齊墩果酸鹽的選擇及理化性質(zhì)研究

王路，施斌，孫晨，尹民，關凱琳，賀敦偉,*

（1.中國海洋大學 醫(yī)藥學院，山東青島 266003；2.則正（上海）生物科技有限公司，上海 201807）

處方前研究旨在提供藥品研究中所需的必要數(shù)據(jù)（特別是原輔料和包裝材料的物理化學、物理機械力學和生物藥劑學特性），這些數(shù)據(jù)可能會影響處方設計、原料藥和藥品的生產(chǎn)方法，最終影響產(chǎn)品的藥代動力學、生物藥劑學特性以及產(chǎn)品的包裝穩(wěn)定性。

在大型制藥公司，有許多指導方針和標準來確定化合物的物理化學性質(zhì)是否良好。在所有重要的物理化學性質(zhì)中，熔點、分解起始溫度、顆粒的形態(tài)和粒徑、晶癖、結(jié)晶度、吸濕性、固體穩(wěn)定性、溶解度和滲透性是最重要的因素。

為了更好地了解預配方在藥物開發(fā)中發(fā)揮的作用，本研究選擇了齊墩果酸（OA）作為候選藥物進行物理和化學表征。齊墩果酸廣泛存在于多種植物中，OA 及其衍生物具有抗真菌、抗病毒、利尿、降血糖和抗腫瘤以及護肝和抗炎等藥理作用[1-4]。根據(jù)團隊前期觀測結(jié)果（未發(fā)表），在X 射線粉末衍射（XRPD）中原料藥表現(xiàn)了較差的結(jié)晶性，在差示掃描熱量法（DSC）中出現(xiàn)了冷結(jié)晶，在熱重分析（TGA）中，從環(huán)境溫度到120 ℃重量損失為1.593%，這可能是由于晶格中的溶劑或者水的損失導致。經(jīng)動態(tài)水蒸氣吸附（DVS）試驗證實，在相對濕度為95%的條件下，該化合物的吸濕率為4.43%。OA 在pH 值為1 ～6的緩沖液中的溶解度小于0.001 mg/mL，在模擬胃液（SGF）、禁食狀態(tài)小腸液（FaSSIEF）和飽食狀態(tài)小腸液（FeSSIF）中的溶解度分別為0.081 mg/mL、0.001 mg/mL 和0.038 mg/mL。在人結(jié)直腸腺癌細胞（Caco-2）模型中測得的表觀滲透率為1.2×10-6cm/s。油水分配系數(shù)（LogP）和藥物解離常數(shù)（pKa）分別為4.67 和2.52。在臨床上使用的劑量是30 ～50 mg。根據(jù)溶解度、劑量（40 mg）和滲透率數(shù)據(jù)，計算出溶解度數(shù)（Dn）為1.510 9，劑量數(shù)（Do）為4.210 5，滲透性數(shù)（An）為1.340 0。根據(jù)生物制藥分類系統(tǒng)（BCS）的定義，OA 為BCS Ⅱ（高滲透性和低溶解性）化合物。對于這種化合物，溶解度和溶解性可能限制其吸收。此外，在晶型篩選中，OA 可以形成水合物、甲醇溶劑化物、乙醇溶劑化物和異丙醇溶劑化物。根據(jù)以上表征結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OA 存在結(jié)晶度差、水合物和溶劑化物形成能力強以及溶解度較低等問題。

為了改善OA 的物理化學性質(zhì)，計劃對化合物進行重結(jié)晶和成鹽反應，并對所有鹽的理化性質(zhì)進行表征；采用Johnson 法和Gastroplus 軟件，以滲透性、溶解度、溶出系數(shù)、粒徑及其logP 和pKa 為輸入數(shù)據(jù)，計算最大吸收劑量（MAD)。

1 材料與方法

1.1 材料

齊墩果酸，純度99.0%，成都超人植物化工發(fā)展有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、甲乙酮，分析純，上海潤捷化學試劑有限公司；膽堿，分析純，鄭州浩力化工有限公司；氫氧化鉀（KOH），85%，美國Alfa Aesar公司；無水哌嗪，99%，美國Alfa Aesar 公司；異丙醇（IPA）、甲醇，色譜級，美國Sigma-Aldrich 公司；乙腈（ACN），色譜級，美國Burdick & Jackson 公司；乙酸乙酯，分析純，美國Fisher 公司；乙二胺，分析純，比利時Acros 公司。

Q1000 DSC 儀、Q500 熱重分析儀，美國TA 公司；S40K 型pH 計、MX5 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；水冷ZX98-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海魯伊工貿(mào)有限公司；SHB-S ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設備有限公司；DMLP 偏振光顯微鏡，德國Leica 公司；labquaker 三維旋轉(zhuǎn)振蕩器，美國Thermo Scientific 公司；1200 高效液相色譜（配備DAD 檢測器）、XDB-d C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，粒徑 5μm），美國Agilent 公司。

1.2 OA 的重結(jié)晶

稱量99.1 mg 齊墩果酸至20 mL 容量瓶中，加入4.0 mL 水飽和乙酸乙酯。將樣品在大約55 ℃下攪拌，緩慢加入7 mL 乙腈作為反溶劑直至曇點。樣品慢慢冷卻至大約25 ℃后，通過真空過濾將固體分離，在真空干燥箱中45 ℃干燥過夜，收率為74.97%。其中，收率=目的產(chǎn)物實際生成量/目的產(chǎn)物理論生成量×100%=生成目的產(chǎn)物的原料量/原料進料量×100%（下同）。

1.3 OA 鹽的合成

取5 個20 mL 容量瓶，分別加入169.2 mg、115.0 mg、112.1 mg、114.8 mg、210.9 mg 重結(jié)晶齊墩果酸，然后分別加入5.885 mL 甲乙酮、4.000 mL 甲乙酮、4.000 mL異丙醇、3.000 mL 水飽和乙酸乙酯、8.000 mL 異丙醇。將5 份樣品在55 ℃下攪拌，分別加入370 μL 的1 mol/L NaOH水溶液、250 μL的1 mol/L KOH水溶液、1 000 μL 的0.25 mol/L 哌嗪甲醇溶液、500 μL 的0.25 mol/L 乙二胺甲醇溶液、460 μL 的1mol/L 膽堿水溶液。晶體逐漸析出形成懸浮液，將5 份樣品55 ℃繼續(xù)攪拌3 h，然后慢慢冷卻到25 ℃。通過真空過濾分離固體，并在真空干燥箱中45 ℃干燥過夜，分別得到OA 的鈉鹽、鉀鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽、膽堿鹽，收率依次為85.22%、87.74%、76.40%、45.52%、81.24%。

1.4 結(jié)構表征

1.4.1 X 射線粉末衍射（XRPD）分析

工作電壓：40 kV；工作電流強度：40 mA；檢測器：LynxEye 檢測器；掃描角度（2θ）：4°～40°；步長值為0.05°；掃描速度為0.05°/s；分析軟件：MDI Jade 軟件。

1.4.2 偏光顯微鏡

顯微照片通過佳能Power Shot S80 數(shù)碼相機連接偏振光顯微鏡獲得，其中目鏡放大10 倍，物鏡放大20 倍。粒徑用徠卡有限公司的測微尺（每格10 μm）測量。

1.5 理化性質(zhì)表征

1.5.1 DSC/TGA 分析

（1）差示掃描量熱：樣品（2 ～3 mg）在非密封鋁鍋中以5 ℃/min 的速率從25 ℃加熱到300 ℃。（2）熱重分析：樣品（約10 mg）在開放式鋁盤中以5 ℃/min 的速率從25 ℃加熱到300 ℃，氮氣流速為60 mL/min。

1.5.2 溶解度測定

在25 ℃下測定化合物在SGF、FaSSIF 和FeSSIF中的溶解度。過量的活性藥用成分（API，2 mg）懸浮在液體（1 mL）中，在三維旋轉(zhuǎn)振蕩器上恒溫旋轉(zhuǎn)（250 r/min）16 h，樣品用0.45 μm 孔徑濾膜過濾，并記錄濾液/上清液的pH 值。用高效液相色譜法分析濾液濃度。

1.5.3 DVS 分析

水分吸附-解吸等溫線采用動態(tài)蒸汽吸附儀測定。稱取約10 mg 樣品在25 ℃下用干燥氮氣進行預干燥。相對濕度按照5%/min 的速度由0 升至95%或75%再降回到0%；增重平衡標準：設定每步相對濕度5 min 內(nèi)達到重量變化率（dm/dt）小于0.01%即為平衡；最長平衡時間：120 min。

1.5.4 水/水-有機相混懸平衡實驗

每個10 mL 容量瓶中分別放入約25 mg 的化合物，分別加入400 μL 水、乙酸乙酯-水（體積比97.06 ∶2.94）和異丙醇-水（體積比4 ∶1）溶液。將小瓶密封并在旋轉(zhuǎn)儀上以250 r/min 的轉(zhuǎn)速25 ℃旋轉(zhuǎn)70 h，樣品經(jīng)過干燥后為固體粉末，進行XRD分析。

1.5.5 固體穩(wěn)定性研究

將樣品在40 ℃、50 ℃、70 ℃、40 ℃/75%RH、50 ℃/75%RH 條件下分別存放7 d 和14 d，進行穩(wěn)定性研究。保存結(jié)束后放置于-20 ℃的冰箱中，用高效液相色譜儀進行含量、溶解度測定，以評估化學穩(wěn)定性。在不同的時間間隔測定DSC 和XRPD 以確定藥物的化學和物理穩(wěn)定性。

1.5.6 色譜條件

進樣量10 μL，EZchromElite 軟件控制色譜系統(tǒng)。流動相A 為0.025%三氟乙酸乙腈溶液，流動相B 為0.025%三氟乙酸水溶液，流動相組成為A∶B=80∶20。流速為1 mL/min，檢測波長為215 nm。

樣品制備：精密稱定25 mg 樣品，置100 mL 容量瓶，加入適量乙醇溶解樣品后稀釋定容，搖勻后得樣品溶液。

1.5.7 最大吸收劑量計算

本研究采用一種相對簡單的方法（Johnson 模型）來計算最大吸收劑量，如公式（1）～（3）所示[5-6]。

式中，MAD為最大吸收量，mg；S為pH=6.5（FaSSIE）或5.5（FeSSIE）時的溶解度，mg/mL；Ka為經(jīng)腸吸收速率常數(shù)，min-1；VSIW為小腸水容量，取250 mL；TSIT為小腸轉(zhuǎn)運時間，取270 min；Peff為人體有效滲透率；R為人體小腸半徑，取1.5 cm；PCaco-2是Caco-2模型中的表觀滲透系數(shù)。為對比不同模型的計算差異，另外采用本團隊開發(fā)的基于生理的藥代動力學（BSPK）模型對MAD進行模擬，其中小腸轉(zhuǎn)運時間取值為1 440 min，包括胃排空時間15 min，小腸通過時間200 min，大腸通過時間1 225 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 重結(jié)晶OA 及其鹽的結(jié)構和基礎理化特性

OA 及其鹽的結(jié)晶形式見表1 和圖1 ～圖4。對于OA 重結(jié)晶樣品，此晶型有某種不明晶癖，粒徑為10 ～50 μm，從25 ℃升溫到127 ℃時失重為0.28%；該晶型在311.51 ℃開始熔化；吸濕性強，在0 ～75%相對濕度范圍吸濕增重為0.501 3%，在0 ～95%相對濕度范圍吸濕增重為0.601 8%。5 種OA 鹽晶體中哌嗪鹽吸濕情況較為樂觀（低于重結(jié)晶樣品），因此選擇OA 哌嗪鹽進行后續(xù)表征分析。OA 哌嗪鹽從25 ℃升溫到187 ℃失重1.469%。在219.35 ℃時出現(xiàn)明顯的吸熱峰，此時TGA 失重10.23%。在311.90 ℃出現(xiàn)另一個吸熱峰，該峰可能是失去哌嗪后的游離OA 熔化產(chǎn)生。

圖2 樣品的DSC/TGA 熱圖

圖3 樣品的XRPD 圖

圖4 樣品的DVS 等溫線

表1 OA 及其鹽類的結(jié)構和基礎理化特性

2.2 溶解度

如圖5 所示，OA 在SGF、FaSSIF 中的溶解度很差；雖然是游離酸，但OA 在SGF 中的溶解度高于FaSSIF 和FeSSIF，說明十二烷基硫酸鈉的加入比卵磷脂和?；悄懰岬缺砻婊钚詣└茱@著提高OA 的溶解度。在SGF 中，OA 鈉鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽和膽堿鹽的溶解度也有所提高。在FaSSIF 中，OA 鈉鹽和乙二胺鹽的溶解度分別大幅提高了約562 倍和318倍。在FeSSIF 中，OA 鈉鹽、鉀鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽和膽堿鹽的溶解度分別提高了16.76、0.37、4.55、4.50、10.97 倍。就溶解度而言，OA 鈉鹽、OA 膽堿鹽是最佳的候選鹽型。

圖5 OA 哌嗪鹽的水/水-有機混合物混懸平衡XRPD 圖

圖6 OA 不同鹽型的溶解度

2.3 OA 哌嗪鹽的水/水-有機混合物混懸平衡試驗

原始樣品和水/水有機混合物漿體樣品之間的XRPD 圖譜無顯著差異，表明該化合物在漿料（83%～100%水活度）中相當穩(wěn)定，見圖5。

2.4 OA 哌嗪鹽的固體穩(wěn)定性

OA 哌嗪鹽在所選實驗條件下均表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性（見表2），含量沒有明顯下降，HPLC 圖譜顯示有關物質(zhì)總量沒有明顯增加，即雜質(zhì)未明顯增加。在極端條件下（包括70℃和50℃/75%RH）暴露的樣品的DSC 圖也基本沒有變化（未展示）。

表2 OA 哌嗪鹽的固體穩(wěn)定性

2.5 OA 哌嗪鹽的最大吸收量

采用Johnson 模型和BSPK 模型計算的MAD，如表3 所示。Johnson 模型中，粒徑設置為10 μm；擴散常數(shù)為0.000 005 cm2/s；當顆粒半徑小于30 μm 時，擴散層厚度等于顆粒半徑；若顆粒半徑不小于30 μm，則擴散層厚度為30 μm；固體藥物濃度為1 200 mg/cm3[6]。BSPK 模型中，不考慮顆粒半徑范圍，固定擴散層厚度等于顆粒半徑；其余條件與Johnson 模型一致。

表3 根據(jù)臨床所需劑量（40 mg）計算MAD

結(jié)果表明，Johnson 模型和BSPK 模型計算的禁食狀態(tài)下的重結(jié)晶樣品MAD分別為0.46 mg 和0.33 mg，遠低于臨床給藥劑量40 mg。然而，攝食后MAD顯著升高，分別達到17.30 mg 和21.41 mg。但該MAD仍不能滿足臨床平均40 mg 的需求。而OA 哌嗪鹽的MAD在Johnson 模型模擬的空腹和飽腹狀態(tài)下分別達到24.13 mg 和78.75 mg，在BSPK 模型模擬的空腹和飽腹狀態(tài)下分別達到30.04 mg 和94.87 mg。因此，隨著飽腹狀態(tài)下溶解度的提高，OA 哌嗪鹽可應用于臨床，40 mg 時吸收率可達91%。

3 結(jié)論

本文以OA 為模型藥物，合成了鈉、鉀、哌嗪、乙二胺和膽堿的OA 鹽，在五種鹽類中，哌嗪鹽具有較低的吸水性，在95% RH 環(huán)境下，其吸水率為0.247 4%，其他鹽類在5%～80% RH 環(huán)境下可形成水合物。與游離酸相比，哌嗪鹽在SGF、FaSSIF 和FeSSIF 中的溶解度分別提高了6.80 倍、53.00 倍和4.55 倍。在BSPK 模型模擬的飽腹狀態(tài)下，10 μm 粒徑下OA 哌嗪鹽的MAD達到94.87 mg。OA 可用于臨床使用劑量為40 mg，吸收率高達91%。這為進一步開發(fā)OA哌嗪鹽的制劑奠定了基礎。