSC 發(fā)揮其治療作用的具體機制是抑制淋巴細(xì)胞活化和增殖以及促進(jìn)Treg形成（圖2）。MSC通過分泌NO、IL-10、PD-L1、TGF-β1、IL-6、吲哚胺2，3-雙加氧酶、前列腺素E2、肝細(xì)胞生長因子等抗炎因子抑制T淋巴細(xì)胞增殖和CD8+T 淋巴細(xì)胞的活化，并能減輕細(xì)胞毒性［26］。

圖2 MSC移植治療AIH的作用機制Figure 2 Mechanism of action of MSC transplantation for AIH

3.1 MSC抑制自身抗原呈遞后的免疫活化 Chen等［27］研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）移植對實驗性自身免疫性肝炎的治療作用，發(fā)現(xiàn)BMSC 移植，特別是多劑量移植可以上調(diào)肝臟PD-L1 并抑制IL-17 的分泌從而發(fā)揮免疫抑制作用，進(jìn)而改善小鼠肝功能。扁桃體源性MSC 通過PD-L1表達(dá)減弱Th17的分化，直接調(diào)控STAT3的磷酸化［28］。此外，有研究［29］發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的PD-L1 高表達(dá)的MSC-EXO，通過與PD-1 在細(xì)胞表面相互作用成功激活T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的免疫抑制信號。此項研究通過構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎和銀屑病小鼠自身免疫性疾病模型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PD-L1 高表達(dá)的MSC-EXO 可特異性靶向肝臟病變部位，有效調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞亞群之間的平衡，從而減弱AIH的自身免疫性反應(yīng)。

MSC 的免疫調(diào)節(jié)作用不僅是由于可溶性因素的作用，也與細(xì)胞間接觸有關(guān)。MSC 構(gòu)成性地表達(dá)FasL和PD-L1。FasL 可誘導(dǎo)活化的T 淋巴細(xì)胞凋亡，而MSC 表面的PD-L1 與T 淋巴細(xì)胞表面的PD-1 結(jié)合，通過MHCⅡ發(fā)揮免疫抑制作用。MSC 還能分泌IFN-β，增加T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)，加強對T 淋巴細(xì)胞的抑制［30］。

IL-35是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的細(xì)胞因子，其能誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生進(jìn)而限制炎癥反應(yīng)［31］。Wang等［32］在刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型中，通過灌注IL-35-MSC，研究了其在刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC 可以通過減少肝細(xì)胞分泌的IL-17減輕肝損傷，而IL-35-MSC不僅可以減少Th17 分泌IL-17，還可以通過JAK1-STAT1/STAT4信號通路降低Th1上IFN-γ和肝細(xì)胞FasL 的表達(dá)，從而防止肝細(xì)胞凋亡。

3.2 MSC 維持免疫耐受 AIH 發(fā)病機制的核心是免疫調(diào)節(jié)的喪失，其治療應(yīng)該集中于恢復(fù)Treg 擴展的能力，從而增加其數(shù)量和功能。MSC 可以促進(jìn)Treg 的增殖和轉(zhuǎn)化，抑制Th17 的增殖和部分細(xì)胞因子分泌。在炎癥環(huán)境中，MSC 通過分泌IL-10、血凝素-1 和其他抗炎細(xì)胞因子來抑制T 淋巴細(xì)胞的活化和增殖。此外，MSC 也可以分泌TGF-β 等抗炎細(xì)胞因子來促進(jìn)Treg 的增殖和分化［33］。Chen 等［34］發(fā)現(xiàn)MSC 在脂多糖的刺激下可分泌肝細(xì)胞生長因子來誘導(dǎo)完全分化的Th17 向有功能的Treg 轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)了CD4+T 淋巴細(xì)胞群中Th17/Treg平衡。

有研究［35］表明，BMSC能顯著增加Treg的比例，誘導(dǎo)CD4+CD25-細(xì)胞向Treg分化，抑制Th17的分化，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Kim等［36］發(fā)現(xiàn)胎盤源性的MSC通過FoxP3 促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞向Treg 分化。Melief 等［37］研究表明，MSC 分泌TGF-β1 參與了對T 淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，TGF-β1可在T淋巴細(xì)胞受體共刺激下誘導(dǎo)Treg，促進(jìn)單核細(xì)胞活化為Ⅱ型巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-10 進(jìn)一步抑制Th17 的致病性。此外，TGF-β 還可誘導(dǎo)Foxp3 表達(dá)，抑制Th17 的分化，并刺激Treg的發(fā)育。

4 MSC-EXO治療AIH的作用機制

MSC-EXO是一種重要的旁分泌效應(yīng)體，通過攜帶親代細(xì)胞的生物活性物質(zhì)在細(xì)胞間通信中發(fā)揮重要作用。MSC-EXO 包括細(xì)胞質(zhì)、膜蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)、DNA、RNA等，這些分子可轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮其治療作用［38］。MSC-EXO作為無細(xì)胞療法的載體，在自身免疫性疾病的治療中受到廣泛關(guān)注，因為它們不僅具有MSC本身的大部分治療作用，而且降低了引入活細(xì)胞的風(fēng)險。在臨床治療中，MSC-EXO 相比MSC 具有明顯的優(yōu)勢（如損傷組織修復(fù)高效、靶向遞送、安全性高等），未來有可能完全替代MSC 治療［39］。因此，一種使用MSC-EXO 的新型無細(xì)胞療法有望治療AIH。

MSC-EXO 通過特定的miRNA 調(diào)節(jié)肝臟Treg 和Th17 的免疫對AIH 起治療作用。Lu 等［40］發(fā)現(xiàn)攜帶miR-223-3p 的MSC-EXO 可減弱AIH 肝臟中的炎癥反應(yīng)。其機制與miRNA-223-3p 介導(dǎo)的對STAT3 基因和炎性細(xì)胞因子（IL-1β 和IL-6）表達(dá)的調(diào)節(jié)以及Treg/Th17 比值的升高有關(guān)。在BMSC-EXO 中，miR-223 通過下調(diào)實驗性AIH 模型中NLRP3 和caspase-1 的蛋白水平來逆轉(zhuǎn)肝臟炎癥和細(xì)胞死亡，同時降低血清和肝臟組織中促炎癥因子（TNF-α、IL-17A 和IL-1β）的水平。Zhao 等［41］發(fā)現(xiàn)MSC-EXO 作為地塞米松的載體，在肝臟中大量定植，并有效地內(nèi)化到巨噬細(xì)胞，對巨噬細(xì)胞有明顯的抑制作用，進(jìn)而抑制AIH的發(fā)展。

5 小結(jié)與展望

AIH 患者的現(xiàn)有治療方法有限，迫切需要一種新的治療方法。MSC 具有改善組織微環(huán)境、促進(jìn)組織再生的能力，其低免疫原性和高安全性使其成為AIH 最有希望的治療選擇。移植后，MSC 遷移至受損肝臟并進(jìn)行靶向分化，通過外泌體傳遞關(guān)鍵細(xì)胞因子，保護(hù)肝臟，并通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)機制減緩AIH 的進(jìn)展。作為一種新型的無細(xì)胞療法，外泌體可以將多種生物分子輸送至靶細(xì)胞，參與組織修復(fù)和再生，避免MSC過度遷移和致癌的潛在風(fēng)險。盡管MSC 和MSC-EXO 在AIH 動物模型中已經(jīng)顯示出明顯的治療效果，但仍需繼續(xù)深入開展基礎(chǔ)和臨床研究，全面評價MSC 和MSC-EXO 移植治療的安全性和有效性。可以預(yù)見，在研究人員和臨床醫(yī)生的不懈努力下，利用MSC 和MSC-EXO治療AIH將給患者帶來新的希望。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：羅龍龍負(fù)責(zé)檢索文獻(xiàn)，撰寫論文；王麗菲、鄭英、李斌、盧利霞、李初誼參與修改論文；于曉輝、張久聰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。