鳳仙花提取物對(duì)灰指甲主要致病菌的抑制作用

劉夢(mèng)雅，羅林焱，孫志彬，胡曉倩，李有鵬，胡煥煥，姬國(guó)杰

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 干細(xì)胞研究院，河南新鄉(xiāng) 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南新鄉(xiāng) 453000）

甲真菌病是指（趾）甲的真菌病，導(dǎo)致患者指甲板變色和增厚，是全世界最常見(jiàn)的指（趾）甲感染。引起灰指甲的致病菌主要有白色念珠菌和紅色毛癬菌等。白色念珠菌是定植于人體皮膚表面及開(kāi)放性腔道（口腔、消化道及泌尿生殖道）的共生菌群，在一定條件下可引起局部上皮甚至全身感染[1-2]。紅色毛癬菌是一種常見(jiàn)的親人性致病性皮膚癬菌[3]，有研究指出皮膚癬菌病中90%的慢性感染都由其所致[4]。目前，針對(duì)甲真菌病的治療方法主要有口服抗真菌藥物、局部藥物和激光等，但口服抗真菌藥物副作用較大[5]；依非那康唑、塔瓦博洛等局部治療藥物治愈率普遍較低，治療周期長(zhǎng)；激光有助于改善指（趾）甲外觀。同時(shí)，由于治療的研究方法和定義的高度變化性，以上方法對(duì)甲真菌病的有效性尚未得到充分證明[6]。因此，迫切需要高效、副作用低的新型藥物。

中草藥已成為開(kāi)發(fā)抗真菌藥物的一個(gè)重要材料[7-9]。鳳仙花不僅是觀賞花卉，而且還是一種中草藥[10]。我國(guó)中醫(yī)學(xué)研究表明，鳳仙花在抑制真菌方面有較好的效果，可以抗感染、鎮(zhèn)痛、抗炎等[11]，也經(jīng)常被用于治療蛇咬傷、鵝掌風(fēng)、癰癤瘡疔、灰指甲等病癥[12]，化學(xué)成分主要有黃酮、萘醌、花青素等[13]。目前，國(guó)內(nèi)外主要研究鳳仙花的化學(xué)成分，其中萘醌類(lèi)具有明顯的抑菌活性[14]，但其抑菌機(jī)制不詳，同時(shí)也缺少對(duì)鳳仙花資源的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

鳳仙花對(duì)白色念珠菌和紅色毛癬菌治療療效顯著，因其價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上具有一定的研究?jī)r(jià)值。本文首先對(duì)鳳仙花的有效成分進(jìn)行提取和富集，并探討其體外抑菌活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究，為開(kāi)發(fā)新型中藥抑菌藥物提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為治療灰指甲等皮膚疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LS-75HJ 立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TS-300DC 恒溫?fù)u床，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；U/V110Pro紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；JY10002 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GT16-3 高速臺(tái)式離心機(jī)，北京新時(shí)代北利醫(yī)療器械有限公司；DHP-600 電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

重瓣鳳仙花（ImpatiensbalsaminaL.）采集于河南省開(kāi)封市；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（PDA）、酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD），北京索萊寶科技有限公司；伊曲康唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；95%乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO），天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

白色念珠菌（GDMCC3.629）、紅色毛癬菌（ATCC MYA4438），廣東微生物菌種保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鳳仙花醇提取液的制備

參照董晨虹[15]的方法并加以改進(jìn)。稱(chēng)取鳳仙花的莖、葉、花各1.5 g，用研缽碾碎，加入200 mL 55%乙醇，置于索氏提取器中70 ℃抽提2 h，按上述條件重復(fù)提取1 次，真空抽濾，得到澄清的提取液，60 ℃減壓濃縮至4.5 mL，得到鳳仙花濃縮液（1 g/mL），0.22 μm 針頭濾器過(guò)濾，放入冰箱冷藏，備用。

1.2.2 陽(yáng)性對(duì)照的制備

稱(chēng)取2.5 mg 伊曲康唑粉劑溶于177 μL DMSO 溶液中，配置成濃度為20 mmol/L 儲(chǔ)備液，取10 μL 儲(chǔ)備液，用4 990 μL 無(wú)菌水稀釋為40 μmol/L 工作液，將儲(chǔ)備液與工作液密封，于-20 ℃避光保存[16]。

1.2.3 菌懸液的制備

將白色念珠菌、紅色毛癬菌凍干粉全部溶解，分別轉(zhuǎn)移至YPD、PDA 固體培養(yǎng)基上，白色念珠菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，紅色毛癬菌在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，連續(xù)接種傳代兩次恢復(fù)活力。將已活化的菌株轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中按上述溫度、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，使菌懸液的濃度達(dá)到2×106CFU/mL，備用[17]。

1.2.4 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

（1）白色念珠菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

參考董潔潔[18]的方法并加以改進(jìn)。白色念珠菌接種至100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于150 r/min、28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將2 mL 菌懸液接種于200 mL液體YPD 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別在0 ～14 h 和26 ～36 h 每隔2 h 測(cè)定菌懸液在530 nm 的吸光度OD530，分別以時(shí)間、OD值為橫、縱坐標(biāo)，繪制白色念珠菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線圖。

（2）紅色毛癬菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

參考鮑迎秋等[19]的方法，將已接種紅色毛癬菌的PDA 固體培養(yǎng)基于30 ℃條件下培養(yǎng)2 周，用解剖顯微鏡觀察菌落形態(tài)并用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄菌落直徑，分別以生長(zhǎng)時(shí)間、菌落平均直徑為橫、縱坐標(biāo)繪成紅色毛癬菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

測(cè)定白色念珠菌的MIC，用醇提法得到濃度為0.5 g/mL 的鳳仙花提取液母液，用二倍稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)玫劫|(zhì)量濃度分別為0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL、0.062 5 g/mL 的提取液；測(cè)定紅色毛癬菌的MIC，用相同方法得到濃度為1 g/mL 的鳳仙花提取液母液，用二倍稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)玫劫|(zhì)量濃度分別為1.000 00 g/mL、0.500 00 g/mL、0.250 00 g/mL、0.125 00 g/mL、0.062 50 g/mL、0.031 25 g/mL、0.015 60 g/mL的提取液。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將無(wú)菌牛津杯放入培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯及里面的培養(yǎng)基，形成一圓柱形小孔，分別取白色念珠菌、紅色毛癬菌菌懸液200 μL 在固體瓊脂平板上均勻涂布，在牛津杯孔內(nèi)分別加入100 μL 不同濃度的鳳仙花稀釋液，伊曲康唑工作液為陽(yáng)性對(duì)照組，無(wú)菌水為陰性對(duì)照組，每個(gè)濃度做3 個(gè)重復(fù)處理。最后將白色念珠菌置于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，紅色毛癬菌置于30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，抑菌圈邊緣處的鳳仙花提取液的濃度可視為其對(duì)指示菌的最低抑菌濃度（MIC），即能產(chǎn)生透明抑菌圈的最低抑菌劑濃度定為MIC。觀察抑菌圈大小，拍照并用游標(biāo)卡尺測(cè)量其直徑大小，取平均值。

1.2.6 鳳仙花醇提取液對(duì)兩種菌細(xì)胞壁的影響

參照堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)及董潔潔[18]的方法并加以改進(jìn)。50 mL 液體YPD、PDA 培養(yǎng)基中接種白色念珠菌（紅色毛癬菌），在28 ℃（30 ℃）培養(yǎng)箱中150 r/min 培養(yǎng)12 h（7 d）作為預(yù)備菌懸液，在預(yù)備菌懸液中加入最低抑菌濃度的鳳仙花醇提取液。在白色念珠菌生長(zhǎng)0 h、2 h、4 h、6 h 和8 h 時(shí)取樣，紅色毛癬菌生長(zhǎng)0 d、1.0 d、1.5 d、2.0 d、2.5 d、3.0 d、4.0 d、5.0 d、6.0 d 和7.0 d 時(shí)取樣，10 000 r/min 離心取上清，即為待測(cè)樣品，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管、空白管、測(cè)定管、對(duì)照管在510 nm 處的OD510值，按照公式（1）計(jì)算AKP 活性（U/mL）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，抑菌圈直徑以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，抑菌圈直徑組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

2.1.1 白色念珠菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

如圖1 所示，白色念珠菌在接種后至4 ～12 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度較快，在12 ～18 h 處于穩(wěn)定期，隨后進(jìn)入衰退期。

圖1 白色念珠菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

2.1.2 紅色毛癬菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

如圖2 所示，紅色毛癬菌3 ～12 d 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度較快，12 d 后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖2 紅色毛癬菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

2.2 鳳仙花醇提取液對(duì)兩種菌的抑制作用

由圖3 和圖4 可知，與陰性對(duì)照相比，鳳仙花醇提取液的濃度為0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL時(shí)，抑菌圈直徑較大，說(shuō)明此濃度對(duì)白色念珠菌有明顯抑制作用（P＜0.05），且具濃度依賴(lài)性；0.062 5 g/mL鳳仙花醇提取液對(duì)白色念珠菌的抑制效果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），即無(wú)抑制作用，抑菌圈直徑為0。由此可知最小抑菌濃度是0.125 0 g/mL。與陽(yáng)性對(duì)照相比，鳳仙花提取液濃度為0.500 0 g/mL 時(shí)，抑菌效果顯著提高（P＜0.05）。

圖3 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對(duì)白色念珠菌抑制效果

圖4 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對(duì)白色念珠菌的抑菌圈

由圖5 和圖6 可知，鳳仙花醇提取液的濃度為不低于0.250 00 g/mL 時(shí)，平板上沒(méi)有菌落出現(xiàn)，說(shuō)明此濃度對(duì)紅色毛癬菌完全抑制。與陰性對(duì)照相比，0.031 25 g/mL、0.062 50 g/mL、0.125 00 g/mL 鳳仙花提取液對(duì)紅色毛癬菌有顯著的抑制作用（P＜0.05），且具有濃度依賴(lài)性；0.015 60 g/mL 鳳仙花提取液無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）。由此可知鳳仙花醇提取液對(duì)紅色毛癬菌的最低抑菌濃度為0.031 25 g/mL。與陽(yáng)性對(duì)照相比，鳳仙花醇提取液濃度大于0.062 50 g/mL時(shí)，具有顯著抑菌效果（P＜0.05）。

圖5 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對(duì)紅色毛癬菌抑制效果

圖6 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對(duì)紅色毛癬菌的抑菌圈

綜上可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著提取液濃度的增加，抑菌圈直徑在增加，說(shuō)明抑制作用在不斷增強(qiáng)。鳳仙花醇提取液對(duì)兩種供試菌都有明顯的抑制作用，對(duì)紅色毛癬菌的抑制效果較白色念珠菌更顯著，可知不同真菌對(duì)同一鳳仙花醇提取液的敏感程度也不同。

2.3 鳳仙花醇提取液對(duì)兩種菌細(xì)胞壁的影響

如圖7 所示，在0 ～2 h 時(shí)，白色念珠菌菌懸液上清在510 nm 下的吸光度增加速率較慢，表明由于作用時(shí)間較短，鳳仙花醇提取液未對(duì)白色念珠菌細(xì)胞壁產(chǎn)生明顯破壞作用；在2 ～8 h 內(nèi)吸光度增加速率明顯提升，表明可以在菌體體外檢測(cè)到AKP 活性，證明鳳仙花醇提取液影響了菌體細(xì)胞壁的通透性。

圖7 鳳仙花提取物對(duì)白色念珠菌細(xì)胞壁的影響

如圖8 所示，在0 ～2.5 d 內(nèi)，紅色毛癬菌菌懸液上清在510 nm 下的吸光度增加速率較快，隨后吸光度基本保持穩(wěn)定，表明可以在菌體外部檢測(cè)到AKP活性，證明鳳仙花醇提取液影響了菌體細(xì)胞壁的通透性。

圖8 鳳仙花提取物對(duì)紅色毛癬菌細(xì)胞壁的影響

3 結(jié)論與討論

用牛津杯法對(duì)鳳仙花醇提取液的抑菌效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，鳳仙花醇提取液對(duì)白色念珠菌和紅色毛癬菌具有良好的抑制效果，且濃度越高，抑制效果越顯著，最小抑菌濃度分別為0.125 0 g/mL、0.031 25 g/mL，對(duì)紅色毛癬菌的抑制效果更顯著。通過(guò)本文的抑菌機(jī)制實(shí)驗(yàn)，表明鳳仙花提取物通過(guò)破壞真菌的細(xì)胞壁完整性，改變細(xì)胞壁的通透性抑制真菌的活性，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[20-21]。因此，研究植物提取物的抗菌潛力和實(shí)際無(wú)毒性表明，通過(guò)對(duì)植物的進(jìn)一步研究，利用其開(kāi)發(fā)抗菌藥物是可行的[22]。

與其他植物的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)相比，鳳仙花的活血、止痛等作用機(jī)制和相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，以及其他部位如根和種子的研究較少，因此仍有大量關(guān)于鳳仙花不同藥用部位的研究工作需要開(kāi)展[23]。降低抗真菌藥物毒副作用、改善耐藥性和開(kāi)發(fā)廣譜、耐藥、有效的新藥物是抗真菌藥物研究的主題[23]。本實(shí)驗(yàn)為研究中草藥新型抗菌藥物提供了理論支持，因樣本來(lái)源單一，抑菌機(jī)理研究還不夠完整，本實(shí)驗(yàn)研究有一定的局限性。