白藜蘆醇對小鼠甲狀腺乳頭癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用及機(jī)制研究

毛姍，李揚(yáng)，丁韓夢，趙永麗

（1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，河南 南陽 473000；2. 南陽張仲景醫(yī)院 藥劑科，河南 南陽 473000）

方法：將40 只裸鼠背部皮下接種甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞（TPC-1）懸液建立移植瘤模型后，隨機(jī)分為模型對照組和3 個不同劑量白藜蘆醇（2.5、5、10 mg/kg）治療組，每組10 只。白藜蘆醇各劑量組裸鼠分別腹腔注射相應(yīng)劑量的白藜蘆醇，模型對照組裸鼠腹腔注射等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)21 d。記錄移植瘤的生長情況，繪制生長曲線。21 d 后處死各組小鼠，稱量腫瘤質(zhì)量，計算抑瘤率；行腫瘤組織HE 染色和TUNEL 染色檢測腫瘤細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況；用qRT-PCR 法與Western blot 法分別檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax、Bcl-2）與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子（E-cadherin、N-cadherin、vimentin）的mRNA 與蛋白表達(dá)。

結(jié)果：與模型對照組比較，3 個劑量白藜蘆醇治療組的移植瘤生長速度均被抑制，21 d 后的移植瘤質(zhì)量均明顯減小，且抑瘤率隨白藜蘆醇劑量的增加而加大（均P＜0.05）。HE 染色結(jié)果顯示，模型對照組腫瘤組織中癌細(xì)胞呈片狀，形態(tài)大小不一，胞漿豐富，核大，可見核分裂象，極性紊亂；3 個劑量白藜蘆醇治療組細(xì)胞數(shù)量均不同程度減少、細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞核固縮、核分裂較少、不同程度片狀壞死。與模型對照組比較，3 個劑量白藜蘆醇治療組的腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡增加；E-cadherin 和Bax mRNA 和蛋白表達(dá)量升高，N-cadherin、vimentin 和Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)量降低；caspase-3 mRNA水平降低，切割型caspase-3 蛋白表達(dá)量升高，且以上變化在3 個劑量白藜蘆醇治療組均呈劑量依賴性（均P＜0.05）。

結(jié)論：白藜蘆醇可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡從而抑制其在小鼠體內(nèi)的生長，其作用機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)EMT過程有關(guān)。

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病具有隱匿性，多數(shù)患者因無痛性頸部腫塊就診，部分患者伴有呼吸困難、聲音嘶啞等，且極易侵襲頸部淋巴結(jié)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。目前全球范圍內(nèi)甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但是對其發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚，臨床上根據(jù)其病理類型主要分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，其中以乳頭狀癌最為常見[3-5]。因此，尋找有效治療甲狀腺癌的藥物具有重大意義。

上皮- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮表型細(xì)胞在一定刺激因素下喪失上皮特性，逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的現(xiàn)象，間質(zhì)細(xì)胞處于運(yùn)動狀態(tài)，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，該過程具有一定可逆性，可能成為治療癌癥的重要機(jī)制[6-7]。研究[8]已證實，在甲狀腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，EMT 起到了十分重要的作用。

白藜蘆醇是一種廣泛存在于植物中的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多種藥理學(xué)作用[9-11]。研究[12-15]表明，白藜蘆醇在卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞、宮頸癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中均發(fā)揮抗癌作用。此外，白藜蘆醇在抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用在近幾年偶有報道[16]。

基于以上背景，本研究探討白藜蘆醇對甲狀腺癌移植瘤的抑制作用以及與EMT 過程的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1 購自美國ATCC公司；SPF 級雌性BALB/c 裸鼠40 只，6～7 周齡，體質(zhì)量15～20 g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司（許可證號：SCXK（京）2021-0006）；白藜蘆醇（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；蘇木素-伊紅染色（HE）染色和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 原位切口末端標(biāo)記（TUNEL）染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒以及TRIzol 試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技；Z136115 型游標(biāo)卡尺購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；QuantStudioTM 5 型熒光定量PCR 儀購自賽默飛世爾科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 移植瘤裸鼠模型構(gòu)建 TPC-1 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每天更換1 次新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時進(jìn)行傳代。取對數(shù)期細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL。取0.2 mL 細(xì)胞懸液注射于小鼠背部皮下，注射5 d 后可見明顯腫塊視為模型制備成功。

1.2.2 實驗分組與給藥 將模型制備成功裸鼠隨機(jī)分為模型對照組和低、中、高3 個不同劑量白藜蘆醇（2.5、5、10 mg/kg）治療組，每組10 只。3 個白藜蘆醇治療組分別腹腔注射1 mL 濃度為2.5、5、10 mg/kg 的白藜蘆醇，模型對照組給予等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)21 d。

1.2.3 腫瘤生長情況檢測 自接種后5 d 起，每隔3 d 使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2，并繪制腫瘤生長曲線。給藥結(jié)束后，頸椎脫臼法處死，切開背部皮膚，將腫瘤組織快速完整剝離下來，稱取腫瘤質(zhì)量，計算抑瘤率（%）=（模型對照組腫瘤質(zhì)量-各藥物組腫瘤質(zhì)量）/模型對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.2.4 腫瘤組織HE 染色 取一半腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 腫瘤組織TUNEL 染色 取石蠟切片，組織上滴加蛋白酶K 工作液，孵育30 min，洗滌，滴加3%過氧化氫封閉液封閉，滴加TdT 酶反應(yīng)物置于濕盒中避光孵育1 h，HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素50 μL 避光孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞呈棕黃色，計算凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 RT-PCR 法檢測腫瘤組織中EMT 和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)水平 取100 mg 腫瘤組織置于EP 管中，剪碎，勻漿，TRIzol 試劑提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，構(gòu)建熒光定量PCR 反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，進(jìn)行35 個循環(huán)，2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 檢測腫瘤組織中EMT 和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取100 mg 腫瘤組織剪碎，勻漿，裂解液裂解。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液提取蛋白，加入5×上樣緩沖液，裂解液調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性。取50 μg 蛋白樣品用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，封閉，抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加發(fā)光液，凝膠成像分析儀顯影，Image J 分析條帶灰度值，計算蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS27.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇對腫瘤生長的影響

由移植瘤生長曲線可見，從接種腫瘤細(xì)胞的第10 天開始，4 組小鼠體內(nèi)的移植瘤生長速度有明顯差異。與模型對照組比較，3 個劑量白藜蘆醇治療組的移植瘤生長速度均被抑制，且呈劑量依賴趨勢（圖1）。在接種21 d 后，模型對照組與低、中、高劑量白藜蘆醇治療組的移植瘤質(zhì)量分別為（2.52±0.36） g、（2.03±0.21） g、（1.36±0.23） g、（1.01±0.20） g，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；3 個劑量白藜蘆醇治療組的抑瘤率隨著白藜蘆醇劑量的增加而升高（均P＜0.05）（圖2）（表2）。

圖1 各組小鼠移植瘤生長曲線Figure1 The growth curves of transplanted tumors in each group of mice

圖2 各組移植瘤大體標(biāo)本Figure 2 Gross specimens of transplanted tumors in each group

表2 各組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（n=10，±s）Table 2 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rates among groups (n=10, ±s)

表2 各組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（n=10，±s）Table 2 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rates among groups (n=10, ±s)

注：1）與模型對照組比較，P＜0.05；2）與低劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05；3）與中劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

抑瘤率（%）—31±3.22 41±3.192）55±4.442），3）組別模型對照組低劑量白藜蘆醇治療組中劑量白藜蘆醇治療組高劑量白藜蘆醇治療組腫瘤質(zhì)量（g）2.52±0.36 2.03±0.211）1.36±0.231），2）1.01±0.201），2），3）

2.2 腫瘤組織病理染色結(jié)果

模型對照組腫瘤組織中癌細(xì)胞呈片狀，形態(tài)大小不一，胞漿豐富，核大，可見核分裂象，極性紊亂；白藜蘆醇低、中和高劑量組細(xì)胞數(shù)量不同程度減少，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核固縮，核分裂較少，不同程度片狀壞死（圖3）。

2.3 腫瘤細(xì)胞AI檢測結(jié)果

與模型對照組比較，3 個劑量的白藜蘆醇治療組的AI 均明顯升高，且在3 組間呈明顯的劑量依賴性（均P＜0.05）（圖4）（表3）。

圖4 腫瘤組織TUNEL染色（×200）Figure 4 TUNEL staining of tumor tissues (×200)

表3 各組腫瘤組織中AI比較（%，n=10，±s）Table 3 Comparison of AI in tumor tissues among groups(%, n=10, ±s)

表3 各組腫瘤組織中AI比較（%，n=10，±s）Table 3 Comparison of AI in tumor tissues among groups(%, n=10, ±s)

注：1）與模型對照組比較，P＜0.05；2）與低劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05；3）與中劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

AI 9.20±0.75 18.37±2.331）29.66±6.081），2）41.73±9.951），2），3）組別模型對照組低劑量白藜蘆醇治療組中劑量白藜蘆醇治療組高劑量白藜蘆醇治療組

2.4 qRT-PCR檢測結(jié)果

與模型對照組比較，3 個劑量白藜蘆醇治療組的E-cadherin 和Bax mRNA 表達(dá)水平均明顯升高，而N-cadherin、vimentin、caspase-3 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平均明顯降低，且呈明顯的劑量依賴性（均P＜0.05）（表4）。

表4 各組腫瘤組織中EMT和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平比較（n=10，±s）Table4 Comparison of mRNA expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups (n=10, ±s)

表4 各組腫瘤組織中EMT和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平比較（n=10，±s）Table4 Comparison of mRNA expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups (n=10, ±s)

注：1）與模型對照組比較，P＜0.05；2）與低劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05；3）與中劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

組別模型對照組低劑量白藜蘆醇治療組中劑量白藜蘆醇治療組高劑量白藜蘆醇治療組Bcl-2 1.03±0.15 0.82±0.061）0.70±0.041），2）0.57±0.051），2），3）E-cadherin 1.03±0.45 3.71±0.441）5.06±0.621），2）6.78±0.691），2），3）Bax 1.07±0.56 3.95±0.721）5.38±0.691），2）7.20±0.651），2），3）caspase-3 1.05±0.14 0.77±0.051）0.60±0.041），2）0.47±0.061），2），3）N-cadherin 1.08±0.27 0.78±0.031）0.62±0.041），2）0.51±0.061），2），3）vimentin 1.12±0.56 0.82±0.051）0.67±0.061），2）0.52±0.071），2），3）

2.5 Western blot檢測結(jié)果

與模型對照組比較，3 個劑量的白藜蘆醇治療組的E-cadherin、Bax 和切割型（cleaved） caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯升高，而N-cadherin、vimentin和Bcl-2 蛋白表達(dá)量均明顯降低，且呈明顯的劑量依賴性（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組腫瘤組織中EMT和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 1）與模型對照組比較，P＜0.05；2）與低劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05；3）與中劑量白藜蘆醇治療組比較，P＜0.05Figure 5 Comparison of protein expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. mediumdose resveratrol treatment group

3 討 論

女性甲狀腺癌發(fā)病率高于男性，其發(fā)病受輻射、空氣質(zhì)量、碘攝取異常、情緒、遺傳等多種因素的影響，而且年齡、腫瘤直徑、多發(fā)癌灶、腺外侵犯等多種因素可導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17-18]。臨床上主要采用以手術(shù)切除為主的綜合治療手段，預(yù)后良好，但部分患者因身體條件、耐藥性等因素而未能達(dá)到令人滿意的預(yù)后效果[19-20]。近些年，中草藥因其來源廣、成本低、毒副作用小以及多靶點(diǎn)等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域的研究。于彬等[21]報道扁蒴藤素可抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移，降低吉西他濱化療耐藥性。青藤堿可抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，發(fā)揮抗胰腺癌作用[22]。白藜蘆醇抗腫瘤特性被廣泛研究。本研究以甲狀腺最常見的病理類型乳頭狀甲狀腺癌移植瘤裸鼠為研究對象，探討白藜蘆醇對腫瘤生長的抑制作用及其具體機(jī)制。

移植瘤裸鼠腹腔注射藥物21 d 后，3 個劑量白藜蘆醇治療組腫瘤體積均減小，具有顯著抑瘤率。模型對照組腫瘤組織中癌細(xì)胞呈片狀，形態(tài)大小不一，胞漿豐富，核大，可見核分裂象，極性紊亂；3 個劑量白藜蘆醇治療組細(xì)胞數(shù)量不同程度減少，排列疏松，細(xì)胞核固縮，核分裂較少，不同程度片狀壞死。此外，通過染色發(fā)現(xiàn)3 個劑量白藜蘆醇治療組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞增多，AI 升高。以上結(jié)果提示，白藜蘆醇可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與Li 等[23]報道的白藜蘆醇可抑制前列腺癌移植瘤生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡具有一致性。惡性腫瘤的進(jìn)展與細(xì)胞凋亡異常失控具有必然聯(lián)系，細(xì)胞凋亡是多基因共同作用的結(jié)果，Bcl-2 家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。Bcl-2 可調(diào)節(jié)線粒體通透性保護(hù)細(xì)胞免受程序性細(xì)胞死亡，而該家族中的另一成員Bax 則發(fā)揮與Bcl-2 相反的作用，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24-25]。caspase-3 家族是細(xì)胞凋亡信號網(wǎng)的重要節(jié)點(diǎn)，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的多途徑中扮演凋亡執(zhí)行者的角色，通過選擇性切割某些蛋白質(zhì)造成細(xì)胞凋亡[26]。在本研究中白藜蘆醇低、中和高劑量治療組裸鼠甲狀腺乳頭狀癌移植瘤組織中Bax 和caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平高于模型對照組，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于模型對照組，該結(jié)果提示白藜蘆醇在甲狀腺乳頭狀癌移植瘤中發(fā)揮促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)的作用。

EMT 獲得的間質(zhì)細(xì)胞是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的重要原因，逆轉(zhuǎn)EMT 過程或是降低惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要機(jī)制之一[27-28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 過程發(fā)揮抗胃癌作用。Yuan 等[30]報道稱白藜蘆醇可逆轉(zhuǎn)EMT過程抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。EMT 過程的明顯特征是E-cadherin 丟失， N-cadherin 和vimentin 的增加。因此在本研究中白藜蘆醇低、中和高劑量治療組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)較模型對照組升高，N-cadherin 和vimentin mRNA 和蛋白表達(dá)水平較模型對照組降低。此結(jié)果提示白藜蘆醇可逆轉(zhuǎn)EMT 過程。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其可能是通過逆轉(zhuǎn)EMT 過程、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。以上結(jié)果為臨床治療甲狀腺癌提供理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：毛姍負(fù)責(zé)課題設(shè)計，李揚(yáng)負(fù)責(zé)實驗操作，丁韓夢負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，趙永麗負(fù)責(zé)撰寫文稿。