李磊，杜飛躍，楊文杰

（南京今陽(yáng)生物科技有限公司，江蘇南京 211899）

干細(xì)胞外泌體（Extracellular Vesicles，EVs）是由干細(xì)胞釋放的一種納米囊泡，內(nèi)部包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種生物分子，這些生物分子可以被其他細(xì)胞攝取，從而影響受體細(xì)胞的功能[1]。干細(xì)胞EVs可以用于治療多種疾病，包括心血管疾病[2]、神經(jīng)退行性疾病[3]等。與干細(xì)胞療法相比，EVs 具有更好的安全性和更低的免疫原性，因此被認(rèn)為是一種干細(xì)胞的替代療法[4]。盡管EVs 在治療上具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，但制備過(guò)程存在一些缺點(diǎn)：干細(xì)胞EVs 的產(chǎn)量通常比較低，難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本高昂。這些缺點(diǎn)可能限制了EVs 的臨床應(yīng)用[5-6]。

為了解決低產(chǎn)量問(wèn)題，通過(guò)擠壓、研磨、超聲等破碎干細(xì)胞的技術(shù)產(chǎn)生工程化納米囊泡（Nanovesicles，NVs），成為一種新的具有潛力的生產(chǎn)方法[6-9]。其中，超聲破碎技術(shù)通過(guò)產(chǎn)生周期性的高頻振動(dòng)波，在細(xì)胞中形成微氣泡并引發(fā)空化，細(xì)胞瞬間坍塌產(chǎn)生強(qiáng)大的流體力學(xué)剪切力，可以剪切和分解細(xì)胞膜，從而使細(xì)胞溶質(zhì)（包括各種RNA、蛋白質(zhì)）釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，同時(shí)疏水/親水膜脂自動(dòng)重組，隨機(jī)包裝周?chē)腞NA 和蛋白質(zhì)，形成NVs[6]。已有研究證明，超聲處理的干細(xì)胞破碎液包含NVs，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移[6]。但是，干細(xì)胞破碎液中除了NVs 外，還包含有各種細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、糖類(lèi)、酶、激素、維生素、氨基酸等小分子，為了排除這些物質(zhì)對(duì)NVs 特性的影響，項(xiàng)目組采用超聲破碎干細(xì)胞的方法制備N(xiāo)Vs，根據(jù)傳統(tǒng)外泌體超速離心提取技術(shù)純化NVs，并對(duì)NVs 的形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)活性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

PBS 和DMEM/High Glucose 培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司；α-MEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA（0.25%），美國(guó)Gibco 公司；100×青霉素-鏈霉素，以色列BI公司；胎牛血清（FBS），澳大利亞Bovogen Biological 公司；重組Anti-TSG101 抗體（ab125011），英國(guó)Abcam公司；抗GAPDH 兔多克隆抗體和山羊抗兔IgG H&L（HRP），康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA 檢測(cè)試劑盒（增強(qiáng)型）、RIPA 蛋白裂解液（強(qiáng)）、PMSF 蛋白酶抑制劑、Western Blot 試劑盒、親水PVDF 膜、極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑和增強(qiáng)型CCK-8 試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

Countess Ⅱ細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Invitrogen 公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；L-90K 超速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Optima公司；Tecnai 12 透射電子顯微鏡，荷蘭Philips 公司；Amersham Imager 600UV 多功能成像儀，美國(guó)GE 公司。

1.2 hUC-MSCs 培養(yǎng)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）使用α-MEM培養(yǎng)基（包含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)。將hUC-MSCs 按照5 000 cells/cm2密度接種于T175 培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到90%～95%匯合度。使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）對(duì)hUC-MSCs進(jìn)行消化，最終在PBS溶液中重懸細(xì)胞，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和活力。

1.3 EVs 的制備

將80%匯合度的hUC-MSCs在無(wú)血清的α-MEM培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以300×g離心10 min，16 500×g離心20 min，再用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾上清。然后，在4 ℃條件下100 000×g 離心2 h，棄除上清液，用PBS 重懸EVs 顆粒，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 NVs 的制備

參考WANG 等[6]研究方法，經(jīng)過(guò)改進(jìn)后制備N(xiāo)Vs，將1 mL 1.0×107hUC-MSCs 懸液轉(zhuǎn)移到4 mL EP 管，置于冰水混合物，實(shí)施超聲破碎。超聲條件：變幅桿型號(hào)φ3，超聲儀探頭置于液面下1 cm，功率900 W×40%，超聲2 s，關(guān)閉2 s，總超聲時(shí)間4 min，保護(hù)溫度25 ℃。在4 ℃條件下，細(xì)胞破碎液300×g離心5 min，以去除未破碎的細(xì)胞，16 500×g 離心20 min，以清除細(xì)胞碎片，將上清液通過(guò)0.45 μm 過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，以除去殘留的細(xì)胞碎片和大粒徑囊泡等，獲得細(xì)胞裂解液（Lysate），在4 ℃條件下，細(xì)胞裂解液經(jīng)100 000×g 超速離心2 h[11]，棄除上清液，用PBS 重懸顆粒，即得NVs，在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 NTA 分析粒徑

NVs 和EVs 送至上海逍鵬生物科技有限公司進(jìn)行NTA 測(cè)試。

1.6 TEM 鑒定形態(tài)

取20 μL NVs 或EVs 樣品滴在Parafilm 封口膜上，然后將Formvar/carbon 載樣銅網(wǎng)膜面朝下放在液滴上，室溫下靜置10 min。用鑷子將銅網(wǎng)取出，用吸水紙從銅網(wǎng)側(cè)邊吸干多余的樣品。然后用2%磷鎢酸溶液（pH6.4 ～7.0）負(fù)染2 min，將銅網(wǎng)取出，并用吸水紙從銅網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，最后將銅網(wǎng)放置于紅外烘烤燈下干燥10 min，在TEM 下觀察囊泡的形態(tài)，并拍攝電鏡照片。

1.7 Western Blot 檢測(cè)TSG101

利用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒確定NVs 或EVs 的蛋白質(zhì)含量。每孔加樣蛋白質(zhì)25 μg，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），120 V 電泳60 min，冰水浴中300 mA 電轉(zhuǎn)印2.5 h，將NVs 和EVs 包含的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后，室溫下用封閉液封閉PVDF 膜15 min，用洗滌液洗滌3 次，每次10 min，在4 ℃條件下用一抗重組Anti-TSG101 抗體、抗GAPDH 兔多克隆抗體孵育過(guò)夜，再用洗滌液洗滌3 次，每次10 min，室溫下用二抗山羊抗兔IgG H&L （HRP）孵育2 h，再用洗滌液洗滌3 次，每次10 min。最后利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑在多功能成像儀中曝光成像。

1.8 NVs 對(duì)HSF 增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚成纖維（HSF）細(xì)胞，重懸于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素和89% DMEM/High Glucose 培養(yǎng)基，以1 800 cell/孔的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)48 h。更換含有25 μg/L Lysate、NVs 或EVs 的低血清培養(yǎng)基（1%FBS、99% DMEM/High Glucose），37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)48 h。加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)3 h 后，在450 nm 測(cè)定吸光度。按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑

NTA 技術(shù)是利用光散射和布朗運(yùn)動(dòng)的特性獲得液體懸浮液中的樣本粒度分布，檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），NVs粒徑集中在100 nm左右，NVs粒徑（103.5±9.0）nm，EVs 粒徑（138.0±0.7）nm，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（P＞0.05），符合一般外泌體的直徑大小。

圖1 EVs 和NVs 的粒度分布

2.2 表面形態(tài)

NVs 和EVs 在TEM 下均觀察到100 nm 左右、呈杯墊狀圓形或橢圓形的膜型小囊泡，囊泡外周可見(jiàn)膜型結(jié)構(gòu)，與外泌體的經(jīng)典形態(tài)相似，見(jiàn)圖2。

圖2 EVs 和NVs 在TEM 下的形態(tài)

2.3 蛋白質(zhì)表達(dá)

采用Western Blot 分析相同總蛋白量下EVs 和NVs 中TSG101 的表達(dá)量，結(jié)果如圖3 所示。從圖中可以看出，NVs 包含的外泌體特征蛋白TSG101 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于EVs，這可能是組成NVs的膜主要是細(xì)胞膜，且在NVs 形成過(guò)程中隨機(jī)包裹的游離TSG101 蛋白總量也較少，導(dǎo)致了NVs 中檢測(cè)到的TSG 的含量低于EVs。

圖3 EVs 和NVs 中TSG101 表達(dá)結(jié)果

2.4 對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響

如圖4 所示，超聲破碎hUC-MSCs 獲得的細(xì)胞裂解液、EVs 都能促進(jìn)HSF 細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組（PBS）相比均具有顯著性差異（P＜0.01），且細(xì)胞裂解液對(duì)HSF 的促增殖效果優(yōu)于EVs（P＜0.05）；而NVs對(duì)HSF 細(xì)胞的增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組（PBS）相似。

圖4 EVs 和NVs 對(duì)HSF 細(xì)胞增殖的影響

3 結(jié)論與討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛用于臨床研究，可治療多種疾病，其強(qiáng)大的治療效果與細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞外囊泡通信等相關(guān)[1]。在細(xì)胞外囊泡中，外泌體粒徑大小為30～150 μm，具有典型的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)，表達(dá)四跨膜蛋白分化簇（Clusters of Differentiation，CD），包括CD63、CD9 和CD81，此外還包含多泡體（Multivesicular Bodies，MVBs）合成相關(guān)的蛋白Alix 和TSG101 等[10]。外泌體還攜帶功能性mRNAs和miRNAs，可在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移[10]。有研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含一組microRNA（miR-21、-23a、-125b 和-145），通過(guò)抑制TGF-β2（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2，Transforming Growth Factor-β2）/SMAD2（Sam 和Mad 相關(guān)蛋白2，Sma- and Mad-related protein 2）通路來(lái)抑制肌成纖維細(xì)胞形成和瘢痕形成[11]。EVs 療法作為一種新型“無(wú)細(xì)胞”治療產(chǎn)品具有廣闊前景，但在其臨床應(yīng)用之前仍有許多挑戰(zhàn)需要克服，主要為如何進(jìn)行大規(guī)模、快速、低成本生產(chǎn)[4]。利用超聲從hUC-MSC 制備工程化納米囊泡（NVs）可能成為一種高效、快速、大量地生產(chǎn)囊泡的方法，該工程化NVs 與細(xì)胞分泌的EVs 的功能是否有差異，成為生產(chǎn)應(yīng)用前必須了解的重要問(wèn)題。

本文研究了NVs 的粒徑、形態(tài)、蛋白質(zhì)表達(dá)等方面，并探討了NVs 對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。hUCMSC 經(jīng)過(guò)超聲破碎，100 000×g、2 h 離心，可獲得粒徑大小集中在100 nm 左右的NVs，與標(biāo)準(zhǔn)EVs 粒徑比較無(wú)顯著差異，電鏡下為杯墊狀圓形的膜型小囊泡，幾乎不表達(dá)外泌體特征蛋白TSG101，對(duì)HSF 細(xì)胞的增殖沒(méi)有促進(jìn)作用。這種NVs與EVs差異的形成，可能反映在NVs 形成的原理與EVs 不同。即EVs 是細(xì)胞外泌的一種囊泡，內(nèi)含特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，具有特定的生物學(xué)活性[1]；而工程化NVs 是在細(xì)胞膜分解后，隨機(jī)包裹周?chē)暮怂岷偷鞍踪|(zhì)等形成的囊泡，包裹的成分容易受到環(huán)境中內(nèi)容物的濃度、種類(lèi)等影響，且組成囊泡的磷脂雙分子層中蛋白質(zhì)等成分也是隨機(jī)的，因此，其形成的囊泡功能也相對(duì)會(huì)受到影響。

綜上所述，本研究旨在探索來(lái)源于hUC-MSCs 的工程化NVs 的制備和鑒定方法。通過(guò)特征分析，成功建立了一套制備和純化工程化NVs 的方法，并發(fā)現(xiàn)從hUC-MSCs 中獲得的NVs 在形態(tài)上與細(xì)胞分泌的EVs 相似，但在功能上存在區(qū)別。為將NVs 應(yīng)用于臨床治療中，有必要引入靶向分子和功能成分，以實(shí)現(xiàn)特定的治療效果。