基于線粒體CO Ⅰ基因的6 個(gè)鯉亞科種群遺傳結(jié)構(gòu)研究

■ 文｜廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 姚東林 朱靜璇 羅文范 何元文

清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心 王超

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院 謝少林

鯉（Cyprinus carpiolinnaeus）是中國(guó)最常見(jiàn)的鯉屬魚(yú)類，伍獻(xiàn)文先生將中國(guó)的鯉分為四個(gè)亞種，其中華南鯉是鯉在華南地區(qū)亞種，分布于珠江水系及其南部包括海南島在內(nèi)的華南地區(qū)，華南鯉是華南地區(qū)分布最為廣泛的鯉屬魚(yú)類，遍布于華南地區(qū)各水系。三角鯉（Cyprinus multitaeniatapellegrin et chevey）分類上為鯉屬、中鯉亞屬（Mesocyprinus Fang），又名黃板鯽、黃鯽和江鯽，其分布范圍很小，主要分布于我國(guó)廣西珠江水系支流的西江流域，據(jù)資料記載在越南的紅河也有少量分布。尖鰭鯉（Cyprinus acutidorsalisWang）分類上為鯉屬、鯉亞屬（Cyprinus linnaeus,s.Str.），又名海鯉、海鯽，是我國(guó)特有的生活于咸淡水中的鯉科魚(yú)類，目前僅在我國(guó)的廣西欽江出?？谟邪l(fā)現(xiàn)分布。須鯽（Carassioidescantonensis Heincke）屬于鯉亞科須鯽屬（Carassioides Oshima），又名黃鯽、江鯽，據(jù)報(bào)道僅在在我國(guó)珠江流域和海南島等少數(shù)地方有分布，且數(shù)量較少。目前已知須鯽分布范圍小，且相關(guān)報(bào)道很少。2013年有研究報(bào)道我國(guó)云南地區(qū)也有須鯽的發(fā)現(xiàn)。除此之外于《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》和《海南島淡水及河口魚(yú)類志》等文獻(xiàn)中也有報(bào)道。

細(xì)胞線粒體的COⅠ基因序列（細(xì)胞色素c氧化酶I）作為分子標(biāo)記具有諸多優(yōu)勢(shì)：有相對(duì)保守而又有足夠的變異、序列長(zhǎng)度合適、可用通用引物擴(kuò)增和測(cè)序等，COⅠ分子標(biāo)記作為DNA條形碼可以快速鑒定物種，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于物種鑒定。

因此，本研究選取了華南地區(qū)5個(gè)水系作為采樣點(diǎn)，采集了華南鯉、尖鰭鯉、三角鯉和須鯽共6個(gè)地理種群，其中包括：華南鯉的海南萬(wàn)泉河種群、珠江水系主干河流網(wǎng)的高明河（肇慶）種群和廣東東部榕江種群；廣西欽江水系的尖鰭鯉種群；廣西珠江水系西江的三角鯉種群；海南萬(wàn)泉河水系的須鯽種群。

一、材料與方法

1.儀器

超凈工作臺(tái)；立式電熱壓力蒸汽滅菌器；超純水系統(tǒng)；PCR儀；RDY-SPIZ瓊脂糖水平電泳儀；小型高速冷凍離心機(jī)；漩渦震蕩器；臺(tái)式恒溫振蕩箱，電熱恒溫水浴鍋；ALPHA IMAGER 2200凝膠成像分析系統(tǒng)；JY600+型雙恒電泳儀；-80℃超低溫冰箱；-20℃冰箱；電子分析天平；微量移液器等。

2.實(shí)驗(yàn)試劑與試劑盒

無(wú)水乙醇，75%乙醇，去離子水，雙蒸水，瓊脂糖、TIANGEN蛋白酶K（20mg/mL）、瓊脂糖、Tris平衡酚、苯酚、氯仿、異戊醇、核酸染色劑EB（溴化乙錠）、6×Loading buffer上樣品緩沖液、DL2000DNAmarker、TIANGENDNA 提取試劑盒、TIANGEN普通瓊脂凝膠DNA回收試劑盒、2×TAQPCRMAasterMIX等。

3.自配實(shí)驗(yàn)試劑

50×TAE電泳緩沖液；1×TAE電泳緩沖液；苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）；組織細(xì)胞裂解液；E緩沖液（pH8.0）等。

4.樣品采集與處理

樣品采集地點(diǎn)和種類如表1所示。將采集的魚(yú)取一小塊鰭條或者肌肉組織，放置于裝有無(wú)水乙醇的5mL離心管中保存待測(cè)。

表1 樣品采集地點(diǎn)和種類

5.DNA提取和檢測(cè)

提?。罕狙芯緿NA提取分為兩種，分別為自配試劑提取和試劑盒提取，試劑盒提取按照TIANGEN試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

檢測(cè)：取5μL已提取的DNA樣品液并加入1μL的 6×Loading buffer上樣品緩沖液混勻，用移液槍逐個(gè)加入凝膠點(diǎn)樣孔中，同時(shí)保留一孔點(diǎn)上DL2000的DNAmarker，設(shè)置電壓120V進(jìn)行恒定電壓電泳，定時(shí)30min，取出凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)，打開(kāi)電腦軟件進(jìn)行觀察，拍照并記錄DNA提取情況。

6.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

本研究根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的鯉科目魚(yú)類相關(guān)序列， 線粒體C OⅠ序列引物采用引物：FishF1：5'-TCAACCAACCACAA AGACATTGGCAC-3'，F(xiàn)ishR1：5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAA AGAATCA-3'。

線粒體COⅠ序列引物FishF1/FishR1PCR擴(kuò)增程序：94.0℃預(yù)變性4min；94.0℃變性30s，60℃退火30s，72.0℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72.0℃延伸5min，4℃保存。

7.DNA序列測(cè)定

將PCR所得產(chǎn)物PCR直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)所得DNA條帶的產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州測(cè)序部進(jìn)行DNA序列測(cè)序。

8.數(shù)據(jù)處理

采用Chromas軟件查看序列的測(cè)序效果，并以此為依據(jù)判斷測(cè)序是否準(zhǔn)確。使用MEGA6.06軟件的ClustalW功能進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行人工矯正，去除受干擾序列片段后計(jì)算堿基組成比例、平均堿基數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等數(shù)值。使用DNASP軟件進(jìn)行中性假說(shuō)檢驗(yàn)（Fu's Fs-test和Tajima's D算法）和核苷酸分析，并計(jì)算平均核苷酸差異值和核苷酸多樣性。使用Allequin V3.5.1.3軟件分析單倍型多樣性和單倍型組成等。

二、結(jié)果

1.PCR擴(kuò)增結(jié)果

獲得清晰的條帶，如圖1、2所示。

圖1 COⅠ序列FishF1/FishR1引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果，從左邊數(shù)起：1～3三角鯉，4～6為尖鰭鯉，7～9為須鯽，10為mark。

圖2 COⅠ標(biāo)記FishF1/FishR1的PCR擴(kuò)增結(jié)果，從左邊數(shù)起：1為mark，2～4為海南鯉，5～7為珠江鯉，8～10為榕江鯉。

2.COⅠ序列結(jié)構(gòu)和變異

一共獲得COⅠ序列共109個(gè)，其中：海南鯉19個(gè)；珠江鯉16個(gè)；榕江鯉17個(gè)；須鯽18個(gè)；尖鰭鯉18個(gè)；三角鯉21個(gè)。利用MEGA6.0比對(duì)線粒體控制區(qū)序列，并去除兩端不準(zhǔn)確的序列，獲得610bp的序列（珠江鯉有一個(gè)序列多出一個(gè)堿基，為611bp）。各種群COⅠ序列的A+T平均含量（54.09±0.56）高于C+G的平均含量（45.92±0.56）。在六個(gè)種群中，須鯽的A+T比例最高，為54.76%，而三角鯉最低，為53.12%，而海南鯉、珠江鯉、榕江鯉和尖鰭鯉分別為53.99%、54.34%、54.37%、53.94%，可見(jiàn)六個(gè)種群COⅠ序列的堿基組成差異不大。

3.基于線粒體COⅠ的遺傳多樣性分析

根據(jù)表3和表4，可以發(fā)現(xiàn)COⅠ序列總樣本間的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為92個(gè)，平均核苷酸差異值為31.094，核苷酸多樣性值為0.05097，單倍型多樣性為0.884。在六個(gè)群體中，珠江鯉的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)目（ZL）最多，為5個(gè)，而其次依次為：海南鯉、榕江鯉都為4個(gè)，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉沒(méi)有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)?；贑OⅠ序列，珠江鯉簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)目，核苷酸多樣性和單倍型多樣性等指標(biāo)最大，這從一定程度上說(shuō)明了珠江鯉的COⅠ序列多樣性最大，其次分別是海南鯉和榕江鯉，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉COⅠ序列的多樣性非常小，明顯小于三個(gè)鯉群體，其中尖鰭鯉沒(méi)有COⅠ序列變異，而須鯽和三角鯉分別只有一個(gè)單點(diǎn)突變位點(diǎn)，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

表3 CO Ⅰ序列位點(diǎn)信息和多樣性分析

表4 CO Ⅰ序列單倍型在各種群間的分布

在六個(gè)群體109個(gè)COⅠ序列中共有17種單倍型，其中海南鯉、珠江鯉和榕江鯉有兩種三者共有的單倍型，為Hd1和Hd4。而海南鯉和珠江鯉除了Hd1和Hd4外沒(méi)有其他共同單倍型。珠江鯉和榕江鯉除了Hd1和Hd4外，還有Hd6為共同單倍型。此外，海南鯉有3種特有單倍型，為Hd2、Hd3、Hd5；珠江鯉有4種特有單倍型，分別為Hd7～Hd10；須鯽有兩種單倍型，都為特有單倍型，其中Hd13單倍型有17個(gè)個(gè)體，而Hd14單倍型的個(gè)體僅為1個(gè)；尖鰭鯉只有一種單倍型，為特有單倍型；三角鯉有兩種單倍型，都為特有單倍型，其中Hd16為20個(gè)個(gè)體，而Hd17僅為一個(gè)個(gè)體。

4.種群動(dòng)態(tài)分析和中性檢驗(yàn)

由表5 可得，而在基于COⅠ的遺傳距離中三個(gè)華南鯉種群的遺傳距離在0.0024～0.0035之間，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的內(nèi)部遺傳則接近于0，說(shuō)明華南鯉三個(gè)種群基于COⅠ序列的種內(nèi)差異水平大致相同，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群內(nèi)的COⅠ序列則幾乎沒(méi)有差距。

表5 各種群內(nèi)部基于線粒體CO Ⅰ的Kimura 雙參數(shù)模型遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)差

根據(jù)表6，基于線粒體COⅠ序列的Tajima's D和Fu's Fs statistic值中，當(dāng)以所有群體為對(duì)象時(shí)，中性檢測(cè)數(shù)值為正數(shù)且有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明了在以所有種群線粒體COⅠ為檢驗(yàn)對(duì)象時(shí)，群體間變異符合中性假說(shuō)，且可以認(rèn)為在種群間在較近歷史內(nèi)沒(méi)有發(fā)生較大的種群擴(kuò)張。

表6 基于線粒體CO Ⅰ序列的中性檢驗(yàn)

三、討論

三個(gè)華南鯉種群在COⅠ序列上存在共同單倍型，其中基于線粒體的三個(gè)種群共同單倍型只有一個(gè)，而海南鯉和珠江鯉兩者之間共同單倍型為5個(gè)，珠江鯉和榕江鯉兩者的共同單倍型為3個(gè)。此外，海南鯉和榕江鯉并沒(méi)有共同單倍型，這也說(shuō)明了珠江鯉可能是海南鯉和榕江鯉的發(fā)源地，通過(guò)冰期或者地貌運(yùn)動(dòng)等原因分別進(jìn)入到不同流域?；诳?cè)后wTajima's D和Fu's Fs statistic的中性檢測(cè)值符合中性學(xué)說(shuō)，說(shuō)明群體內(nèi)的簡(jiǎn)約位點(diǎn)和單點(diǎn)突變等多數(shù)突變是中性的，且近期并沒(méi)有較大的自然選擇壓力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)尖鰭鯉、三角鯉和須鯽三者沒(méi)有出現(xiàn)共同單倍型，由此可見(jiàn)，三者之間在短期內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)種群交流，同時(shí)說(shuō)明彼此間種群分化較大。而三角鯉和須鯽與華南鯉之間也沒(méi)有共同單倍型，這也說(shuō)明了三角鯉和須鯽在較近的歷史內(nèi)沒(méi)有和華南鯉有基因交流，且物種分離的歷史比較久遠(yuǎn)。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量種群遺傳多樣性（Genetic diversity）的重要指標(biāo)，可以作為物種保護(hù)的重要參考。本研究表明，基于線粒體COⅠ標(biāo)記的單倍型多樣性中，珠江鯉遺傳多樣性最高，為0.867，其次為榕江鯉和海南鯉種群，分別為0.735和0.708，而核苷酸多樣性珠江鯉（0.00351）和榕江鯉（0.00351）一致，高于海南鯉（0.00313），這說(shuō)明了海南鯉雖然具備較高的單倍型多樣性，但是沒(méi)有足夠的時(shí)間積累核苷酸多樣性，單倍型之間的核苷酸差異小于珠江鯉和榕江鯉。此外，須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群基于COⅠ序列的核苷酸多樣性較低，核苷酸多樣性分別為0.00018、0和0.00016；而基于COⅠ序列的單倍型多樣性分別為0.111、0和0.095，其多樣性指標(biāo)遠(yuǎn)低于華南鯉的三個(gè)種群。這表明須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的COⅠ序列上還沒(méi)積累足夠的變異。由于須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群的中性檢測(cè)Tajima's D和Fu's Fs statistic值都沒(méi)有出現(xiàn)具有顯著差異性的負(fù)值，因此不能證明其在短期內(nèi)經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張。本研究認(rèn)為須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群基于COⅠ序列多態(tài)性低的可能原因有兩個(gè)：一是須鯽、尖鰭鯉和三角鯉都是分布范圍很小的地方性品種，且受到時(shí)間、空間等因素影響，本研究采樣的種群多樣性也受到限制，容易出現(xiàn)近緣個(gè)體，也可能是遺傳多樣性較小的原因之一。二是地方特有種往往生存競(jìng)爭(zhēng)力較低，容易受到外來(lái)入侵物種和外界環(huán)境的干擾而導(dǎo)致種群規(guī)模大量減少，當(dāng)種群規(guī)?；謴?fù)后其種群容易出現(xiàn)同質(zhì)性高而多樣性低的特點(diǎn)，且COⅠ序列的堿基突變速率相對(duì)于線粒體控制區(qū)較慢，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的線粒體COⅠ序列上還沒(méi)積累足夠多的變異。