‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種親本組織培養(yǎng)提純復(fù)壯技術(shù)

邢博聞 趙晟晨 湯桂鈞 胡海峰 姜亮 趙韻 王能 殷麗青

（1 上海市閔行區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201109；2 上海三友種苗有限公司，上海 201617；3 上海市閔行區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，上海 201199；4 上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務(wù)中心，上海 201109；5上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所，上海 201403） *為通信作者

七寶十條筋黃金瓜是上海市四大名瓜之一，距今已有100 多年的栽培歷史，深受廣大市民青睞，2019年被列為農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品?！呀鹣恪怯缮虾Ｈ逊N苗有限公司于近年通過(guò)雜交配組選育而成的七寶十條筋黃金瓜新品種（F1代組合），2017年12月注冊(cè)登記為國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非主要農(nóng)作物新品種[編號(hào)：GPD甜瓜（2017）310036][1]。2018年開(kāi)始，‘三友金香’作為可替代老七寶十條筋黃金瓜的新品種，在長(zhǎng)三角地區(qū)被廣泛推廣應(yīng)用。

甜瓜為異花授粉作物，常受昆蟲(chóng)、風(fēng)力等外界自然因素的影響而產(chǎn)生天然雜交，致使品種的優(yōu)良遺傳性狀發(fā)生退化與變異。為保證其種性長(zhǎng)期不發(fā)生混雜和退化，生產(chǎn)單位常采用人工單株（單瓜）選擇的方法進(jìn)行提純復(fù)壯，以獲得純合一致的種子。鑒于七寶十條筋黃金瓜是異花授粉作物，采用人工單株（單瓜）選擇的方法進(jìn)行提純復(fù)壯，其效果甚微，更無(wú)法脫病毒。而應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是莖尖離體培養(yǎng)方法，不僅可有效解決品種退化和自然雜交混雜的問(wèn)題，還具有工廠化快繁、脫病毒的優(yōu)勢(shì)。例如，廣泛采用莖尖脫毒方法，可在無(wú)菌條件下培養(yǎng)獲得脫毒植株[2]。在此背景下，為了使‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種優(yōu)良種性不退化及保持雜交雙親的高度純合，筆者進(jìn)行了‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種親本組織培養(yǎng)提純復(fù)壯技術(shù)研究，主要通過(guò)應(yīng)用莖尖離體培養(yǎng)方法，對(duì)其雜交雙親（編號(hào)為M2014-09 虎皮斑金黃十條筋和M2014-18 橙黃斑金黃十條筋）進(jìn)行提純復(fù)壯，最終育出了優(yōu)質(zhì)試管苗，經(jīng)鑒定純度達(dá)99%以上?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下，以期為‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 外植體發(fā)生培養(yǎng)

1.1 雜交雙親來(lái)源

在原七寶十條筋黃金瓜的原始群體中，通過(guò)多年多代自交、回交，選育獲得高純度的親本材料。其中，以M2014-09 虎皮斑金黃十條筋黃金瓜為母本，M2014-18 橙黃斑金黃十條筋黃金瓜為父本。

1.2 外植體取材

2個(gè)親本于3月上旬在上海三友種苗有限公司位于閔行區(qū)浦江鎮(zhèn)育種基地的塑料大棚內(nèi)進(jìn)行育苗；4月中旬進(jìn)行移栽；5 月上旬、主蔓4 葉1 心時(shí)進(jìn)行摘心，不久主蔓即抽生2～3根子蔓；待到5月中下旬、子蔓長(zhǎng)至5 葉以上時(shí)，剪取長(zhǎng)度約4 cm 的子蔓頂端作為外植體，存放于塑料瓶中，并擰緊瓶蓋，以防其失水萎蔫。

1.3 外植體的清洗與消毒

將剪取的子蔓頂端用洗潔精清洗3遍后，用干凈紗布包裹，然后置于水龍頭下用自來(lái)水沖洗2 h。然后，在超凈工作臺(tái)上將上述材料用3步法進(jìn)行消毒：第1 步，用75%酒精消毒1 min，無(wú)菌水沖洗1 遍；第2 步，用1∶50 的潔爾敏消毒15 min，無(wú)菌水沖洗1 遍；第3 步，用12%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3 遍，最后用無(wú)菌濾紙吸干材料備用。

1.4 莖尖的剝?nèi)∨c接種

因甜瓜屬雙子葉植物，與大部分單子葉植物相比，其莖尖不是特別明顯，故需在超凈工作臺(tái)上借助80 倍解剖鏡用解剖針、手術(shù)刀小心剝?nèi)∏o尖，長(zhǎng)度掌握在0.5～1.0 mm；切取莖尖以下0.5 cm 長(zhǎng)度的頂端，接種于發(fā)生培養(yǎng)基上，每瓶接種1 個(gè)莖尖，以誘導(dǎo)莖尖生長(zhǎng)，使其成為無(wú)菌系的“叢生芽”。

1.5 發(fā)生培養(yǎng)

發(fā)生培養(yǎng)基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，調(diào)節(jié)pH 至5.8 左右）較為適宜，培養(yǎng)室溫度為24 ℃、24 h 恒溫，光照時(shí)間為12 h/d（7:00—19:00），光照強(qiáng)度為3 000 lx 左右（采用LED 光源），光照與溫度實(shí)行自動(dòng)調(diào)節(jié)控制，最終莖尖發(fā)生成功率可達(dá)98%，且莖尖生長(zhǎng)早而快。

2 無(wú)菌系的繼代增殖培養(yǎng)

2.1 繼代增殖培養(yǎng)基配方

繼代增殖培養(yǎng)基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，調(diào)節(jié)pH 至5.8 左右）較為適宜，在25 d 增殖1 次的情況下，增殖系數(shù)可保持在1∶3.0～4.5的合理區(qū)間內(nèi)，且瓶苗生長(zhǎng)健壯，無(wú)“玻璃苗”產(chǎn)生。

2.2 培養(yǎng)周期

繼代增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)周期以25 d左右為宜，在此培養(yǎng)周期內(nèi)，瓶苗葉色正常，叢生芽生長(zhǎng)較多，枝條直立挺拔。當(dāng)培養(yǎng)周期超過(guò)25 d（尤其是超過(guò)30 d）時(shí)，瓶苗生長(zhǎng)變差，葉色褪淡甚至發(fā)黃，部分枝條細(xì)長(zhǎng)扭曲，達(dá)不到壯苗的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 培養(yǎng)室條件

繼代增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)室溫度為25 ℃、24 h 恒溫，光照時(shí)間為12 h/d（7:00—19:00），光照強(qiáng)度為3 500 lx 左右（采用LED 光源），光照與溫度實(shí)行自動(dòng)調(diào)節(jié)控制。值得注意的是，在繼代增殖培養(yǎng)中，需掌握好培養(yǎng)室的光照強(qiáng)度。當(dāng)光照強(qiáng)度在3 000 lx 以上時(shí)，瓶苗生長(zhǎng)良好；當(dāng)光照強(qiáng)度低于3 000 lx時(shí)，瓶苗表現(xiàn)不佳，甚至?xí)霈F(xiàn)較多的“玻璃苗”，這可能與七寶黃金瓜喜光、喜溫的生物學(xué)特性有關(guān)。

3 無(wú)菌系的生根培養(yǎng)

3.1 生根培養(yǎng)方法

當(dāng)繼代增殖培養(yǎng)的瓶苗長(zhǎng)至高3 cm 左右、無(wú)“玻璃苗”產(chǎn)生時(shí)，即可進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而培育成完整的“試管苗”。具體方法為：將瓶苗中的“叢生芽”切成單株（因節(jié)間處富含生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)，容易生根，故切割時(shí)要切在節(jié)間處），接種至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。當(dāng)生根苗根系長(zhǎng)度達(dá)1 cm左右時(shí)，即可將瓶苗移出培養(yǎng)室，置于常規(guī)室溫、自然光照條件下培養(yǎng)24 h，使其適應(yīng)外界氣候環(huán)境。

3.2 生根培養(yǎng)基配方

生根培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 0.2 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖20 g/L、鐵鈉鹽38.23 mg/L，調(diào)節(jié)pH 至5.8 左右）較為適宜，培養(yǎng)3 周后，其生根率可達(dá)99%以上，有時(shí)可達(dá)100%，且根系為白色、較發(fā)達(dá)，每株有5～6條根（多的可達(dá)10余條根）。值得注意的是，為利于試管苗煉苗馴化及提高成活率，不宜采用NAA 作為生根誘導(dǎo)劑，這是因?yàn)椴捎肗AA 作生根誘導(dǎo)劑的瓶苗生根狀況不如采用IBA作生根誘導(dǎo)劑，表現(xiàn)為瓶苗根少、粗短，且會(huì)在根基部著生愈傷組織，而當(dāng)生根培養(yǎng)苗基部產(chǎn)生愈傷組織后，會(huì)導(dǎo)致其生根數(shù)減少甚至不生根[3]。

3.3 生根培養(yǎng)室管理

生根培養(yǎng)的培養(yǎng)室溫度為24～25 ℃、24 h 恒溫，當(dāng)90%以上幼苗開(kāi)始生根、根系長(zhǎng)度為0.3 mm時(shí)，將培養(yǎng)室溫度調(diào)至22～23 ℃，以使根系粗壯飽滿(mǎn)，同時(shí)可防止因溫度過(guò)高而使葉片蒸騰黃化；光照時(shí)間為12 h/d（7:00—19:00），光照強(qiáng)度為3 000～3 500 lx。

4 試管苗的煉苗馴化

4.1 試管苗清洗

用鑷子將生根并適應(yīng)24 h的試管苗輕輕取出培養(yǎng)瓶，于清水中漂盡根部瓊脂。此階段葉片較脆嫩，操作時(shí)需注意不要傷及葉片。

4.2 煉苗基質(zhì)

煉苗基質(zhì)以泥炭∶椰糠∶珍珠巖=2∶1∶1（質(zhì)量比）為好，基質(zhì)在充分拌和后噴一些清水，以使基質(zhì)保持濕潤(rùn)。

4.3 試管苗移栽

穴盤(pán)育苗法是目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的育苗技術(shù)，尤其在組培育苗中應(yīng)用較多[4]，故試管苗同樣采用穴盤(pán)育苗法進(jìn)行煉苗馴化。試管苗的移栽時(shí)間以2 月下旬—4月下旬為宜，具體操作為：先將充分拌和的基質(zhì)裝入72孔的硬質(zhì)塑料穴盤(pán)，然后將穴盤(pán)置于苗床上；用鑷子或竹片將試管苗筆直淺栽入穴盤(pán)基質(zhì)，栽后立即澆足活棵水；移栽后在苗床上方搭好塑料小環(huán)棚，如遇晴熱天氣，需用75%遮光率的黑色遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，以防幼苗失水萎蔫。

4.4 煉苗期管理

4.4.1 葉面噴霧補(bǔ)水

鑒于2個(gè)親本的試管苗葉片相對(duì)較大，但葉片較薄，極易失水萎蔫，故需在移栽后第2天進(jìn)行葉面噴霧補(bǔ)水。若苗床上方有噴淋裝置，則每天葉面噴霧3～5次，每次噴霧20 s（視天氣情況靈活掌握噴霧次數(shù)，陰天噴霧補(bǔ)水1～2次，晴天則相應(yīng)增加噴霧補(bǔ)水次數(shù)）；若無(wú)噴淋裝置，可用噴霧器進(jìn)行葉面噴霧補(bǔ)水。

4.4.2 掌握好適宜的棚內(nèi)溫度

上海地區(qū)春季天氣多變，棚內(nèi)溫度忽高忽低，對(duì)幼苗生長(zhǎng)十分不利，因此應(yīng)根據(jù)天氣變化情況，因地制宜地采取應(yīng)對(duì)措施，保障棚內(nèi)溫度適宜（棚內(nèi)溫度以24～28 ℃為好，最高不超過(guò)30 ℃），以確保幼苗正常生長(zhǎng)。

4.4.3 適時(shí)追肥

待幼苗長(zhǎng)出新根和新葉后，應(yīng)適時(shí)追施速效化肥，以0.5%尿素或三元復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）兌水澆灌為好，每月追肥2次，以促進(jìn)幼苗正常生長(zhǎng)。

4.5 穴盤(pán)苗適時(shí)移栽

當(dāng)穴盤(pán)苗長(zhǎng)至高度8 cm以上并具5張以上葉片時(shí)，即可將穴盤(pán)苗拔出，連帶基質(zhì)一起移栽至育苗大棚內(nèi)。