不同品種蘆薈中蘆薈苷的抗氧化活性研究

曾小彤，石麗平,2，陶洪坤,3，林勁松，王怡，魏偉

（1.四川文理學院，四川達州 635000；2.西南醫(yī)科大學，四川瀘州 646099；3.成都大學，四川成都 610106）

蘆薈是一種多年生百合科草本植物，富含多種活性物質(zhì)，在醫(yī)療、美容、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。蘆薈苷是蘆薈中蒽醌類化合物的代表活性成分之一，具有抗氧化、抗菌等作用[2]。常見的藥食兩用蘆薈有庫拉索蘆薈、中華蘆薈、木立蘆薈等，蘆薈因其品種不同，有效成分和含量可能存在差異[3]。陳丹等[4]采用電子自旋共振法檢測蘆薈苷清除超氧陰離子自由基的能力，發(fā)現(xiàn)蘆薈苷具有良好的清除超氧陰離子自由基的作用。本研究采用超聲波法提取蘆薈苷，并對其抗氧化活性進行評價，為蘆薈作為藥用植物資源的進一步開發(fā)與研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮庫拉索蘆薈、新鮮中華蘆薈、新鮮木立蘆薈，網(wǎng)購；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS，98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH，98%）、蘆薈苷標準品（95%），上海源葉生物科技有限公司；1,2-二硝基苯（98%），阿達馬斯試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將3 種新鮮蘆薈葉片洗凈剪碎，冷凍干燥，研磨成粉末，過100 目篩，密封并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 蘆薈苷提取液制備

超聲波提取制備蘆薈苷提取液參考吉慧杰等[5]的方法，并做了適當修改。稱取3 種樣品各1 g，以95%乙醇為提取劑，按1 ∶30（g ∶mL）的料液比，于35 ℃超聲提取30 min。提取兩次，合并上清液，濃縮，置于50 mL 容量瓶中用乙醇定容至刻度線，得到蘆薈苷提取液[中華蘆薈蘆薈苷提取液（ALZs）、木立蘆薈蘆薈苷提取液（ALMs）、庫拉索蘆薈蘆薈苷提取液（ALKs）]。

1.3.3 蘆薈苷含量測定方法

蘆薈苷標準曲線的繪制參考吉慧杰等[5]的方法。精密稱取蘆薈苷標準品2 mg，以95%乙醇為溶劑，配制成0.02 mg/mL 的標準溶液。分別移取蘆薈苷標準溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL 定容于10 mL 容量瓶中，混合均勻，稀釋為0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL、0.006 mg/mL、0.007 mg/mL、0.008 mg/mL、0.009 mg/mL、0.010 mg/mL。分別移取ALZs、ALKs 和ALMs 1 mL 于25 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度線，搖勻，靜置，于360 nm 處測定吸光度。以蘆薈苷溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（回歸方程為Y=47.588X+0.000 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7），并根據(jù)蘆薈苷標準曲線方程計算3種蘆薈中蘆薈苷的含量。

1.3.4 蘆薈苷提取液的抗氧化活性評價

綜上所述，孕中期GDM患者容易發(fā)生嚴重的糖脂代謝異常，并且血漿纖維蛋白原水平明顯升高可能會加重患者糖脂異常，同時患者BMI、空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白-膽固醇是影響纖維蛋白原的獨立危險因素，這亦提示檢測血漿纖維蛋白原水平對評估孕中期GDM疾病發(fā)生與發(fā)展具有重要的預(yù)測價值。

（1）DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定方法參考文獻[6]。各取2 mL 不同質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的樣品溶液，快速加入2 mL預(yù)處理好的DPPH乙醇溶液（質(zhì)量分數(shù)為0.004%）?；旌暇鶆颍谑覝叵卤芄忪o置30 min，在517 nm 處檢測混合液的吸光度。等質(zhì)量濃度Vc 溶液作為陽性對照品，按照公式（1）計算蘆薈苷樣品DPPH 自由基清除率。

式中：X為DPPH 自由基清除率，%；A0為等體積乙醇代替樣品與DPPH 乙醇溶液的吸光度值；A1為樣品與DPPH 乙醇溶液的吸光度值；A2為樣品與不含DPPH 的乙醇溶液的吸光度值。

（2）ABTS 自由基清除率的測定

ABTS自由基清除率的測定參考王榮等[7]的方法。精密吸取梯度濃度樣品溶液（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）100 μL 和ABTS 自由基水溶液100 μL 作為實驗組；以100 μL 95%乙醇代替ABTS 自由基水溶液作為對照組；以加入100 μL ABTS 自由基水溶液和100 μL 95%乙醇為標準組，避光反應(yīng)30 min，在734 nm 下測定吸光度。等質(zhì)量濃度Vc 溶液作為陽性對照品，按照公式（2）計算蘆薈苷樣品ABTS 自由基清除率。

式中：Y為ABTS 自由基清除率，%；B1為實驗組的吸光度值；B2為對照組的吸光度；B3為標準組的吸光度。

（3）羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定參考蔣文明[6]的方法。取不同質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的樣品溶液1 mL，加入1 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液1 mL、9 mmol/L 的雙氧水溶液1 mL 和3 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液1 mL。分別將其混合均勻后，于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，在510 nm 波長下測定吸光度?？瞻讓φ諡? mL 蒸餾水代替樣品溶液，等質(zhì)量濃度Vc 溶液作為陽性對照品，按照公式（3）計算蘆薈苷樣品羥基自由基清除率。

式中：Z為羥基自由基清除率，%；C0為空白對照溶液的吸光度值；C1為樣品的吸光度值。

（4）還原能力測定

根據(jù)YEN 等[8]的研究確定了還原力的測定方法。將不同質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的樣品溶液1 mL加入試管中，再加入2.5 mL 0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和2.5 mL 的鐵氰化鉀溶液（1%）。振蕩均勻后，在50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min。待反應(yīng)完成后冷卻至室溫，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%），0.4 mL 三氯化鐵溶液（1%）和4 mL 蒸餾水，靜置反應(yīng)10 min，3 500 r/min 離心5 min，分取上清液，在700 nm 波長下測吸光度?？瞻讓φ諡? mL 蒸餾水代替樣品溶液，等質(zhì)量濃度Vc 溶液作為陽性對照品，蘆薈苷樣品還原能力吸光值=空白組溶液吸光值-樣品組吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆薈苷含量測定

3 個品種的蘆薈苷含量如表1 所示。3 個品種蘆薈中蘆薈苷含量的大小順序為ALMs ＞ALZs ＞ALKs，蘆薈苷含量最高的為木立蘆薈[（9.02±0.0124）mg/g]。

表1 不同品種蘆薈中蘆薈苷含量

2.2 不同品種蘆薈苷抗氧化活性比較

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

不同樣品對DPPH 自由基的清除效果如圖1 所示。不同濃度的ALZs、ALKs 和ALMs 均對DPPH 自由基有明顯的清除作用。在0.2 ～6.4 mg/mL，3 個樣品的DPPH 自由基清除率均低于對照品Vc；在1.6 ～3.2 mg/mL，其清除能力大小順序為ALZs＞ALKs＞ALMs；當濃度為6.4 mg/mL 時，ALZs 和ALMs 的清除能力相當，分別是96.70%和96.27%，略低于VC（99.74%），高于ALKs（90.25%）。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分別是0.05 mg/mL、0.78 mg/mL、1.09 mg/mL 和1.21 mg/mL。綜上所述，不同品種蘆薈中的蘆薈苷對DPPH 自由基的清除作用不同，中華蘆薈苷提取物對DPPH 自由基清除存在一定優(yōu)勢。

圖1 不同樣品的DPPH 自由基清除能力

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

ABTS 法是一種被廣泛用于檢測物質(zhì)體外抗氧化能力的方法，不同樣品對ABTS 自由基的清除效果見圖2。3 種蘆薈苷樣品在不同濃度下對ABTS 自由基的清除能力均呈濃度依賴性。在0.4 ～1.6 mg/mL，ALZs 清除ABTS 自由基的能力較強；在1.6 ～3.2 mg/mL，ALMs 清除ABTS 自由基的增速加快；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALZs和ALMs 的清除能力相當。當樣品濃度為6.4 mg/mL時，ALMs、ALZs 和ALKs 的清除率分別為94.78%、94.04% 和92.45%。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分別是0.09 mg/mL、0.24 mg/mL、0.25 mg/mL和0.31 mg/mL?？傮w上看，中華蘆薈苷提取物對ABTS自由基清除存在一定優(yōu)勢。

圖2 不同樣品的ABTS 自由基清除能力

2.2.3 羥基自由基清除能力

羥基自由基能導(dǎo)致鄰近生物分子的氧化損傷，因此清除羥基自由基對細胞或食物系統(tǒng)的抗氧化防御具有重要意義。不同樣品對羥基自由基的清除效果如圖3 所示，不同濃度的樣品均對羥基自由基有明顯的清除作用，且呈濃度依賴趨勢。3 種提取物的羥基自由基清除率均低于VC，在0.2 ～1.6 mg/mL，ALMs、ALKs 的清除能力相當；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALZs 上升趨勢較為明顯，且ALZs 清除羥基自由基的能力優(yōu)于ALMs、ALKs；當濃度為6.4 mg/mL 時，ALZs、ALMs 和ALKs 的清除率分別為74.03%、67.96%和63.17%。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分別是0.04 mg/mL、1.35 mg/mL、1.70 mg/mL 和1.72 mg/mL。綜上，中華蘆薈苷提取物在清除羥基自由基方面存在優(yōu)勢。

圖3 不同樣品的羥基自由基清除能力

2.2.4 還原能力

還原能力法也是一種常見的抗氧化性評價方法，吸光度大小能反映樣品的還原能力大小，吸光度越大，還原能力越強，抗氧化性越強。如圖4 所示，隨著樣品濃度的增加，樣品的還原能力增強。在0.8 ～1.6 mg/mL，ALZs 還原能力優(yōu)于ALMs、ALKs，但在高濃度條件下還原能力的增速減慢；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALMs 還原能力要優(yōu)于ALZs、ALKs；當樣品濃度為6.4 mg/mL 時，ALMs、ALZs 和ALKs 的吸光值分別是0.08、0.04 和0.02?？傮w上，不同品種的蘆薈苷還原能力存在差異，高濃度情況下，木立蘆薈苷提取物的還原能力存在優(yōu)勢。

圖4 不同樣品的還原能力

3 結(jié)論

本文以3 種新鮮蘆薈為原料，采用超聲提取法制備得到蘆薈苷乙醇提取液（ALZs、ALMs、ALKs），并通過對DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羥自由基清除能力以及還原能力的測定評價其抗氧化活性。結(jié)果表明，不同品種中蘆薈苷的抗氧化活性存在差異，且中華蘆薈中蘆薈苷在清除DPPH 自由基、ABTS 自由基以及羥基自由基方面存在一定的優(yōu)勢。但根據(jù)含量測定與活性評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆薈苷的含量與活性之間未呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，例如木立蘆薈的蘆薈苷含量要高于中華蘆薈，但是中華蘆薈的DPPH 自由基清除能力和羥基自由基清除能力要明顯高于木立蘆薈，這可能是因為天然蘆薈苷存在兩種同分異構(gòu)體（蘆薈苷A 和蘆薈苷B），可能還包含其他結(jié)構(gòu)類型的蘆薈苷類化合物[9]。而本研究所得蘆薈苷為粗提混合物，尚未進行進一步的分離與純化，缺乏結(jié)構(gòu)與活性的相關(guān)性研究，后期將對其進行進一步的分離純化、結(jié)構(gòu)分析，以期得到結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。