趙 媛, 劉 新, 張譯丹, 張 健, 劉 向, 楊國鋒*

(1. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院老年病科, 河北 石家莊 050051; 2. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經外科, 河北 石家莊 050051)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常見的、能夠引起老年人運動障礙的神經系統(tǒng)退行性疾病,其病因尚不明確。隨著人口的老齡化,PD在全球出現(xiàn)增長的趨勢,隨之帶來一系列的家庭、醫(yī)學及社會問題。PD主要病變在黑質致密帶、迷走神經背核、藍斑等部位,其典型病理變化是α-突觸核蛋白(α-syn)的聚集及尾狀核、殼核中多巴胺含量的減少[1]。當PD患者出現(xiàn)臨床癥狀時,黑質多巴胺能神經元的凋亡比例至少為50%以上,紋狀體多巴胺含量減少80%以上[2]。由此可見,PD患者具有臨床癥狀與神經損傷的不平行性,神經損傷早于臨床癥狀的出現(xiàn)。目前PD的臨床診斷仍以癥狀診斷為主,多數(shù)患者在確診時已出現(xiàn)較為明顯的運動障礙。因此,開發(fā)PD的早期診斷標志物對于開展早期治療、改善病人預后等具有重要意義。

外泌體(exosomes)是一種直徑為50～200 nm且具有雙層脂質膜結構的細胞外囊泡[2]。外泌體攜帶了大量來源細胞的蛋白質、核苷酸等生物分子,在細胞間通訊和免疫反應等生物過程中發(fā)揮著重要作用[3-6]。外泌體參與多種神經系統(tǒng)生理過程(包括物質轉運、髓鞘形成和受損軸突的再生等),調節(jié)各種信號功能,并與神經系統(tǒng)退行性疾病相關[7-9]。血漿中存在多種細胞來源外泌體,其中包括神經源性外泌體。研究表明,血漿外泌體攜帶了能夠反映中樞神經系統(tǒng)病變的病理性生物分子[10]。目前,越來越多的研究開始關注PD的外泌體生物標志物,例如通過血漿外泌體的微小核糖核酸(miRNA)逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,PD組外泌體中的miR331-5p水平明顯升高,而miR-505水平則明顯降低;且miR331-5p和miR-505具有較好的PD診斷價值及預測能力[11]。不僅如此,有研究表明,血漿外泌體的朊病毒蛋白質水平上升與PD患者認知能力下降顯著相關(統(tǒng)計學意義(P-value,P)<0.05)[12]。由此可見,外泌體中可能承載了更多具有特異性的生物學信息,是中樞神經系統(tǒng)疾病生物標志物的良好載體。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

EASY-nLC 1200液相色譜系統(tǒng)、PepMap RSLC C18色譜柱(25 cm×75 μm, 2 μm)、Orbitrap Fusion Lumos融合熒光閃爍三合一質譜儀、SPD120真空離心蒸發(fā)濃縮器(美國Thermo Fisher Scientific公司); optimal-90K超速離心機、70 Ti轉子(美國Beckman Coulter公司); Tecnai G2 20雙透射電鏡(200 kV,美國FEI公司);ZetaView PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司)。

10標TMT試劑、Pierce Bicinchoninic Acid蛋白質試劑盒、色譜級乙腈和甲醇、Bradford蛋白質濃度檢測試劑盒、PierceTM比色法定量檢測試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);高選擇性Top14高豐度蛋白損耗樹脂(Cat No. A36370,美國Sigma-Aldrich公司); 200目碳層銅網(北京中科科儀股份有限公司);色譜級甲酸(德國CNW公司); 0.22 μm孔徑過濾器、聚偏氟乙烯膜、化學發(fā)光辣根過氧化物酶(HRP)底物(美國Millipore公司); ALG-2相互作用蛋白X (Alix,貨號2171S)、鈣網蛋白(Calreticulin,貨號12238T)一抗均購于美國Cell Signaling公司;脂筏標記蛋白(Flotillin-1,貨號610820)購于美國BDBiosciences公司;二抗HRP標記山羊抗兔免疫球蛋白G (貨號4050-05,美國Southern Biotech公司)。

1.2 血漿樣本采集

本研究選取2019年9月至2020年7月就診于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院老年病科的9名PD患者及9名HC為研究對象。PD患者的診斷均符合2016版中國帕金森病診斷和擬診標準,病程達1年以上;臨床排除標準:(1)繼發(fā)性帕金森綜合征患者,(2)帕金森疊加綜合征患者,(3)有嚴重心、肝、腎、胃腸道功能障礙者,(4)提供病史不詳細者,(5)近1個月內有感染者,(6)患有免疫系統(tǒng)疾病者,(7)有慢性感染性疾病者,(8)近1個月內使用過消炎藥、免疫調節(jié)藥者,(9)有惡性腫瘤病史者,(10)近期有外傷或頭顱手術者。樣本采集前,HC和PD患者均簽署了書面知情同意書,受試者資料如表1所示。本研究已獲河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院機構倫理委員會批準(批準文號:2022-R036)。

表1 受試者的人口統(tǒng)計學及臨床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of the subjects

1.3 血漿外泌體的分離

本實驗采用超速差速離心法分離血漿外泌體[7,16],分離方法如下:將血漿在室溫下以3 000 g離心10 min,上清液用0.22 μm孔徑過濾器過濾,濾液用70 Ti轉子在4 ℃下以120 000 g離心3 h,棄去上清液,所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS, 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO3、0.44 g KH2PO3、1 L H2O, pH 7.4)重懸后再以120 000 g離心2 h,沉淀用PBS洗滌,最終得到血漿外泌體。

1.4 血漿高豐度蛋白質去除

為了提高低豐度蛋白質的檢出率,選用高選擇性Top14高豐度蛋白質損耗樹脂來去除血漿中豐度最高的14種蛋白質[14]。使用Bradford法測定蛋白質濃度后,向樣本中加入4倍體積且已在-20 ℃預冷的丙酮,靜置過夜;之后于4 ℃、12 000 g下離心10 min,收集沉淀,并在真空離心蒸發(fā)濃縮器中干燥。

1.5 外泌體的表征

1.5.1透射電鏡觀察外泌體形態(tài)

使用透射電鏡對外泌體的形態(tài)進行觀察,用20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl, pH 6.8)緩沖液將樣本稀釋至質量濃度為0.1 μg/μL。在無菌濾紙上滴1滴醋酸鈾、2滴無菌水,將碳網蓋在樣本上靜置2 min,用濾紙吸取多余樣本,并于室溫下晾干。取10 μL醋酸鈾溶液負染1 min,用濾紙吸取多余染劑并在無菌水中清洗30 s,最后將樣本放置于顯微鏡下進行觀測拍照。

首先，樹立全新的人才培養(yǎng)理念，突破傳統(tǒng)教育思路，重新認識現(xiàn)代職業(yè)教育決策。國家打造的現(xiàn)代職業(yè)教育體系是高等教育體系的結構性調整，是打造本科職業(yè)教育化，充分利用本科的教育資源培養(yǎng)高層次、高水平、高素養(yǎng)的適應科技時代需求的新型技術工人。因此，打造以培養(yǎng)應用型技術技能型人才為目標的應用技術型大學，獨立學院要優(yōu)化現(xiàn)有的人才培養(yǎng)方式，發(fā)揮辦學機制靈活的優(yōu)勢，將優(yōu)勢專業(yè)與產業(yè)相結合，培養(yǎng)特色專業(yè)背景強的、面向基層一線崗位的技術技能型人才，使人才培養(yǎng)方式更加符合現(xiàn)代職業(yè)教育改革的要求，更具科學性。

1.5.2蛋白免疫印跡分析檢測外泌體標記蛋白質

取10 μg已測定蛋白質濃度的樣本,與1%十二烷基硫酸鈉裂解液混合后進行蛋白免疫印跡分析。在進行蛋白質樣品電泳時,先在100 V恒壓下電泳15 min,然后在200 V恒壓下電泳45 min,隨之結束電泳。將與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠大小相近的纖維素膜預先在甲醇中浸泡搖晃約10 min,然后按照由上至下依次為濾紙、凝膠、纖維素膜、濾紙的順序放在轉膜儀上,轉膜條件設置為100 mA、10 V持續(xù)1 h。轉膜結束后,在室溫條件下使用PBS配制的5%(質量分數(shù))脫脂奶粉來封閉纖維素膜1 h;隨后切下適當分子質量的樣本條帶,向其中加入相應稀釋比例的一抗,在4 ℃搖床中孵育過夜;在室溫下使用PBS洗膜3次,每次洗滌10 min,之后向其中加入與一抗種屬相符的二抗,室溫下孵育1 h;再使用PBS洗膜3次,每次洗滌10 min,加入化學發(fā)光HRP底物反應2 min,在暗室進行曝光,使用Image J軟件對蛋白質表達量的變化進行灰度分析和比較。目的條帶的分子質量:Calreticulin 55 kDa, Flotillin-1 48 kDa, Alix 96 kDa。

1.5.3納米粒子跟蹤分析(NTA)檢測外泌體樣本粒徑

將外泌體樣本用PBS以1∶1 000(v/v)的比例進行稀釋,使用配備了405 nm激光的納米顆粒跟蹤分析儀來測定外泌體的粒徑和濃度,并記錄納米粒子在1 min內的運動軌跡;之后用NTA軟件(version 8.02.28)對所記錄的視頻進行分析,并提供粒子尺寸分布和粒子濃度數(shù)值。

1.6 樣本前處理

在每個樣品中均取40 μg蛋白質,并用8 mmol/L尿素溶液定容至60 μL,再向其中加入3 μL重組賴氨酰內切酶(Lys-C),并于37 ℃下酶解2 h。用100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)將樣品稀釋4倍,再向其中加入2 μL胰蛋白酶(trypsin),用封口膜包住離心管,在37 ℃溫箱中酶解8～18 h。向樣本溶液中加入三氟乙酸(TFA)進行酸化(加入后TFA的體積分數(shù)為0.5%),選用搭載了C18的200 μL槍頭脫鹽柱進行脫鹽,隨后在3 000 g下離心1 min,用200 μL乙腈(ACN)、200 μL 0.1%TFA水溶液-ACN(3∶7, v/v)潤洗脫鹽柱,再用200 μL 0.1% TFA水溶液平衡脫鹽柱;之后緩慢加入樣品,在3 000 g下離心2 min,收集流出樣品,用200 μL 0.1%TFA水溶液進行脫鹽;隨后使用200 μL 0.1%TFA水溶液-ACN(3∶7, v/v)對樣品進行洗脫,收集洗脫液。對洗脫后的肽段樣本進行液氮速凍處理,之后在真空旋轉干燥儀中完全干燥。用100 mmol/L四乙基溴化銨(TEAB)對已干燥的肽段進行復溶,測定肽段濃度,每個樣品取等量的20 μg肽段用于標記。使用10標TMT進行標記,然后加入8 μL 5%羥胺(HDX),混勻后于室溫下放置15 min以終止反應。將18個樣本分成兩批次進行分析,每批次均設置一個含有等量各樣本組分的內參。使用ACN和0.1%氨水配制梯度洗脫液(ACN的體積分數(shù)依次為10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%和50%),用C18脫鹽柱對0.1%氨水溶解的TMT標記肽段進行脫鹽,再使用上述梯度洗脫液對樣本進行分級洗脫,并將使用10%ACN及50%ACN洗脫液洗脫的樣本混合。最后將上述7個餾分進行真空干燥,備用。

1.7 LC-MS/MS分析條件

1.7.1色譜條件

用0.1%甲酸水溶液將TMT標記的多肽樣品復溶,之后以8 μL/min的速率通過自動進樣器進入C18色譜柱(2 cm×75 μm, 3 μm)中,然后將C18柱切換到PepMap RSLC C18柱。流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈。梯度洗脫程序:0～15 min, 2%B～25%B; 15～25 min, 25%B～50%B; 25～28 min, 50%B～98%B。流速300 nL/min;柱溫40 ℃;進樣量10 μL。

1.7.2質譜條件

離子化模式為正離子模式,掃描模式為全掃描(m/z300～1 500),掃描頻率為10 000 Da/s,數(shù)據(jù)采集模式為數(shù)據(jù)依賴型采集(data-dependent acquisition, DDA)。一級質譜掃描范圍為m/z350～1 800,分辨率為120 000;選取一級質譜圖中信號最強的母離子進行二級裂解,二級掃描的分辨率為50 000,碎裂模式為高能碰撞解離(HCD),歸一化碰撞能(NCE)設置為37%。

1.8 質譜數(shù)據(jù)檢索分析

利用Proteome Discoverer 2.2軟件的SEQUEST搜索引擎功能對得到的質譜原始數(shù)據(jù)進行檢索,檢索數(shù)據(jù)庫為UniProt人源數(shù)據(jù)庫Human. fasta(2017年10月下載)。檢索參數(shù)如下:胰酶特異性全酶切,允許兩個漏切;固定修飾包括半胱氨酸的烷基化、肽段N端或賴氨酸的TMT修飾;可變修飾為甲硫氨酸的氧化;母離子和碎片離子的質量誤差分別為1×10-5Da和0.02 Da;蛋白質和肽段譜圖鑒定的錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)小于1%;對MS/MS掃描報告中不同離子通道的肽段豐度進行標準化[17]。蛋白質鑒定要求每個蛋白質組至少有一個唯一肽段,蛋白質定量采用TMT報告離子定量,并利用內參對不同TMT實驗之間的報告離子強度進行歸一化。

1.9 數(shù)據(jù)分析及生物信息學分析

蛋白質組的所有統(tǒng)計分析均在RStudio環(huán)境(v1.0.143)中使用R(v3.6.3)進行。使用log2變換后的雙尾t檢驗來分析差異表達蛋白質,P采用多重檢驗校正方法(benjaminiand Hochberg, BH)進行調整[18]。在對熱圖進行可視化分析之前,根據(jù)蛋白質的Z評分(Z-score)對蛋白質的表達水平進行聚類分析。以P<0.05和差異倍數(shù)(fold change, FC)>1.2為條件,篩選HC和PD組之間的差異表達蛋白質。通過韋恩圖對鑒定到的血漿外泌體蛋白質與ExoCarta外泌體數(shù)據(jù)庫(http://www.exocarta.org)進行比較;使用MAGeCKFlute R包中的enrichment analyze函數(shù)進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路和基因本體論(GO)富集分析,并使用MAGeCKFlute中的函數(shù)對富集路徑進行可視化[19]。

2 結果與討論

2.1 血漿外泌體的表征與鑒定

在透射電鏡下可觀察到外泌體典型的雙側凹陷雙層膜結構,呈圓形或橢圓形囊泡狀,如圖1a和1b所示。囊泡可單一分布也可聚集成群疊加分布,尺寸約為100 nm,結構完整。利用NTA軟件對外泌體樣本的粒徑及含量進行分析,如圖1c所示,經過1 000倍稀釋后,HC組與PD組的外泌體粒徑分別為107.96±1.57 nm和103.80±2.35 nm,均在外泌體的粒徑范圍之內,且兩組外泌體粒徑的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.35)。如圖1d所示,HC組與PD組外泌體的顆粒含量分別為9.29×109個/mL和9.51×109個/mL,兩組外泌體含量的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.16)。使用免疫印跡法檢測外泌體標志性蛋白質(即外泌體陽性蛋白質)Alix、Flotillin-1和內質網標志性蛋白質(即外泌體陰性蛋白質)Calreticulin的表達情況。如圖1e所示,通過差速超速離心法富集的人血漿外泌體中,Alix、Flotillin-1呈高表達,而Calreticulin的表達量明顯減少,甚至消失。此外,將鑒定到的外泌體蛋白質與ExoCarta外泌體數(shù)據(jù)庫進行比對分析,大部分蛋白質均可在外泌體數(shù)據(jù)庫中檢索到,如圖2所示。以上結果均驗證了該外泌體富集方法的可靠性,同時證明了所獲得的外泌體具有較高的純度。

圖1 血漿外泌體表征Fig. 1 Characterizations of the plasma exosomes a and b. Plasma exosome morphologies visualized by TEM (scale bar 50 nm); c. size distributions of exosomes measured by NTA (n=9); d. exosome contents measured by NTA (n=9); e. Western blotting analysis of the plasma and exosomes. NS: no statistical significance.

2.2 PD患者與HC的血漿及血漿外泌體蛋白質質譜分析

本研究通過LC-MS/MS技術對PD患者和HC的血漿及血漿外泌體進行基于TMT的定量蛋白質組學分析,并比較了血漿和血漿外泌體兩種樣本的蛋白質質譜圖。在血漿和血漿外泌體樣本中分別鑒定到759和650個蛋白質,定量到724和611個蛋白質。對定量到的蛋白質表達值進行標準化處理,標準化前后的比值分布以箱線圖表示。如圖3所示,標準化后的數(shù)據(jù)更趨近于中心位置,樣品間的強度分布差異更小,有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

基于PD組與HC組經標準化處理后的蛋白質豐度,做非配對t檢驗,并對t檢驗所得到的P進行多重檢驗校正。在血漿蛋白質的鑒定中,由于血漿中存在大量高豐度蛋白質,導致血漿低豐度蛋白質被掩蓋,降低了質譜中可鑒定的蛋白質數(shù)量。因此,本研究采用高豐度蛋白損耗樹脂來去除血漿中豐度最高的14種蛋白質。同時,在每批TMT實驗中均設置了同質量的內參,以保證組間定量結果的可比性。以|log2FC|>0.26和P<0.05為篩選條件,在PD組與HC組血漿樣本中共篩選到11個顯著差異表達蛋白質,其中5個蛋白質表達上調,6個蛋白質表達下調;而在血漿外泌體樣本中共篩選到13個顯著差異表達蛋白質,其中6個蛋白質表達上調,7個蛋白質下調。由此可見,血漿外泌體中可以篩選到更多的差異表達蛋白質。如表2所示,人血漿激肽釋放酶(KLKB1)、胞外5′-核苷酸酶(NT5E)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAGLU)、人前列腺轉谷氨酰胺酶(TGM4)、凝血因子Ⅷ (F8)、三磷酸腺苷酶蛋白酶體26S亞基4 (PSMC4)、脂多糖結合蛋白受體(CD14)、碳酸酐酶Ⅳ(CA4)、分泌型磷蛋白2 (SPP2)、脂多糖結合蛋白(LBP)均可在外泌體蛋白質數(shù)據(jù)庫中檢索到。如圖4所示,與血漿蛋白質分布相比,PD組與HC組血漿外泌體樣本的蛋白質分布差異度更大。因此,對血漿外泌體樣本進行高通量質譜分析有助于發(fā)現(xiàn)與疾病相關的新蛋白質。

據(jù)文獻[20-22]報道,NAGLU、NT5E等蛋白質的差異表達不僅會增加PD的患病風險,還會參與PD的病理過程,因此這些蛋白質具有成為新型PD標志物的潛力。NT5E是參與調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)、應激反應、損傷和疾病等過程的重要水解酶,其可催化磷酸腺苷(AMP)形成胞外腺苷[22-24]。在PD小鼠腦組織模型中,NT5E上調并激活腺苷2A(A2A)受體相關的腺苷通路;敲除NT5E能夠抑制PD模型中A2A受體的激活和上調,并發(fā)揮保護多巴胺能神經元和減輕小鼠運動障礙的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),NT5E可促進PD小膠質細胞的激活和炎癥因子的釋放[20]。NAGLU是一種降解硫酸肝素糖胺聚糖(GAGs)所需的溶酶體酶[25,26],從遺傳學角度來看,NAGLU的多態(tài)性(rs2071046)與PD的風險增加有關。Winder-Rhodes等[27]對926名PD患者和2 308名對照者進行了研究,發(fā)現(xiàn)C等位基因純合度的比值比為1.32。除此之外,Hamano等[21]發(fā)現(xiàn)ⅢB型黏多糖貯積病(MPSⅢB)患者的腦部區(qū)域內存在大量磷酸化的α-syn,從病理角度說明NAGLU可能與α-syn的生成、代謝及聚集密切相關。LBP是一種在肝臟中產生并可進入血液循環(huán)的糖蛋白,它可以促進巨噬細胞與脂多糖的結合,導致炎癥細胞因子分泌增加[28]。已有研究表明,血漿中的LBP水平可以反映PD患者的患病風險、運動癥狀嚴重程度及疾病進展[29]。

2.3 GO及KEGG通路富集分析

本研究以蛋白質表達差異大小為基礎排序,采用基因集富集分析GSEA對定量到的所有差異表達蛋白質進行功能富集分析[30]。GSEA有助于了解所有差異基因的總體變化趨勢,可以避免一些變化微弱卻具有效力的蛋白質被過濾掉,發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關的生物學通路。本研究對血漿和血漿外泌體樣本均進行了基于GSEA的GO和KEGG分析。在GO分析中,依據(jù)P<0.05將基因本體論-生物學過程(GO-BP)、基因本體論-細胞組分(GO-CC)、基因本體論-細胞功能(GO-MF)中的前10名富集功能通路進行展示,結果如圖5所示。依據(jù)GO-CC分析,血漿富集蛋白質主要定位于細胞核,而血漿外泌體富集蛋白質主要定位于細胞質中。由于外泌體成分主要為各種細胞外分泌的產物,其內含有大量細胞漿內物質,這與GO分析中的細胞組成結果一致。GO-MF分析顯示,血漿差異表達蛋白質的分子功能主要富集為RNA、DNA結合及補體結合等,而血漿外泌體差異表達蛋白質的分子功能主要富集為抗氧化作用和氧化還原酶活性等。由此可見,外泌體差異表達蛋白質富集到的分子功能更具有疾病特異性。研究表明,氧化應激損傷在PD中可起到重要作用。多巴胺能神經元有巨大、無髓鞘的軸突并可產生超過100萬的突觸,其對能量的需求較其他神經元更多。PD中多巴胺能神經元的能量平衡被打破后,會導致其需氧量增加,而這種能量的不平衡又進一步加重了氧化應激損傷,致使黑質紋狀體內大量多巴胺能神經元的死亡丟失[31,32]。

最后,對不同樣本差異表達蛋白質的KEGG富集通路進行分析(圖6)。血漿樣品富集通路有溶酶體途徑(lysosome)、細胞老化(cellular senescence)及內質網反應(protein processing in endoplasmic reticulum)等,而血漿外泌體樣本差異表達蛋白質主要富集為細胞因子途徑(chemokine signaling pathway)和細胞因子受體間相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等。溶酶體是自噬途徑的最終作用場所,負責錯誤折疊蛋白質及受損細胞器的清除。因此,溶酶體介導的自噬在PD病理過程中,尤其是維持黑質神經元功能中發(fā)揮重要作用[33]。研究表明,野生型α-syn可通過分子伴侶介導在熱激蛋白70(Hsc70)的協(xié)助下轉運至溶酶體并被降解,而構象發(fā)生變化的病理性α-syn不能被降解,這是因為病理性α-syn與溶酶體膜上的特異性受體有特別高的親和力,該類受體對自噬途徑具有調控作用。病理性α-syn與受體結合后可阻斷溶酶體攝入α-syn,并抑制其和其他底物的降解,造成胞內蛋白質的異常聚集[34,35]。此外,溶酶體三磷酸腺苷酶(ATPase, ATPl3A2)的突變也是引起PARK9相關帕金森病的主要原因。ATPl3A2是編碼溶酶體膜蛋白質的主要基因,其突變可導致PD病人的自噬功能受損及α-syn在黑質紋狀體中的聚集[36]。

與包含較多無關信息的血漿樣本相比,對特異性更強的血漿外泌體樣本進行分析可以更加直觀地反映出機體和疾病的不同狀態(tài)。分析其原因可能是外泌體通過內吞途徑起源于核內體,而核內體早期起源于內質網、高爾基體和線粒體等細胞內膜系統(tǒng),外泌體通過兩次質膜內陷從晚期核內體中分離出來,因此其攜帶了大量的母細胞信息,并通過融合、受體相互作用或內吞作用等釋放至胞外[2]。在PD進展過程中,外泌體不僅可以向遠處播散α-syn,而且會通過分泌其他生物分子(如炎癥因子等)直接或間接地干擾鄰近神經元或膠質細胞的病理、生理過程。因此,外泌體內含有更多與PD相關的生物活性分子,對其進行高通量組學分析更有利于發(fā)現(xiàn)與疾病相關的蛋白質、病理機制以及新型疾病標志物。

然而本研究也存在一定的局限性。首先樣本量較少,盡管發(fā)現(xiàn)了一些新型的、與PD相關的血漿及血漿外泌體蛋白質,但缺乏大樣本量的驗證,不能很好地評價其對PD的診斷價值;其次,PD為中樞神經系統(tǒng)的退行性疾病,由于血腦屏障的存在,本研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達蛋白質并不能完全反應PD腦組織中的蛋白質表達差異,需要進一步在動物及細胞模型中進行功能驗證;最后,盡管本研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體蛋白質富集通路或富集蛋白質功能較血漿蛋白質更具有疾病特異性,但與中樞神經系統(tǒng)來源外泌體相比,其特異性仍偏低,之后可以對中樞神經系統(tǒng)來源外泌體進行高通量質譜分析,以獲取更多與疾病相關性更強的生物學信息。

3 結論

本研究基于TMT的定量蛋白質組學技術對PD患者和HC的血漿及血漿外泌體樣本進行差異表達蛋白質篩選和GSEA生物學信息分析,研究結果將有助于進一步了解PD的疾病機制。盡管血漿蛋白質和血漿外泌體蛋白質均在PD中出現(xiàn)了明顯的差異表達,但與血漿樣本蛋白質組分析相比,血漿外泌體蛋白質組學分析可以獲得更多有價值的差異表達蛋白質及生物學信息。因此,本研究不僅證實了外泌體是作為新型PD標志物及診療靶點的良好研究載體,也論證了蛋白質組學技術在疾病標志物研發(fā)中的重要作用。