童 新, 金 洋, 金 晶, 劉 萍, 吳春艷,, 童勝?gòu)?qiáng)*

(1. 臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院, 浙江 臺(tái)州 318020; 2. 浙江工業(yè)大學(xué), 浙江 杭州 310014)

從天然產(chǎn)物中篩選藥用活性成分是新藥研究與發(fā)現(xiàn)的重要途徑,色譜分離技術(shù)對(duì)活性組分的篩選起到至關(guān)重要的作用[1]。中藥揮發(fā)油往往含有多種活性成分,然而由于其成分復(fù)雜,一維色譜有限的峰容量難以完全分離揮發(fā)油組成。盡管毛細(xì)管氣相色譜與全二維氣相色譜為揮發(fā)油成分分析提供了有力手段,但是氣相色譜分離后因?yàn)榻M分難以回收利用,因此不適用于活性成分的篩選。發(fā)展新型的以液相色譜為基礎(chǔ)的多維色譜分離新方法,對(duì)于中藥揮發(fā)油復(fù)雜體系分離分析及活性成分篩選均具有重要的意義。

全二維色譜技術(shù)結(jié)合多種分離機(jī)制或分離模式實(shí)現(xiàn)樣品分離,特別適用于物質(zhì)極性相似、性質(zhì)相近與結(jié)構(gòu)相似組分的分離,可顯著提高峰容量、選擇性和分離度[2,3]。目前全二維色譜正交性研究集中于傳統(tǒng)氣相色譜與液相色譜[4,5]。在傳統(tǒng)的二維液相色譜與氣相色譜中,選用不同分離機(jī)制的色譜柱能顯著增加兩個(gè)維度的正交性與峰容量,從而提高分離效率,但仍存在一些難以避免的缺陷:樣品的不可逆吸附性導(dǎo)致樣品無(wú)法完全進(jìn)入第二個(gè)維度進(jìn)行分析;兩個(gè)維度之間由于不同的分離色譜柱,如正相與反相,導(dǎo)致流動(dòng)相難以兼容。為了充分發(fā)揮二維色譜的分離潛力,從實(shí)質(zhì)上提高二維分辨率,準(zhǔn)確、高效地對(duì)復(fù)雜組分進(jìn)行分離分析,構(gòu)建高正交性的色譜分離體系已經(jīng)成為多維色譜研究的熱點(diǎn)[6,7]。正交性與峰容量是衡量多維色譜在分離能力與分離機(jī)制獨(dú)立性水平的重要參數(shù)[8]。

逆流色譜(countercurrent chromatography, CCC)是近年來(lái)興起的高效分配色譜技術(shù),其主要特征為流動(dòng)相與固定相均為液體,因此固定相無(wú)需固體載體,運(yùn)行與維護(hù)成本相對(duì)較低且容易實(shí)現(xiàn)樣品的制備性分離。與傳統(tǒng)液相色譜相比,具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì):①?zèng)]有不可逆吸附發(fā)生;②對(duì)進(jìn)樣樣品要求低,無(wú)需復(fù)雜預(yù)處理;③樣品進(jìn)樣量大,常規(guī)進(jìn)樣量可達(dá)數(shù)百毫克至克級(jí)。因此逆流色譜技術(shù)與傳統(tǒng)液相色譜分離技術(shù)理論上具有良好的互補(bǔ)性。然而,以這兩種技術(shù)為基礎(chǔ)的全二維色譜研究報(bào)道不多,僅有少量文獻(xiàn)應(yīng)用于石油化工、中藥揮發(fā)油的分離分析中[9-11]。筆者所在課題組采用全二維逆流色譜-液相色譜對(duì)中藥虎杖醇提物、三七皂苷等天然產(chǎn)物進(jìn)行了分離分析,結(jié)果表明兩種色譜技術(shù)即使均在反相洗脫條件下,仍然具有良好的互補(bǔ)性[12-14]。目前尚未見(jiàn)對(duì)全二維逆流色譜-液相色譜分離中藥揮發(fā)油的正交性進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.、廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS. G. Lee et C. F. Liang或溫郁金CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling的干燥根莖。莪術(shù)主要用于癥瘕痞塊,瘀血經(jīng)閉,胸痹心痛,食積脹痛?！吨袊?guó)藥典》記載莪術(shù)根莖中揮發(fā)油不得少于1.5%(mL/g),主要為倍半萜類(lèi)和單萜類(lèi)化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用[15]。由于揮發(fā)油成分復(fù)雜,常規(guī)分離分析方法無(wú)法完全分離其組成,研究針對(duì)揮發(fā)油的新型分離分析方法對(duì)于闡明揮發(fā)油藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、篩選活性成分、質(zhì)量控制及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用都具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20A,島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司);半制備型高速逆流色譜儀(TBE-200V,上海同田生物技術(shù)有限公司);柱塞式恒流泵(s-1007,北京圣益通技術(shù)有限公司);恒溫循環(huán)器(HX-1050,寧波新芝生物科技有限公司);色譜3000工作站(Sepu3000,杭州普惠科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI R-300,瑞士步琦公司);自動(dòng)部分收集器(BSZ-160,上海嘉鵬科技有限公司)。

莪術(shù)油購(gòu)自江西省吉水縣順民藥用香料油提煉廠(chǎng);甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher Scientific公司),液相色譜用水為實(shí)驗(yàn)室重蒸水,其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 液相色譜條件

色譜柱為島津Shim-pack GIS C18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相A為乙腈,B為水。梯度洗脫條件:0～10 min, 50%A～65%A; 10～14 min, 65%A; 14～21 min, 65%A～85%A; 21～25 min, 85%A～95%A; 25～30 min, 95%A～55%A; 30～40 min, 55%A。流量1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

1.3 樣品溶液配制

精密量取莪術(shù)油10.0 mg溶于50 mL容量瓶中,用甲醇-水(70∶30, v/v)稀釋至刻度。

1.4 逆流色譜條件

逆流色譜分離均為頭-尾洗脫模式,溶劑體系為正己烷-甲醇-水(5∶4∶1, v/v/v),充分混勻后在分液漏斗中靜置分層,待兩相平衡后,將兩相分別放入試劑瓶?jī)?nèi),超聲脫氣15 min。將上相泵入逆流色譜分離柱內(nèi)作為固定相,調(diào)節(jié)分離柱轉(zhuǎn)速至800 r/min,待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后,將溶劑體系的下相作為逆流色譜流動(dòng)相,以流量2 mL/min泵入柱內(nèi)。當(dāng)分離柱內(nèi)兩相平衡后,采用六通閥注入莪術(shù)油50 mg,樣品用各5 mL上相和下相超聲溶解,作為進(jìn)樣樣品。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm,采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫組分,每1 min收集一個(gè)洗脫組分。

1.5 數(shù)據(jù)處理

液相色譜數(shù)據(jù)通過(guò)島津Labsolution軟件導(dǎo)出,逆流色譜數(shù)據(jù)通過(guò)Sepu3000工作站導(dǎo)出,全二維色譜分離莪術(shù)油的等高線(xiàn)圖通過(guò)Matlab繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件優(yōu)化

2.1.1液相色譜條件的優(yōu)化

建立并優(yōu)化反相高效液相色譜分離莪術(shù)油成分的方法,對(duì)流動(dòng)相組成、流動(dòng)相比例、分析時(shí)間以及檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。

實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)采用甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)并不能有效分離莪術(shù)油化學(xué)成分,有機(jī)相更改為乙腈后,在峰形、峰數(shù)和分離度方面,都有較為明顯的改觀(guān)。因此,選擇流動(dòng)相為乙腈-水體系。

同時(shí),考慮到離線(xiàn)全二維色譜分析時(shí)間的要求,對(duì)液相色譜分析時(shí)間設(shè)定在30 min。莪術(shù)油主要化學(xué)成分為倍半萜類(lèi)和單萜類(lèi)化合物,包括β-欖香烯、吉馬酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、莪術(shù)二酮、莪術(shù)烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯等,大多數(shù)成分含有雙鍵,因此檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為215 nm。圖1為莪術(shù)油的反相高效液相色譜圖。

圖1 莪術(shù)油反相高效液相色譜色譜圖Fig. 1 Chromatogram of Curcuma volatile oil by reversed-phase high performance liquid chromatography

2.1.2逆流色譜條件的優(yōu)化

逆流色譜屬于液液分配色譜,其分離條件的選擇與傳統(tǒng)液相色譜有較大區(qū)別,一般認(rèn)為逆流色譜分離條件的優(yōu)化主要取決于兩相溶劑體系的篩選以及洗脫模式的確定。逆流色譜兩相溶劑體系的篩選主要考慮:溶劑體系對(duì)樣品的溶解度大小;兩相溶劑體系分層時(shí)間一般不超過(guò)30 s;目標(biāo)組分在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)應(yīng)為0.2～5.0。分配系數(shù)太大,保留時(shí)間較長(zhǎng),色譜峰展寬變大;分配系數(shù)過(guò)小,則保留時(shí)間很短,樣品中目標(biāo)組分容易與流動(dòng)相前沿一同洗脫出來(lái)從而導(dǎo)致分離度較差。因此,在傳統(tǒng)的逆流色譜分離天然產(chǎn)物、合成產(chǎn)物以及發(fā)酵產(chǎn)物等混合物時(shí),目標(biāo)組分分配系數(shù)的測(cè)定非常重要,通常采用液相色譜、氣相色譜或薄層色譜用于測(cè)定混合物樣品中目標(biāo)組分在兩相中的分配系數(shù),分別測(cè)定目標(biāo)組分在溶劑體系上相和下相中的濃度,根據(jù)濃度的比值計(jì)算分配系數(shù),或者在薄層色譜上判斷分配情況,直至篩選到合適的溶劑體系用于目標(biāo)組分的分離。針對(duì)混合物中目標(biāo)組分的分離,關(guān)于逆流色譜溶劑體系的選擇已有較多的文獻(xiàn)和著作進(jìn)行了系統(tǒng)介紹[16-19]。

由于本文主要探討逆流色譜反相洗脫模式下與傳統(tǒng)反相高效液相色譜分離天然產(chǎn)物成分的互補(bǔ)性,并非分離純化莪術(shù)油中的目標(biāo)成分,本研究中溶劑體系的篩選需要考慮莪術(shù)油中整體化學(xué)成分的分配情況。由于莪術(shù)油為淡黃色液體,因此我們采用了簡(jiǎn)單易行的比色法來(lái)篩選溶劑體系,觀(guān)察莪術(shù)油在兩相體系中的分布情況來(lái)篩選兩相體系。中藥揮發(fā)油大多數(shù)成分為小極性組分,因此主要考察了小極性溶劑體系。分離揮發(fā)油的常用溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-乙腈體系、正己烷-乙醇-乙腈體系、正己烷-乙腈-水體系和正己烷-甲醇-水體系等。通過(guò)比色法,發(fā)現(xiàn)正己烷-乙腈-水(5∶2∶3, v/v/v)和正己烷-甲醇-水(5∶3∶2或5∶4∶1, v/v/v)可以達(dá)到理想的樣品分配效果,考慮到試劑環(huán)保性與經(jīng)濟(jì)性,重點(diǎn)考察了正己烷-甲醇-水體系。由圖2可見(jiàn),莪術(shù)油在正己烷-甲醇-水(5∶4∶1, v/v/v)體系中兩相能夠均勻溶解,呈現(xiàn)接近的顏色。因此,選擇正己烷-甲醇-水(5∶4∶1, v/v/v)作為分離揮發(fā)油的兩相溶劑體系,其中水相作為流動(dòng)相,有機(jī)相作為固定相。

圖2 比色法篩選兩相溶劑體系Fig. 2 Selection of biphasic solvent system by colorimetric method

根據(jù)上述篩選的兩相溶劑體系正己烷-甲醇-水(5∶4∶1, v/v/v),采用逆流色譜分離莪術(shù)油成分,上相為固定相,下相為流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3a,其中保留時(shí)間225 min開(kāi)始為洗脫推擠模式。從圖中可以看出,莪術(shù)油主要化學(xué)成分主要集中在130 min以?xún)?nèi),未能得到理想的分離與均勻分散,與液相色譜類(lèi)似,等度洗脫條件下組分無(wú)法獲取良好的分離。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了梯度洗脫的方法,將水相中甲醇含量逐步提升。梯度洗脫條件:0～55 min,正己烷-甲醇-水(5∶2∶3, v/v/v); 55～170 min,正己烷-甲醇-水(5∶3∶2, v/v/v); 170～290 min,正己烷-甲醇-水(5∶4∶1, v/v/v)。290～375 min,采用推擠洗脫。推擠洗脫過(guò)程中流速為5 mL/min,固定相保留率為57.9%。結(jié)果表明,揮發(fā)油組分的分離有了明顯改善,且均勻分散在一定的保留時(shí)間內(nèi),見(jiàn)圖3b。

圖3 莪術(shù)油在(a)等度洗脫和(b)梯度洗脫模式下的逆流色譜圖Fig. 3 Countercurrent chromatograms (CCC) of Curcuma volatile oil by (a) isocratic elution and (b) gradient elution

2.2 全二維逆流色譜-液相色譜圖譜構(gòu)建

在第一維逆流色譜梯度洗脫分離過(guò)程中,從逆流色譜保留時(shí)間25 min開(kāi)始至310 min內(nèi)每1 min收集一個(gè)樣品,共收集得到285個(gè)逆流洗脫組分。每一個(gè)組分進(jìn)行液相色譜分析,以液相色譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行Matlab作圖,得到全二維色譜的化學(xué)成分等高線(xiàn)圖(圖4)。從圖中可以看出,莪術(shù)油中主要成分都得到了良好分離,且兩個(gè)維度的色譜分離構(gòu)成了良好的互補(bǔ)性,含量高的幾個(gè)主要成分在液相色譜中未能良好分離,但是在逆流色譜中得到了很好的分離;同樣在逆流色譜無(wú)法分離的組分,在液相色譜中具有良好的分離度,譬如圖中組分A和B以及組分C和D。A和B兩個(gè)組分在HPLC中同時(shí)洗脫,洗脫時(shí)間為12.1 min,而在逆流色譜分離中A和B的保留時(shí)間分別為100 min和140 min,得到完全分離;在逆流色譜分離過(guò)程中,洗脫時(shí)間為170～195 min時(shí),C和D兩個(gè)化合物同時(shí)洗脫,但在HPLC中分離獲得保留時(shí)間為14.5 min和17.4 min的化合物C和D。逆流色譜分離主要依據(jù)溶質(zhì)分配系數(shù)的差異,而液相色譜兼具有固液吸附與液液分配保留機(jī)理,因此反相液相色譜與反相逆流色譜存在良好的互補(bǔ)性,從正交性角度進(jìn)行二維色譜的分離,可以顯著提高樣品分離度。

圖4 離線(xiàn)全二維逆流色譜-液相色譜分離莪術(shù)油的二維等高線(xiàn)圖Fig. 4 2D contour plot of off-line comprehensive two-dimensional countercurrent chromatography-liquid chromatographic separation of Curcuma volatile oil

2.3 全二維色譜分離莪術(shù)油正交性分析

2.3.1峰容量

根據(jù)Giddings多維色譜峰容量計(jì)算方法,梯度洗脫條件下采用公式(1)對(duì)全二維逆流色譜-液相色譜分離莪術(shù)油成分的峰容量進(jìn)行計(jì)算[20]:

(1)

其中,tg為梯度運(yùn)行時(shí)間(min),Wb為峰寬(min),n為峰數(shù),nc為梯度洗脫維度峰容量。根據(jù)計(jì)算分析,梯度洗脫一維逆流色譜分離峰個(gè)數(shù)為18個(gè),二維HPLC分離峰個(gè)數(shù)為53個(gè),二維分離理論總峰容量達(dá)到954個(gè)。相比于單一維度的分離,全二維色譜分離大大提高了樣品分離能力。

2.3.2空間覆蓋率與線(xiàn)性相關(guān)性

空間覆蓋率是指二維分離過(guò)程中溶質(zhì)對(duì)二維分離空間的利用情況,是二維分離實(shí)際峰容量計(jì)算的重要參數(shù)?？臻g覆蓋率有多種計(jì)算方法,常見(jiàn)的有格子計(jì)數(shù)法和凸包計(jì)算法,其中凸包計(jì)算法能夠涵蓋線(xiàn)性溶劑化能關(guān)系所預(yù)測(cè)的最大期望覆蓋面積,不受格子計(jì)數(shù)法中格子個(gè)數(shù)、峰寬的影響,不需要考慮覆蓋區(qū)域的具體形狀,可采用Matlab腳本快速、準(zhǔn)確的運(yùn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用凸包計(jì)算法得到的空間覆蓋率為68.1%。

線(xiàn)性相關(guān)性是指被分離溶質(zhì)在二維色譜分離過(guò)程中與兩個(gè)維度固定相以及流動(dòng)相之間的相互作用的差異性,主要體現(xiàn)了分離機(jī)制的差異性引起溶質(zhì)保留行為的差異。本研究中逆流色譜與液相色譜盡管均采用反相洗脫模式,由于其分離機(jī)制的差異引起溶質(zhì)保留行為的差異非常顯著。當(dāng)線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r為0時(shí),說(shuō)明兩個(gè)維度分離具有很弱的相關(guān)性,兩個(gè)維度色譜對(duì)溶質(zhì)選擇性的差異很大,即很強(qiáng)的正交性;當(dāng)線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r為1時(shí),說(shuō)明兩個(gè)維度分離具有很強(qiáng)的相關(guān)性,兩個(gè)維度色譜對(duì)溶質(zhì)選擇具有很強(qiáng)的相似性,基本不存在正交性[21]。本文分別對(duì)逆流色譜與液相色譜各個(gè)出峰時(shí)間進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算歸一化處理后的數(shù)據(jù)相關(guān)性,得到r為0.17,表明兩個(gè)維度的色譜分離莪術(shù)油具有弱相關(guān)性,即該二維色譜體系具有良好的正交性。進(jìn)一步表明離線(xiàn)全二維逆流色譜-液相色譜是分離莪術(shù)油等復(fù)雜樣品的一種有效方法。

3 結(jié)論

本文主要考察了全二維逆流色譜-液相色譜分離莪術(shù)油成分的能力,通過(guò)建立并優(yōu)化各自的分離分析方法,構(gòu)建了莪術(shù)油成分的二維色譜等高線(xiàn)圖譜,并采用空間覆蓋率、線(xiàn)性相關(guān)性以及峰容量等參數(shù)對(duì)其正交性進(jìn)行定量分析。研究結(jié)果表明,與一維色譜分離相比,二維色譜峰容量提高了10倍以上。研究工作不僅為天然產(chǎn)物等復(fù)雜體系提供了新的分離分析方法,同時(shí),由于流動(dòng)相的良好兼容性?xún)?yōu)勢(shì),為構(gòu)建新型的全二維色譜方法提供了思路。