T淋巴細胞在原發(fā)性硬化性膽管炎中的作用

李子怡， 張萬潔， 王富春， 毛小榮，2a， 李俊峰，2a，2b

1 蘭州大學第一臨床醫(yī)學院， 蘭州 730000； 2 蘭州大學第一醫(yī)院 a. 感染科， b. 感染科與傳染病研究室，蘭州 730000

原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是一種免疫介導的慢性膽汁淤積性肝病，其特征是肝內(nèi)外膽管炎癥及纖維化導致多灶性膽管狹窄、慢性膽汁淤積，可進展為肝硬化及終末期肝病，且患膽管癌的風險增加［1］。目前認為，PSC 的發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境、免疫、腸道微生態(tài)及膽汁酸代謝等因素相關，但具體發(fā)病機制尚不明確。在遺傳學研究上，PSC 與人類白細胞抗原的顯著關聯(lián)表明，其與適應性免疫反應密切相關。且研究［2］發(fā)現(xiàn)，在PSC 患者的肝活檢中，匯管區(qū)炎癥浸潤的主要細胞類型是T 淋巴細胞。因此，T 淋巴細胞介導的免疫應答在PSC發(fā)病中起著重要作用。

T 淋巴細胞來源于骨髓中的多能干細胞，在胸腺中發(fā)育為成熟T 淋巴細胞，再隨血液進入外周淋巴器官，接受抗原刺激，發(fā)生免疫應答。根據(jù)其抗原識別受體（T cell receptor，TCR）的多樣性，T 淋巴細胞可被分為αβ T 淋巴細胞和γδ T 淋巴細胞。除了基于TCR的分類，T 淋巴細胞還可根據(jù)細胞表面共受體分為CD4 和CD8 兩種亞群。這些共受體可通過增強TCR與主要組織相容性復合體的結(jié)合來促進T淋巴細胞的活化。除了表達TCR αβ的常規(guī)T淋巴細胞外，γδ T淋巴細胞、自然殺傷T淋巴細胞（nature killer T cell，NKT）和黏膜相關不變T 淋巴細胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）被稱為非常規(guī)T 淋巴細胞。其中，NKT 細胞表達NK 細胞和T 淋巴細胞表面標志物，MAIT 細胞具有恒定TCR α 鏈，它們分別識別由主要組織相容性復合體Ⅰ類相關分子CD1d呈遞的脂質(zhì)抗原 和MHC-Ⅰ類 相 關 分 子1（MHC class-I-related molecule 1，MR1）呈遞的細菌來源的小分子抗原，均可參與天然免疫和適應性免疫反應［3］（圖1）。本文對T 淋巴細胞亞群在PSC 中的作用機制作一闡述，以期有助于PSC的診斷及治療。

圖1 原發(fā)性硬化性膽管炎中的T淋巴細胞及肝臟異常T淋巴細胞歸巢Figure 1 T lymphocytes in primary sclerosing cholangitis and aberrant homing in the liver

1 CD4+ T淋巴細胞

CD4+T 淋巴細胞通過分泌細胞因子和誘導免疫細胞聚集參與自身免疫性肝病，是PSC 發(fā)病的主要免疫細胞之一。在PSC中，肝內(nèi)CD4+T淋巴細胞數(shù)量增加，聚集在膽管附近，在病原體及細胞因子的刺激下，分化為不同亞型的T 淋巴細胞，如輔助性T 淋巴細胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞（Treg）等，介導促炎反應與抗炎反應的平衡［2］。

早期觀點認為，記憶T 淋巴細胞主要駐留在不同組織中。與記憶T 淋巴細胞相比，幼稚T 淋巴細胞主要在血液和外周淋巴器官之間循環(huán)，很少駐留在肝臟等非淋巴組織中。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種肝病患者肝臟內(nèi)均存在一群肝內(nèi)幼稚樣CD4+T淋巴細胞，如丙型肝炎、酒精性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎等，但在PSC 中尤為明顯。并且這些幼稚樣CD4+T 淋巴細胞傾向分化為Th17，進而分泌白細胞介素（IL）-17 和IL-22等，促進炎癥發(fā)生［2］。

1.1 Th17 Th17是CD4+T淋巴細胞在病原體及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和IL-6 等細胞因子共同誘導分化后的表型，視黃酸相關孤兒核受體γt（retinoic acidrelated orphan nuclear receptor γt，RORγt）是控制Th17分化的關鍵。Th17 主要通過產(chǎn)生特異性細胞因子IL-17介導促炎反應，參與PSC的進程。IL-17是肝臟炎癥和纖維化的關鍵驅(qū)動因子，并與自身免疫性肝病的發(fā)展有關。IL-17可以激活肝肌成纖維細胞和肝星狀細胞，增加炎癥介質(zhì)（如IL-6、IL-1β、TNF-α等）和促纖維化介質(zhì)（如骨膜蛋白、TGF-β等）的產(chǎn)生，進而導致膽管炎癥及纖維化［4］。

近年來研究［5］發(fā)現(xiàn)，與健康對照組和原發(fā)性膽汁性膽管炎相比，PSC 患者外周血和肝臟中Th17數(shù)量明顯增加，伴隨著IL-17 分泌增加。在微生物的刺激下，PSC 患者的單核細胞產(chǎn)生更多的IL-1β 和IL-6，驅(qū)動Th17 分化。IL-1β 有助于激活膽管上皮細胞，當膽管上皮細胞被激活后，除了釋放大量促炎因子IL-6 和IL-23，還分泌高水平的單核細胞及Th17趨化因子C-C基序配體（C-C motif ligand，CCL）2和CCL20，進一步促進單核細胞和Th17 的分化及招募［5-6］。因此，單核細胞、膽管上皮細胞和Th17 的相互作用形成了一個正反饋循環(huán)，使大量Th17聚集在膽管周圍，分泌IL-17等發(fā)揮促炎作用。此外，用RORγt反向激動劑來選擇性地抑制Th17 分化后，雖然不能防止膽管炎癥，但改善了膽管炎模型小鼠的肝膽損傷和纖維化［7］，這也強調(diào)了Th17 在肝臟炎癥中的致病作用。然而，用IL-17A抗體不能阻斷膽管炎模型小鼠的疾病進展［7］，可能是由于Th17 中殘留其他起作用的細胞因子，如IL-17F和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等，這提示了Th17參與PSC發(fā)病機制的復雜性。

1.2 Treg Treg與致炎性Th17作用相反，它在抑制免疫及調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了關鍵作用。Treg表達高親和力的IL-2受體（IL-2 receptor，IL-2R），可以競爭性地與IL-2結(jié)合，進而促進Treg的生成及功能維持。Treg主要通過抑制致病性T淋巴細胞（如Th17細胞和CD8+T淋巴細胞）的表達和分泌抑制性細胞因子IL-10 和IL-35等來發(fā)揮免疫抑制作用，其數(shù)量和功能的失調(diào)均會打破免疫耐受，導致PSC進展［8］。

與健康對照組或其他自身免疫性肝病相比，PSC患者外周血及肝內(nèi)Treg數(shù)量顯著降低［8］。用IL-2R抗體消耗膽管炎模型小鼠肝內(nèi)Treg 后，會增加肝內(nèi)CD8+T 淋巴細胞數(shù)量，進而使TNF-α 和骨橋蛋白等細胞因子增多，加重膽道損傷及纖維化程度。相反，用低劑量IL-2 誘導肝內(nèi)Treg 表達，則增加了CD39+Treg細胞的比例，導致CD8+T 淋巴細胞數(shù)量減少。CD39在炎癥條件下可以穩(wěn)定Treg 的抑制表型，增強其抑制活性［9］。這表明Treg 數(shù)量與PSC 疾病進展有關，Treg數(shù)量下降引起的CD8+T 淋巴細胞的增多可能是導致PSC發(fā)病的原因之一。全基因組關聯(lián)研究在PSC患者中發(fā)現(xiàn)了IL-2 和IL-2RA 的風險等位基因［9］。因此Treg 數(shù)量的降低可能與IL-2RA 基因位點的多態(tài)性有關，但還需要進一步的研究證實。

PSC 患者肝內(nèi)Treg 數(shù)量顯著降低的同時也存在著功能障礙。通過對膽管炎和結(jié)腸炎小鼠模型注射IL-2/IL-2Ab 免疫復合物治療，實現(xiàn)了Treg 在體內(nèi)的擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的結(jié)腸炎得到改善，但膽管炎的嚴重程度并沒有降低。這提示，肝內(nèi)Treg 的抑制功能選擇性地降低。進一步探究其機制后發(fā)現(xiàn)，肝臟中Treg的FoxP3 表達降低，且IL-12Rβ2 表達上調(diào)［10］。FoxP3是Treg的核心轉(zhuǎn)錄因子，能夠上調(diào)IL-2R的表達，增強Treg 對IL-2 的敏感性，進而增加Treg 的數(shù)量并維持正常功能［8，11］。IL-12 是FoxP3 的調(diào)節(jié)因子，可通過結(jié)合表達上調(diào)的IL-12Rβ2，降低FoxP3 的表達，減少IL-2對Treg 的激活，最終導致肝內(nèi)Treg 抑制能力降低［10］。此外，一項臨床研究［12］也發(fā)現(xiàn)，通過自體體外培養(yǎng)Treg并單次回輸來治療1例潰瘍性結(jié)腸炎伴PSC 的患者，結(jié)腸炎得到了長期有效緩解，PSC 短暫緩解后肝功能回復。這表明單次Treg 回輸治療對PSC 短暫有效，Treg 功能的喪失可能與轉(zhuǎn)移的Treg 在肝臟中生存能力降低有關，若想達到PSC 長期緩解，可能需多次的Treg回輸。

綜上，PSC 中Th17 數(shù)量升高，伴隨著Treg 減少，Th17/Treg 的平衡在PSC 的發(fā)病中具有重要意義。FoxP3 位點的甲基化狀態(tài)決定了Treg 群體的穩(wěn)定性，并微調(diào)了Th17/Treg平衡。然而，僅有研究［13］發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性膽汁性膽管炎患者中，F(xiàn)oxP3 啟動子表現(xiàn)出高度甲基化狀態(tài)，并導致Th17/Treg分化軸向Th17傾斜。對于FoxP3 啟動子在PSC 中有無異常，還需要進一步的研究證實。

2 CD8+ T淋巴細胞

CD8+T 淋巴細胞是PSC 膽管中主要的組織駐留淋巴細胞，通過其介導的細胞毒作用，招募炎癥細胞并分泌促炎因子來誘導炎癥發(fā)生［14-15］。通過對肝臟免疫細胞進行定位后發(fā)現(xiàn)，PSC 患者的肝臟中存在著大量CD8+T淋巴細胞，并且主要集中在膽管上皮細胞周圍，是膽道中主要的免疫細胞群。膽管中駐留的CD8+T 淋巴細胞和膽管上皮細胞共同分泌中性粒細胞趨化因子CXCL8，招募中性粒細胞聚集在膽管周圍，介導炎癥反應［14］。此外，CD8+T 淋巴細胞還可以分泌IFN-γ 和TNF-α 來加重膽道損傷［15］。在PSC 患者及膽管炎小鼠模型中，檢測到的大量CD8+T淋巴細胞主要為缺乏CD28表型。CD28是T淋巴細胞的共刺激因子，與CD28+T 淋巴細胞相比，CD8+CD28-T 淋巴細胞內(nèi)含有顆粒酶B 和穿孔素，并且在受到刺激后，IFN-γ 和TNF-α 分泌增加，因而CD8+CD28-T 淋巴細胞毒作用更強。并且CD8+CD28-T 淋巴細胞似乎是一種慢性激活的免疫細胞，不易受到Treg 的調(diào)節(jié)。因此，組織駐留的CD8+CD28-T 淋巴細胞可能是PSC 患者持續(xù)性慢性炎癥的重要驅(qū)動因素［16-17］。

3 γδ T淋巴細胞

γδ T 淋巴細胞作為非常規(guī)免疫細胞，具有先天免疫細胞和適應性免疫細胞的特征。一方面，它可以通過TCR 識別病原體和宿主細胞上的保守結(jié)構(gòu)，包括非肽代謝物和熱休克蛋白；另一方面，它們是雙陰性的，即不表達CD4 和CD8 共受體，因此，它不需要主要組織相容性復合物分子的抗原呈遞，能比αβ T淋巴細胞更快地產(chǎn)生免疫反應。此外，γδ T 淋巴細胞在肝臟中富集，占血液中T 淋巴細胞總數(shù)的2%～10%，而占肝臟T 淋巴細胞總數(shù)的15%～25%。在PSC 患者的外周血和肝臟中，γδ T 淋巴細胞的數(shù)量較正常相比升高，且與膽管炎癥的程度有關。研究［18］發(fā)現(xiàn)，從PSC患者肝臟中提取出來的γδ T淋巴細胞在受到毒素刺激后，傾向分化為能產(chǎn)生IL-17 的γδ T 淋巴細胞亞群，進而生成大量IL-17。并且相較于Th17，γδ T 淋巴細胞可能是肝臟中IL-17的主要提供者。

4 NKT

NKT 在肝臟中含量豐富。研究［19］發(fā)現(xiàn)，肝細胞、肝星狀細胞和膽管上皮細胞等均可以作為抗原呈遞細胞向NKT 呈遞脂類抗原。且在PSC 患者膽汁中，含有可以激活CD1d 的脂類抗原，當脂質(zhì)抗原被膽管細胞吸收并由CD1d 呈遞后，可能激活周圍組織中的NKT。它們可以通過快速產(chǎn)生促炎或抗炎細胞因子，招募并激活其他免疫細胞來指導免疫反應。此外，與健康對照組相比，PSC 的膽管上皮細胞中CD1d 表達下調(diào)，這提示CD1d 依賴的抗原呈遞受到影響，表明NKT 可能在PSC 發(fā)病機制中發(fā)揮作用，但NKT 具體如何參與PSC的發(fā)病仍有待研究［20］。

5 MAIT

MAIT 在PSC 發(fā)病中的具體作用目前尚不清楚。研究［21］表明，PSC 患者的膽汁中存在著能夠激活MAIT 的抗原，膽管細胞將膽道抗原呈遞給MAIT，進而激活MAIT，這可能是PSC 發(fā)病機制中連接免疫系統(tǒng)和微生物組的病理生理途徑之一。MAIT 在PSC 患者中存在著數(shù)量和功能的變化。與健康對照組相比，PSC 的外周血和肝組織中的MAIT 明顯減少，但在膽道中富集，膽道中的MAIT數(shù)量是對應的外周血中的4倍［22］。并且這些MAIT 表現(xiàn)出激活慢和功能衰竭的特征，IFN-γ 和TNF-α 等產(chǎn)生受損，抗菌能力下降，這可能是由于長期暴露于促炎性細胞因子IL-12和IL-18引起的。此外，盡管MAIT 功能下降，但MAIT 在IL-12的重復刺激下，能夠上調(diào)RORγt 的表達，產(chǎn)生大量的IL-17A，進而激活肝星狀細胞，介導炎癥及纖維化的進展［23］。

6 T淋巴細胞歸巢

淋巴細胞歸巢是指外周循環(huán)中的淋巴細胞被選擇性地招募到次級淋巴器官和外周組織，介導免疫反應的過程。在炎癥性腸病中，腸道相關淋巴組織中的樹突狀細胞識別病原體后，激活幼稚T 細胞表達“歸巢受體”，即趨化因子受體CCR9 和整合素α4β7，它們分別與血管內(nèi)皮細胞表面的“地址素”、趨化因子配體CCL25 和內(nèi)皮黏附分子MAdCAM-1 識別并結(jié)合，進而引導T 淋巴細胞進入固有層，完成對T 淋巴細胞的招募［24］。在生理條件下，CCL25 和MAdCAM-1 的表達主要局限于腸道的血管內(nèi)皮細胞。因75%的PSC患者常患有炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）［25］，近年來研究［24］發(fā)現(xiàn)PSC 與IBD 中存在一個共同的腸-肝免疫軸。在PSC 患者的肝竇內(nèi)皮細胞上，也可表達腸道中的CCL25 及MAdCAM-1，招募腸道來源的T 淋巴細胞，隨后在CXCL12 的驅(qū)化作用下，將其募集到膽管周圍，介導PSC的進展（圖1）。

然而，最近的研究對這一發(fā)現(xiàn)提出了挑戰(zhàn)。一項多中心研究［26］通過應用維多利珠單抗（α4β7整合素抗體）阻斷α4β7介導的CD4+T淋巴細胞向腸道和肝臟的募集，來治療IBD-PSC 的成年患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維多利珠單抗治療可改善炎癥性腸病的癥狀，但堿性磷酸酶等肝臟生化指標和梅奧風險評分等均未出現(xiàn)顯著變化。這表明T淋巴細胞向肝臟的運輸并不主要依賴于α4β7。另有研究［25］報道，在75%的慢性肝病患者肝臟中，均發(fā)現(xiàn)MAdCAM-1免疫反應陽性。與正常肝臟相比，所有慢性肝病患者的CCL25 和MAdCAM-1 的mRNA 表達均增加，并誘導了表達α4β7 和CCR9 的CD4+T 淋巴細胞的組織浸潤。這些研究［25，27］表明T淋巴細胞歸巢可能并不是PSC 特有的發(fā)病機制，而是慢性肝病的一種特征。

7 問題與展望

盡管目前對PSC 的發(fā)病機制有了一定的了解，且越來越多研究證實T淋巴細胞參與了PSC的發(fā)生與發(fā)展，可能有助于PSC 的治療，但T 淋巴細胞數(shù)量繁多、種類復雜，對于其發(fā)揮的促炎與抗炎作用仍存在疑問：首先，Th17/Treg 在PSC 發(fā)病過程中涉及信號通路及分子層面上的具體機制尚未明確，異常淋巴細胞歸巢是否是PSC 發(fā)病的關鍵機制還存在爭議；其次，針對T 淋巴細胞靶向治療的藥物在膽管炎動物模型上取得了一定的進展，但能否應用于臨床還需要多中心、大樣本的研究。因此，未來仍需更進一步的研究來明確PSC 發(fā)病的關鍵機制，闡明T 淋巴細胞在PSC中的生物學功能及潛在意義，并為尋找合適的治療靶點提供新的思路。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李子怡、毛小榮、李俊峰對文章的思路和設計有關鍵貢獻，并參與修改文章關鍵內(nèi)容；李子怡、張萬潔、王富春均參與了文獻檢索及起草文章初稿。