陳凱欣,趙 溪,邱齊駿,吳 娣,2,彭 扣,2

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330031; 2.江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330031; 3.江西省撫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,撫州 344000)

池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、蚌科(Unionidae)、帆蚌屬(Hyriopsis),因其育珠性能佳、產(chǎn)珠品質(zhì)優(yōu)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn),是我國(guó)一種重要的淡水育珠蚌。水溫是影響貝類存活、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫功能和分布的主要環(huán)境因子之一,水溫超過(guò)一定范圍,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致其生理功能減弱、免疫功能降低,甚至死亡[1]。溫度脅迫是指生物對(duì)正常生存溫度之外溫度的反應(yīng),包括低溫脅迫和高溫脅迫[2-3]。就淡水育珠貝而言,20～35 ℃是其生活的適宜溫度。高于35 ℃會(huì)造成熱昏迷現(xiàn)象,影響珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量,高于40 ℃會(huì)造成育珠貝死亡[4]。池蝶蚌作為重要的淡水育珠蚌之一,在育珠生產(chǎn)過(guò)程中,容易遭受病原微生物侵襲。近年來(lái),病害影響給我國(guó)淡水育珠業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此,提高淡水育珠蚌抗高溫?zé)岷兔庖叻烙芰?duì)其養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

熱激蛋白(Heat shock protein,HSP)是生物體內(nèi)與抗逆相關(guān)的一類十分重要的蛋白質(zhì),對(duì)機(jī)體免受應(yīng)激因素?fù)p害和增強(qiáng)機(jī)體對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性,維持細(xì)胞正常生理功能具有重要作用[6]。HSP70家族是HSP超家族的重要成員,分子質(zhì)量為68～74 ku,是一類應(yīng)激保護(hù)蛋白[6]。研究表明,HSP70家族成員在幫助機(jī)體應(yīng)答高溫、缺氧、重金屬、病菌感染等環(huán)境脅迫方面起關(guān)鍵作用,具分子伴侶功能,能幫助蛋白進(jìn)行重新正確折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn),清除錯(cuò)誤折疊、受損或變性蛋白[6]。HSP70作為HSP超家族中最保守的蛋白,廣泛存在于各種生物體內(nèi),已從植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)成功克隆出HSP70基因[6]。

在無(wú)脊椎軟體動(dòng)物中,已開展多種重要經(jīng)濟(jì)貝的HSP70序列測(cè)定及其表達(dá)研究,如長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[7]、美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[8]、食用牡蠣(Ostreaedulis)[9]、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[10]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[11]、文蛤(Meretrixmeretrix)[12]、合浦珠母貝(Pinctadamartensii)[13]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[14]、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)[15]、褶紋冠蚌(Cristariaplicata)[16]和三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[5]等,發(fā)現(xiàn)HSP70家族在貝類中參與各種環(huán)境脅迫應(yīng)答,起重要保護(hù)作用。研究表明,縊蟶急性高溫脅迫4 h時(shí)HSP70在肝胰腺和鰓中表達(dá)量開始顯著升高[1]。皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)受熱刺激和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)感染后肌肉和鰓組織中的HSP70的表達(dá)顯著提高[17]。熱休克和菌脅迫厚殼貽貝能顯著增強(qiáng)HSP70基因在鰓和肝胰腺中的表達(dá)水平[18]。但未見(jiàn)急性脅迫下池蝶蚌HSP70家族成員表達(dá)特征分析的報(bào)道。嗜水氣單胞菌是廣泛分布于水體中兼性厭氧型的致病菌,淡水育珠蚌細(xì)菌性瘟病可能與之相關(guān)[19],本研究報(bào)道了池蝶蚌HSP70家族成員HSP70B2-like cDNA全長(zhǎng)序列,并研究了池碟蚌HSP70B2-like在不同組織和急性高溫及注射嗜水氣單胞菌脅迫后相關(guān)組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征,旨在為池蝶蚌抗逆生理研究提供資料,為其抗逆品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

池蝶蚌采自撫州市南城縣洪門水庫(kù)池蝶蚌良種養(yǎng)殖基地,為三齡健康蚌,經(jīng)測(cè)量殼長(zhǎng)為(120±4.5)mm、殼寬(69.21±1.6)mm、殼高(324±0.5)mm。池蝶蚌取回實(shí)驗(yàn)室置水族箱(800 mm×400 mm×400 mm)中暫養(yǎng)一周。水溫控制在(25±1)℃,pH(7.5±0.1),連續(xù)充氣,每2天換水1/3,并投喂適量小球藻。暫養(yǎng)結(jié)束后,隨機(jī)選取3只蚌以Trizol法提取池蝶蚌的肝胰腺組織的總RNA用于RACE-PCR。組織表達(dá)檢測(cè)隨機(jī)選取3只室溫(25 ℃)培育蚌提取閉殼肌、性腺、縮足肌、肝胰腺、鰓、斧足、腎、外套膜和血細(xì)胞等9個(gè)組織的總RNA用于qPCR。高溫脅迫實(shí)驗(yàn)具體操作簡(jiǎn)述為從培養(yǎng)池中隨機(jī)選取15只蚌,處理方法:15只蚌均預(yù)先常溫(25 ℃)室內(nèi)培養(yǎng)缸充氣養(yǎng)殖一周,待其適應(yīng)環(huán)境穩(wěn)定后,隨機(jī)選3只蚌設(shè)為對(duì)照組,另12只放置在37 ℃的鼓風(fēng)培養(yǎng)箱中高溫脅迫下培養(yǎng),分別在培養(yǎng)6、12、24和48 h后各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3只快速提取鰓、肝胰腺、外套膜、腎、血細(xì)胞和閉殼肌組織總RNA,再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。菌脅迫實(shí)驗(yàn)時(shí),隨機(jī)分5組,每組3只,給每只蚌閉殼肌注射50 μL嗜水氣單胞菌(2.5×109細(xì)胞/mL,PBS重懸),各組脅迫時(shí)間依次為6、12、24和48 h,0 h的對(duì)照組則注射相同劑量的PBS,分別每3只蚌混合取鰓、肝胰腺、血細(xì)胞和閉殼肌等4個(gè)組織。按照此方法重復(fù)3次,非生物和生物脅迫兩種不同刺激處理各組45只蚌,總需90只蚌。

1.2 方法

1.2.1 EST序列獲得

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室池蝶蚌高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選HSP70家族的同源基因序列,從篩查HSP70家族中眾多成員的部分序列中,同源比對(duì)分析后,選定其中一條與GenBank已報(bào)道其他物種HSP70s同源性較高且其ORF序列相對(duì)較完整的HSP70B2-like的EST做進(jìn)一步研究分析。

1.2.2 RNA提取和cDNA模板合成

材料中所述的池蝶蚌各組織解剖后置于預(yù)加液氮的研缽中研磨成粉末后,利用RNAiso Plus 試劑(Takara公司)提取組織總RNA,選用Clontech公司SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit試劑盒用于RACE cDNA合成。選用Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)用于組織表達(dá)熒光定量PCR分析cDNA合成。

1.2.3 cDNA全長(zhǎng)克隆和序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組獲得的池蝶蚌HSP70EST序列設(shè)計(jì)5′RACE和 3′RACE 特異性引物,使用SMARTTMRACE Amplification Kit 和Advantage 2 PCR Kit以RACE cDNA為模板分別進(jìn)行5′和3′ RACE 擴(kuò)增。將表1中的引物HSP70-5GSP1和通用引物UPM配對(duì),進(jìn)行5′端第一輪PCR擴(kuò)增;以稀釋20倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板,再用HSP70-5GSP2和NUP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增;進(jìn)行3′端擴(kuò)增,同上類似則是引物HSP70-3GSP1和HSP70-3GSP2分別同UPM和NUP進(jìn)行配對(duì)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段,純化產(chǎn)物連接pMD19-T 載體后轉(zhuǎn)化到E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌落PCR鑒定的陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 研究用到的引物

利用DNAMAN軟件進(jìn)行全長(zhǎng)序列拼接。DNAStar軟件找到開放閱讀框,推導(dǎo)出其氨基酸序列,在NCBI上BLASTP進(jìn)行序列同源性比對(duì)。用TMHMM軟件跨膜區(qū)分析;使用SignalP 5.0 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。采用MEGA 6.0軟件,基于鄰位結(jié)合法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap設(shè)置重復(fù)1 000次計(jì)算各分支置信度,使用RAxML和MrBayes對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行相似度驗(yàn)證。

1.2.4 qRT-PCR分析

采用qRT-PCR檢測(cè)池蝶蚌HSP70mRNA的組織表達(dá)及高溫脅迫和注射嗜水氣單胞菌后的表達(dá)特征。根據(jù)HSP70cDNA序列和池蝶蚌β-actin(EU047596),分別設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)分析引物 (表1)。將材料中所述的用于qRT-PCR分析提取的相應(yīng)各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)TaKaRa的熒光定量試劑盒(嵌合檢測(cè)法) 進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系和程序參考SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書,采用20 μL反應(yīng)體系,包括10 μL的2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix,1 μL模板,0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.4 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L),0.4 μL ROX Reference DyeⅡ(50×),7.8 μL ddH2O,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),以蒸餾水代替模板作為陰性對(duì)照。熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃變性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。應(yīng)用 2-ΔΔCT法分析相對(duì)表達(dá)值。使用SPSS 17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 池蝶蚌HSP70 B2-like cDNA克隆與序列特征

池蝶蚌HSP70B2-like cDNA為2 209 bp,包括267 bp的5′UTR,25 bp的3′UTR和1 917 bp的ORF,該ORF編碼638個(gè)氨基酸(圖1)。預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為70.40 ku,等電點(diǎn)(pI)為5.70。池蝶蚌HSP70B2-like cDNA提交GenBank,登錄號(hào)為OP429215。SignalP分析其不含信號(hào)肽,TMHMM預(yù)測(cè)其無(wú)跨膜區(qū),該序列含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)(N36,N362,N387,N489),具有HSP70家族保守的3個(gè)標(biāo)簽序列(I10DLGTTYS17,V198FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKVQK350)以及1個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域(A132EAYLGKK139)、雙向核定位序列(K248RKHKKDISKANRALRR264)、底物肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(T383-E545)和C端結(jié)構(gòu)域(R512-P615)(圖1)。

3個(gè)標(biāo)簽序列用藍(lán)色方框標(biāo)出,ATP酶結(jié)構(gòu)域用陰影標(biāo)示,雙向核定位信號(hào)位點(diǎn)用陰影并字母斜體標(biāo)示,糖基化位點(diǎn)字母加粗并下劃線標(biāo)示,C端保守區(qū)域用紅色方框標(biāo)出。

2.2 池蝶蚌HSP70 B2-like序列同源性與系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)BLASTP同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),池蝶蚌HSP70 B2-like與NCBI GenBank發(fā)布的其他物種的HSP70顯示出較高的親緣性,相似性最高的為褶紋冠蚌(C.plicata),達(dá)97.0%。應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)一步對(duì)不同物種HSP70序列多重比對(duì),如圖2所示,不同物種的HSP70在N端不是很保守,而C端的5～7個(gè)氨基酸保守性很強(qiáng)。HSP70家族所具有的標(biāo)簽序列、核定位序列、糖基化位點(diǎn)和特征性結(jié)構(gòu)域在池蝶蚌HSP70 B2-like序列中均可找到,較為保守。

3個(gè)標(biāo)簽序列用藍(lán)色方框標(biāo)出,ATP酶結(jié)構(gòu)域用加粗上劃線標(biāo)示,雙向核定位信號(hào)位點(diǎn)用雙箭頭標(biāo)示,糖基化位點(diǎn)用箭頭標(biāo)出,C端保守區(qū)域用紅色方框標(biāo)示。各物種的HSP70序列登錄號(hào):池蝶蚌(OP429215),褶紋冠蚌(ADM64336.1),三角帆蚌(AHN82525.1),長(zhǎng)牡蠣 (XP_011435905.1),紫貽貝(CAH04106.1),斑馬魚 (NP_001093532.1),非洲爪蟾(NP_001121147.1),原雞(NP_001006686.1),人(NP_005336.3),果蠅(NP_731651.1)。

通過(guò)MEGA 6.0軟件鄰接法構(gòu)建池蝶蚌HSP70 B2-like系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),池蝶蚌HSP70 B2-like與加州紅鮑(Haliotisrufescens)、福壽螺(Pomaceacanaliculata)、美洲簾蛤(Mercenariamercenaria)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、美洲牡蠣(C.virginica)、長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)等軟體動(dòng)物的HSP70家族中B2亞家族聚為同一分支簇(圖3)。池蝶蚌首先與褶紋冠蚌(C.plicata)聚為一小分支,且和紫貽貝(M.galloprovincialis)的HSP70均落在B2亞家族分支簇。報(bào)道的三角帆蚌(H.cumingii)HSP70未落在軟體動(dòng)物分支簇上。果蠅(Drosophilamelanogaster)、美洲斑潛蠅(Liriomyzasativae)、煙草天蛾(Manducasexta)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)等節(jié)肢動(dòng)物的HSP70匯聚成另一分支簇。斑馬魚(Daniorerio)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、原雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)、家犬(Canislupusfamiliaris)、馬(Equuscaballus)和人(Homosapiens)等脊椎動(dòng)物的HSP70則匯聚成另一不同分支簇。應(yīng)用RAxML和MrBayes構(gòu)建發(fā)育樹均得到類似聚類結(jié)果。

各物種的HSP70序列登錄:池蝶蚌(OP429215),褶紋冠蚌(ADM64336.1),三角帆蚌(AHN82525.1),福壽螺(XP_025099490.1),長(zhǎng)牡蠣 (XP_011435905.1),美洲牡蠣(XP_022315428.1),蝦夷扇貝(XP_021370483.1),美洲簾蛤(XP_045165411.1),紫貽貝(CAH04106.1),加州紅鮑(XP_046367549.1),斑馬魚(NP_001093532.1),非洲爪蟾 (NP_001121147.1),原雞(NP_001006686.1),小鼠(AAC84169.1),馬(NP_001243852.1),家犬(BAB78505.1),人(NP_005336.3),煙草天蛾(AAO65964.1),埃及伊蚊(XP_021693655.1),美洲潛斑蠅(AAW32099.2),果蠅(NP_731651.1)。

2.3 池蝶蚌HSP70 B2-like組織表達(dá)

使用qRT-PCR分析池蝶蚌HSP70B2-like在不同組織中的特異性轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征,結(jié)果如圖4所示,室溫(25 ℃)條件下HSP70B2-like mRNA在被檢測(cè)的9種組織中均有表達(dá),閉殼肌中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為性腺和縮足肌,而后是肝胰腺和鰓,而在血細(xì)胞、外套膜和腎中的表達(dá)量相對(duì)較低。

取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

2.4 熱刺激對(duì)池蝶蚌HSP70 B2-like組織表達(dá)影響

經(jīng)高溫(37 ℃)脅迫刺激處理,以室溫(25 ℃)為對(duì)照(0 h),如圖5所示,熱刺激6 h,HSP70B2-like在閉殼肌、肝胰腺、腎和外套膜中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01),在血細(xì)胞和鰓中的表達(dá)呈現(xiàn)短暫下調(diào),但在12 h表現(xiàn)上調(diào)。熱刺激48 h,HSP70B2-like在血細(xì)胞、外套膜和腎中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量明顯增加,而在閉殼肌、鰓和肝胰腺中的表達(dá)量回落。

(a)閉殼肌;(b)鰓;(c)肝胰腺;(d)外套膜;(e)腎;(f)血細(xì)胞。取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

2.5 菌感染后池蝶蚌HSP70 B2-like 組織表達(dá)變化

嗜水氣單胞菌注射感染之后,6、12和24 h實(shí)驗(yàn)組的HSP70B2-like在肝胰腺[圖6(b)]、血細(xì)胞[圖6(c)]和閉殼肌[圖6(d)]中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均表現(xiàn)顯著上調(diào),6 h實(shí)驗(yàn)組的HSP70B2-like在鰓[圖6(a)]的表達(dá)呈顯著下調(diào),12 h呈現(xiàn)上調(diào),24 h下調(diào)。48 h實(shí)驗(yàn)組的HSP70B2-like在鰓、肝胰腺血細(xì)胞和閉殼肌中的表達(dá)均表現(xiàn)回落(圖6)。

(a)鰓;(b)肝胰腺;(c)血細(xì)胞;(d)閉殼肌。取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

HSP70是一種在代謝過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要蛋白,具有分子伴侶、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等重要功能[6,20]。本研究從池蝶蚌中克隆獲得序列具有其他物種HSP70家族典型特征序列,包括3個(gè)標(biāo)簽序列(IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSIL和VVLVGGSTRIPKVQK)、N端ATP酶結(jié)構(gòu)域(A131EAYLGTT138)和雙向核定位信號(hào)(K250KDPSESKRALRRL263)[7,20],與已報(bào)道的褶紋冠蚌HSP70氨基酸序列長(zhǎng)度一致[16],但比三角帆蚌HSP70序列短[5]。BLASTP和多重序列比對(duì)顯示,該序列與褶紋冠蚌HSP70同源性最高,在構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中,該序列首先與褶紋冠蚌HSP70緊密聚為一支,并與其他8種軟體動(dòng)物HSP70聚為一大簇,特別是和加州紅鮑、福壽螺、美洲簾蛤、蝦夷扇貝、美洲牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的HSP70 B2亞家族同落在一大分支上,而與三角帆蚌HSP70距離較遠(yuǎn),推測(cè)克隆序列為池蝶蚌HSP70家族的成員,且屬B2亞家族。雖然一些軟體動(dòng)物中只報(bào)道了一個(gè)HSP70[6,20],但真核生物HSP70家族存在多個(gè)成員[6,20]。Tavaria等[21]發(fā)現(xiàn)人HSP70家族至少存在11個(gè)成員。牡蠣中發(fā)現(xiàn)HSP70基因發(fā)生了明顯擴(kuò)張,數(shù)目高達(dá)88個(gè)[20,22]。櫛孔扇貝基因組中鑒定了HSP70家族65個(gè)成員[23]。在物種分類學(xué)上,池蝶蚌與三角帆蚌同屬不同種,相較于褶紋冠蚌與之親緣關(guān)系更近[19],推測(cè)本研究選用的三角帆蚌HSP70可能屬于HSP70家族中另一亞家族成員。

信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,池蝶蚌HSP70 B2-like的N端無(wú)信號(hào)肽跨膜結(jié)構(gòu)域,TMHMM預(yù)測(cè)其無(wú)跨膜區(qū),說(shuō)明其不屬于分泌性蛋白,亦非膜蛋白,可能為胞質(zhì)蛋白。HSP70家族蛋白至少包括4類蛋白質(zhì),第一類是結(jié)構(gòu)型HSP70蛋白,又稱HSP70的同源蛋白(HSC70),熱刺激后只有少量增加;第二類是誘導(dǎo)性HSP70蛋白,在正常細(xì)胞中也有少量表達(dá),細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后,表達(dá)迅速增加;第三類是GRP78(Bip),定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng);第四類是GRP75,位于線粒體[6]。軟體動(dòng)物胞質(zhì)型的HSP70其C端通常具有細(xì)胞質(zhì)特異性調(diào)控基序GP(T/K)(V/I)EE(V/M)D[20],而定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和線粒體的HSP70其C端通常分別具有特異性的KDEL、NUCDISC和MITDISC基序[20]。對(duì)池蝶蚌HSP70 B2-like序列分析發(fā)現(xiàn),其C端存在基序GPTVEEMD,說(shuō)明池蝶蚌HSP70 B2-like在細(xì)胞質(zhì)有分布,屬胞質(zhì)型HSP70。但池蝶蚌HSP70 B2-like也存在雙向核定位信號(hào)序列,推測(cè)其除胞質(zhì)發(fā)揮作用外,當(dāng)受到熱休克或細(xì)菌感染等脅迫后,胞質(zhì)內(nèi)的HSP70 B2-like可能還可以遷移到核內(nèi)發(fā)揮功能保護(hù)作用。

盡管HSP70廣泛存在于各類生物體內(nèi),但各物種的HSP70的表達(dá)具有組織特異性。三角帆蚌HSP70以肝胰腺中的表達(dá)最高,其次是性腺[5]。褶紋冠蚌HSP70在鰓中的表達(dá)較高,其次是肌肉[16]。香港牡蠣HSP70在肌肉中表達(dá)最高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)池蝶蚌HSP70B2-like在不同組織中均有表達(dá),以閉殼肌的表達(dá)量最高,其次是性腺,在血細(xì)胞、外套膜、腎、鰓、肝胰腺及斧足的表達(dá)量較低,表明其表達(dá)有組織特異性。

作為一種應(yīng)激保護(hù)蛋白,HSP70幫助生物體迅速適應(yīng)環(huán)境變化以抵御外界不良損害[1,5,20]。Nakano等[25]對(duì)潮間帶杜父魚研究表明,HSP70在體內(nèi)貯存量與機(jī)體熱耐受能力呈正相關(guān)。長(zhǎng)牡蠣37 ℃預(yù)處理2 h,轉(zhuǎn)置44 ℃致死溫度下,生存期延長(zhǎng)了2周,與鰓中大量積累的HSP70有關(guān)[26]。說(shuō)明輕度或非致死熱休克誘導(dǎo)HSP70基因表達(dá)上調(diào)有助于水生動(dòng)物抵抗不良環(huán)境因子脅迫,進(jìn)而產(chǎn)生非特異性的保護(hù)作用[27]。37 ℃刺激三角帆蚌,處理2 h鰓中的HSP70表達(dá)顯著上調(diào)[5]。熱休克和病原菌處理褶紋冠蚌,各組織中HSP70mRNA表達(dá)量有明顯提高[11]。本研究采用急性高溫(37 ℃)脅迫處理池蝶蚌后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組織中的HSP70B2-like轉(zhuǎn)錄表達(dá)均有顯著變化,其中,閉殼肌、肝胰腺、外套膜和腎在脅迫6 h其轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng),隨后逐漸下降,表現(xiàn)為明顯的時(shí)間依賴性。這可能與HSP70在轉(zhuǎn)錄水平的反饋調(diào)節(jié)方式有關(guān)[6],在無(wú)脅迫條件下,細(xì)胞質(zhì)中HSP70蛋白與熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)結(jié)合為無(wú)活性復(fù)合物;熱脅迫后,大量HSP70與變性蛋白結(jié)合,導(dǎo)致HSF從 HSP70-HSF復(fù)合物中釋放,游離的HSF在蛋白激酶或其他絲氨酸/蘇氨酸激酶的作用下磷酸化,形成活性三聚體并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與熱休克元件(HSE)序列結(jié)合,并進(jìn)一步被激酶磷酸化,然后啟動(dòng)HSP70的表達(dá),導(dǎo)致機(jī)體中HSP70表達(dá)水平上升;當(dāng)HSP70累積到一定程度時(shí)又與HSE結(jié)合,引起HSF與HSE分離,轉(zhuǎn)錄停止,從而實(shí)現(xiàn)反饋抑制HSP70的表達(dá),HSP70表達(dá)水平逐漸下降至誘導(dǎo)前水平。在鰓和血細(xì)胞先降后升,推測(cè)可能是急性高溫脅迫的初始階段(0～6 h),通過(guò)關(guān)閉或降低鰓和血細(xì)胞HSP70B2-like參與的一些快速調(diào)節(jié)途徑以應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化,但隨后(12 h)啟動(dòng)了由HSP70B2-like參與的調(diào)節(jié)以應(yīng)對(duì)應(yīng)激導(dǎo)致的不良反應(yīng)。另一種可能是池蝶蚌鰓和血細(xì)胞具有更高的熱敏感度,其HSP70B2-like可能類似三角帆蚌在熱脅迫2 h誘導(dǎo)了其顯著增強(qiáng)表達(dá),但脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)到6 h可能出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)控抑制了其表達(dá)。外套膜、血細(xì)胞和腎組織中HSP70B-like基因在37 ℃脅迫后分別在6 h(或12 h)和48 h出現(xiàn)兩次表達(dá)峰,這與其他組織不同。這可能是急性高溫脅迫誘導(dǎo)HSP70 B2-like高表達(dá)后,可以修復(fù)熱休克導(dǎo)致的部分受損蛋白,同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70 B2-like還可以作為一種“危險(xiǎn)信號(hào)”使機(jī)體提高抗氧化防御功能,刺激機(jī)體某些相關(guān)細(xì)胞因子活化正反饋誘導(dǎo)HSP70B2-like再次增強(qiáng)表達(dá)。

HSP70還是一個(gè)參與抵抗病原菌感染的免疫防御相關(guān)基因。病原菌侵染文蛤可顯著增強(qiáng)其在肝胰腺和鰓中的表達(dá)[12]。近江牡蠣在感染溶藻弧菌后,外套膜、鰓、消化腺、心臟和血細(xì)胞等5種不同組織中HSP70mRNA均出現(xiàn)了顯著性高表達(dá)[28]。本研究注射嗜水氣單胞菌脅迫處理池蝶蚌,發(fā)現(xiàn)HSP70B2-like在池蝶蚌鰓、肝胰腺、血細(xì)胞和閉殼肌中的表達(dá)也均顯著增加,但其表達(dá)變化有組織差異性,肝胰腺、血細(xì)胞和閉殼肌中HSP70B2-like mRNA表達(dá)量在6 h已被顯著增強(qiáng)表達(dá)并持續(xù)至24 h,隨后便逐漸下降。池蝶蚌鰓組織中HSP70B2-like mRNA表達(dá)則是先降后升再回落,表達(dá)量變化規(guī)律同其受到急性高溫脅迫相似。表明池蝶蚌HSP70 B2-like不僅是熱脅迫時(shí)大量表達(dá)的蛋白,也是生物脅迫如病原菌侵染時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。這可能是當(dāng)池蝶蚌被細(xì)菌感染后,其為消除病原菌,機(jī)體自身的免疫細(xì)胞會(huì)釋放一些諸如活性氧分子、陽(yáng)離子多肽、溶菌酶和細(xì)胞因子等分子,這些分子可誘導(dǎo)產(chǎn)生包括HSP70s在內(nèi)的多種熱休克蛋白。釋放的活性氧分子在殺滅外來(lái)侵染的病原菌同時(shí),也會(huì)對(duì)宿主自身正常細(xì)胞造成損傷,造成自身蛋白的變性,機(jī)體不同組織中的變性蛋白誘導(dǎo)差異水平的HSP70s產(chǎn)生,產(chǎn)生的HSP70s或者幫助變性蛋白復(fù)性,或者清除永久變性蛋白[28]。有研究表明,經(jīng)急性高溫誘導(dǎo)增加HSP70含量,增強(qiáng)了凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌感染的抗性,并發(fā)現(xiàn)敲低HSP70表達(dá)的對(duì)蝦在副溶血弧菌和白斑綜合征病毒感染時(shí)死亡率升高[27],說(shuō)明通過(guò)誘導(dǎo)水生動(dòng)物產(chǎn)生內(nèi)源 HSP70,能增強(qiáng)水生動(dòng)物的抗逆/病性。這在水生動(dòng)物抗逆和病害防控方面可能具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值[27-28]。然而,在生產(chǎn)實(shí)踐中仍需謹(jǐn)慎進(jìn)行,需進(jìn)一步探究具體的操作方案[29]。正如厚殼貽貝在一定溫度變化范圍內(nèi)可通過(guò)調(diào)節(jié)自身代謝水平應(yīng)對(duì)溫度升高帶來(lái)的脅迫,但短時(shí)間內(nèi)大幅升溫顯著影響厚殼貽貝的攝食、代謝和免疫反應(yīng)[2]。

4 結(jié)論

研究克隆鑒定了一個(gè)池蝶蚌HSP70B2-like基因,并通過(guò)急性高溫脅迫和病原菌刺激實(shí)驗(yàn)證明其是一個(gè)應(yīng)激表達(dá)蛋白基因,且屬胞質(zhì)誘導(dǎo)型HSP70,參與了機(jī)體應(yīng)對(duì)高溫脅迫和抗病原菌入侵的應(yīng)答過(guò)程,暗示其在機(jī)體的抗高溫?zé)岷兔庖叻烙邪l(fā)揮著重要作用。池蝶蚌HSP70B2-like基因的克隆為深入研究其介導(dǎo)的抗逆能力和免疫機(jī)理以及指導(dǎo)池蝶蚌抗逆育種和遺傳改良打下基礎(chǔ)。