李瑜祥 , 魏唐婷 , 胡秀花 , 蘇瑞景 , 王少林 , 許建海 , 孟 迪 , 胡艷欣

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193 ; 2.福清市畜牧獸醫(yī)中心 , 福建 福清 350300)

2020年12月,某豬場個(gè)別育肥豬突然出現(xiàn)了體溫升高、呼吸窘迫等癥狀,用抗生素鹽酸林可霉素、復(fù)方新諾明和鏈霉素等治療后沒有好轉(zhuǎn)并且癥狀持續(xù)惡化,幾天后病豬死亡,對其進(jìn)行了大體剖檢和病料采集。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和大體病變,疑似該豬患有豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae,PCP)。為了進(jìn)一步確診是否為PCP,并深入探討該病的病理變化特點(diǎn),進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室檢測和組織病理學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病豬死亡后立即進(jìn)行大體剖檢和取材。無菌采集病死豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、血液和胸腔積液。將收集的病料分為兩部分,一部分先用液氮保存,后移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中冷凍保存,待進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定,另一部分固定在4%甲醛溶液中待制作石蠟切片。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptone soybean agar,TSA)培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptone soybean broth,TSB)培養(yǎng)基,均購自紹興天恒生物科技有限公司;輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),購自生工生物工程(上海)股份有限公司;胎牛血清和PCR試劑盒,均購自北京索萊寶科技有限公司;革蘭染色試劑盒,購自北京中杉金橋生物公司;4%甲醛固定液,由實(shí)驗(yàn)室自行配置。

1.3 主要儀器 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;PCR儀,Applied Biosystems產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡,Olympus corporation產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 利用消毒后的接種環(huán)無菌采集病料,將每份病料分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和0.01% NAD),在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,之后挑取TSA培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng),純化2次后觀察平皿上的菌落形態(tài),根據(jù)說明書操作對純化后的菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢。將劃線培養(yǎng)的單菌落接種于TSB培養(yǎng)基(含5%胎中血清和0.01%NAD),振蕩培養(yǎng)12 h,留樣備用。

1.4.2 細(xì)菌分子生物學(xué)和血清型鑒定 利用質(zhì)譜分析和PCR進(jìn)行細(xì)菌鑒定。按照基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀手冊說明進(jìn)行操作,將每份病料純化后的單個(gè)菌落加入樣品孔中進(jìn)行檢測。該系統(tǒng)首先識別分子量為2～20 kDa的圖譜,之后采集圖譜進(jìn)行分析。根據(jù)結(jié)果與儀器數(shù)據(jù)庫內(nèi)的參考圖譜進(jìn)行比對,依據(jù)匹配程度來判斷菌株種類。

利用水煮模板法提取細(xì)菌DNA,設(shè)計(jì)并合成用于鑒定胸膜肺炎放線桿菌(Actinobczcilluspleuropeu-monicze,APP)16S rDNA的引物,上游引物:5′-GTG-GCACTGACGGTGATGAT-3′,下游引物:5′-GGCCA-TCGACTCAACCAT-3′,目標(biāo)片段大小377 bp。鑒定APP血清型分型所要使用的引物序列見表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL。16S rDNA PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸 30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。1、2、3、5和7型APP反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 50 s,62 ℃ 退火50 s,72 ℃延伸1 min 30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。8型APP反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 50 s,60 ℃ 退火50 s,72 ℃延伸1 min 30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。15型APP反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 30 s,61 ℃ 退火1 min 30 s,72 ℃延伸2 min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán);68 ℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,將擴(kuò)增出陽性條帶的PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序并比對。

表1 豬胸膜肺炎放線桿菌血清型鑒定引物Table 1 Primer of serotype identification of Actinobacillus pleuropneumoniae

1.4.3 組織病理學(xué)分析 將所采集的組織樣品在4%甲醛溶液中固定48 h,對樣品進(jìn)行修塊、脫水,常規(guī)石蠟包埋,制備的石蠟切片厚度為3～4 μm,利用自動(dòng)染色機(jī)完成蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集病變典型的圖片。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和剖檢病理變化 病豬表現(xiàn)精神沉郁、體溫升高(41～42 ℃)、咳嗽和呼吸困難,鼻內(nèi)流出血色樣泡沫分泌物等癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)胸腔有大量積液(圖1A),肺臟腫大并可見彌散性大面積的出血灶(圖1B)。

圖1 大體剖檢觀察Fig.1 Gross necropsy observationA:胸腔; B:肺臟A:Pleural cavity; B:Lung

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 從病豬的胸腔積液、肺臟和心臟中都分離出了菌株,純化2次后在TSA培養(yǎng)基上主要可見數(shù)個(gè)針尖大小、隆起、表面光滑、邊緣整齊的半透明呈露珠狀的白色菌落(圖2A),革蘭染色后,單個(gè)、成雙或鏈狀的革蘭陰性球桿菌在光鏡視野下清晰可見,符合APP的形態(tài)特征(圖2B)。

圖2 細(xì)菌分離培養(yǎng)Fig.2 Bacteria isolation and cultureA:菌落形態(tài); B:革蘭染色(100×)A:Colony morphology; B:Gram staining(100×)

2.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示,病死豬胸腔積液、血液、心臟、肺臟和腎臟中均含有APP(表2)。16S rDNA PCR鑒定結(jié)果顯示,上述病料均可擴(kuò)增出APP陽性條帶(圖3),初步判定病豬體內(nèi)的主要菌株為APP。

圖3 不同病料分離菌株16S rDNA的PCR鑒定Fig.3 16S rDNA PCR identification of isolates from different specimensM:DL2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:血液1; 2:血液2; 3:血液3; 4:淋巴結(jié); 5:脾臟; 6:心臟; 7:肝臟; 8:肺臟; 9:胸腔積液1; 10:胸腔積液2; 11:胸腔積液3; 12:腎臟; 13:陽性對照; 14:陰性對照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Blood 1; 2:Blood 2; 3:Blood 3; 4:Lymph node; 5:Spleen; 6:Heart; 7:Liver; 8:Lung; 9:Pleural effusion 1; 10:Pleural effusion 2; 11:Pleural effusion 3; 12:Kidney; 13:Positive control; 14:Negative control

表2 不同病料分離菌株的質(zhì)譜鑒定Table 2 Mass spectrometry identification of isolates from different specimens

2.4 細(xì)菌血清型鑒定 細(xì)菌血清型PCR鑒定結(jié)果顯示,各樣本中含有符合血清型7型條帶的目標(biāo)片段,大小為396 bp(圖4)。其測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對為APP血清型7型,表明該豬所感染的APP為血清型7型。

圖4 胸膜肺炎放線桿菌血清型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypeM:DL2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:胸腔積液1; 2:胸腔積液2; 3:心臟; 4:血液1;5:陽性對照a; 6:陽性對照b; 7:胸腔積液3; 8:血液2; 9:血液3; 10:肺臟; 11:腎臟;12:陰性對照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Pleural effusion 1; 2:Pleural effusion 2; 3:Heart; 4:Blood 1; 5:Positive control a; 6:Positive control b; 7:Pleural effusion 3; 8:Blood 2; 9:Blood 3; 10:Lung; 11:Kidney; 12:Negative control

2.5 組織病理學(xué)分析

2.5.1 肺臟 顯微鏡下可見,肺小葉間質(zhì)疏松水腫,淋巴管擴(kuò)張形成淋巴栓(圖5A),有大量炎性細(xì)胞浸潤,主要為中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(圖5B);有的肺小葉局部呈現(xiàn)嚴(yán)重出血性肺炎(圖5C),肺臟正常組織結(jié)構(gòu)消失,肺泡和支氣管管腔中可見大量的炎性滲出液和紅細(xì)胞聚集,殘存的肺泡代償性擴(kuò)張(圖5D);有的肺小葉呈現(xiàn)纖維素性肺炎,肺泡上皮細(xì)胞大量增生,呈島嶼狀排列(圖5E);肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)可見藍(lán)染的菌團(tuán)(圖5F)。

圖5 肺臟組織病理學(xué)檢測(H.E.染色)Fig.5 Histopathological examination of the lung(H.E. staining)A、C、E:20×; B、D、F:40×黑色箭頭:肺小葉間質(zhì)疏松水腫、淋巴管擴(kuò)張形成淋巴栓; 藍(lán)色箭頭:炎性細(xì)胞浸潤; 綠色箭頭:殘存的肺泡代償性擴(kuò)張; 黃色箭頭:肺泡上皮細(xì)胞大量增生; 白色箭頭:藍(lán)染菌團(tuán)Black arrow:Pulmonary lobular interstitial looseness and edema,lymphatic vessel dilatation forming lymphatic embolus; Blue arrow:Inflammatory cell infiltration; Green arrow:Compensatory expansion of the remaining alveoli; Yellow arrow:Abundant proliferation of alveolar epithelial cells; White arrow:Blue-stained clumps

2.5.2 其他臟器 肝臟、淋巴結(jié)、腎臟和心肌組織均可見明顯的組織病理學(xué)變化。肝小葉中央靜脈和肝竇淤血、有散在壞死灶,中央靜脈管壁下組織疏松水腫(圖6A);淋巴結(jié)可見淋巴濾泡中淋巴細(xì)胞壞死排空,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血(圖6B);脾臟表現(xiàn)出急性脾炎的病理學(xué)變化,大面積出血,白髓與紅髓之間的界限不清晰,白髓面積縮小,動(dòng)脈周圍淋巴鞘萎縮,大量淋巴細(xì)胞壞死排空(圖6C);腎臟可見嚴(yán)重水腫、腎小管脫離基底膜,腎小管上皮細(xì)胞廣泛變性壞死,腎間質(zhì)有明顯的結(jié)締組織增生(圖6D)和炎性細(xì)胞浸潤(圖6E);心臟的心肌纖維間大量紅細(xì)胞聚集,呈現(xiàn)局灶性出血灶(圖6F)。

圖6 其他臟器組織病理學(xué)檢測(H.E.染色,40×)Fig.6 Histopathological examination of other organs tissues (H.E. staining,40×)A:肝臟; B:淋巴結(jié); C:脾臟; D:腎臟; E:腎臟; F:心臟黑色箭頭:中央靜脈管壁下組織疏松水腫; 藍(lán)色箭頭:淋巴濾泡中淋巴細(xì)胞壞死排空; 綠色箭頭:腎小管脫離基底膜; 黃色箭頭:炎性細(xì)胞浸潤; 白色箭頭:心肌纖維間大量紅細(xì)胞聚集A:Liver; B:Lymph node; C:Spleen; D:Kidney; E:Kidney; F:HeartBlack arrow:The tissue under the central vein wall was loose and edema; Blue arrow:Necrotic emptying of lymphocytes in lymphoid follicles; Green arrow:Renal tubules detached from the basement membrane; Yellow arrow:Inflammatory cell infiltration; White arrow:Massive aggregation of red blood cells between myocardial fibers

3 討論

PCP是由APP感染導(dǎo)致的一種高傳染性、致死性的豬呼吸道傳染病,由于環(huán)境、品系、機(jī)體免疫狀態(tài)和APP血清型等因素不同而對豬的致病性有所差異。該病原自1957年在英國被首次分離以來,已分離鑒定出18個(gè)血清型(1～18型)[1]。有研究表明,胸腔和肺臟是該病的主要病理損傷部位[2],臨床表現(xiàn)為急性或慢性纖維素性胸膜肺炎[3]。

本試驗(yàn)在剖檢病死豬時(shí)發(fā)現(xiàn)胸腔積液和肺臟腫大出血等癥狀。組織病理學(xué)觀察結(jié)果亦顯示病死豬多臟器發(fā)生病變,尤其以肺臟病變最為明顯,呈現(xiàn)出血性肺炎和纖維性肺炎的病理學(xué)變化,同時(shí)可觀察到藍(lán)染菌團(tuán)。結(jié)合細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果,推測該病豬可能感染了血清型7型APP菌,細(xì)菌在肺內(nèi)繁殖,引發(fā)嚴(yán)重的肺炎,最終導(dǎo)致呼吸困難等急性豬胸膜肺炎的癥狀。在急性感染期間,該菌主要通過淋巴管和血管在病豬體內(nèi)傳播和釋放毒素,引起感染豬發(fā)生菌血癥和毒血癥[4],最終導(dǎo)致感染豬的死亡。

研究表明,肺臟呈現(xiàn)纖維素性肺炎的病理損傷是急性豬傳染性胸膜肺炎的特征表現(xiàn)[5,6]。在本試驗(yàn)中,病死豬的肺臟組織也有明顯的出血性纖維素性滲出,同時(shí)可見大量肺泡上皮細(xì)胞呈島嶼狀聚集,可能是疾病正在由急性向亞急性轉(zhuǎn)變,繼續(xù)發(fā)展有可能成為亞急性型特征性病變“肉芽腫”。病死豬的心臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)和脾臟等也表現(xiàn)出不同程度的病理損傷。質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示,大部分病變組織中都有APP存在,提示這些部位的病理組織學(xué)變化與APP感染有關(guān)。因此,心肌纖維間的散在出血灶,腎小管上皮細(xì)胞的變性壞死可能是APP感染引起的病理學(xué)變化。

PCP作為一種細(xì)菌感染性疾病,感染初期出現(xiàn)的急性肺損傷的程度決定了病情是否進(jìn)一步惡化,所以盡早確診才能快速防控[7]。因此,在面對豬場豬群突發(fā)PCP時(shí),靈敏高效的檢測方法是極其重要的。目前,酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbnent Assay,ELISA)是在豬群中監(jiān)測豬APP最為常用的方法,該方法經(jīng)濟(jì)且方便。但在某些亞臨床感染中,感染豬的血清學(xué)檢查結(jié)果可能為陰性,僅靠ELISA方法檢測將會影響后續(xù)的診斷和治療[8]。本試驗(yàn)利用PCR和質(zhì)譜分析結(jié)合來鑒定APP,檢測結(jié)果準(zhǔn)確,但在實(shí)際操作中存在難度大、耗時(shí)長等問題,無法應(yīng)對豬場的需求。因此,研發(fā)針對PCP的成本低、準(zhǔn)確性高、操作簡單的診斷方法依舊是熱點(diǎn)問題。

對于PCP的防控,首先需要加強(qiáng)豬場的飼養(yǎng)管理,其次應(yīng)采取相關(guān)措施保障生物安全,定期進(jìn)行血清學(xué)檢查,并根據(jù)血清學(xué)檢查結(jié)果制定相應(yīng)的免疫程序進(jìn)行免疫接種。近年來,我國不同地區(qū)的規(guī)?；i場常有APP感染的報(bào)道出現(xiàn),目前 APP 血清型 1～5、7～10 和 15 型的相關(guān)抗體已經(jīng)在我國許多豬場成功分離或者檢測得到,且不同地域的優(yōu)勢血清型存在差異[9],例如:APP血清型1型主要在福建和海南存在,血清型2、3和7型主要分布于甘肅、青海和寧夏等,血清型3、7和9型是湖南和湖北的優(yōu)勢血清型[10]。本試驗(yàn)中所測得的血清型7型APP在我國最為普遍[11]。宋志強(qiáng)等統(tǒng)計(jì)2017—2019年關(guān)于PCP的屠宰檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),3年來我國豬群感染PCP的平均概率為12%[12],相較于以前感染率有所升高。因此,建立PCP分離菌株血清型分布的流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫,依據(jù)大數(shù)據(jù)來篩選預(yù)測優(yōu)勢血清型,對于APP疫苗的研發(fā)和PCP的防治具有重要意義[13]。當(dāng)養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)有豬群疑似感染PCP時(shí),應(yīng)及時(shí)隔離患病豬,由于不同區(qū)域豬場長期使用的抗生素不同,治療時(shí)需要有針對地篩選出敏感藥物并及時(shí)進(jìn)行治療,才能有效阻止APP的進(jìn)一步傳播。在耐藥性方面,APP對諸如四環(huán)素、青霉素和甲氧芐啶磺酰胺等抗生素的耐藥性增加,但廣譜抗生素頭孢曲松、頭孢哌酮和哌拉西林等對該菌依然有效[14,15],使得該病在確診后能得到有效的控制。有研究表明,豬的上皮細(xì)胞分泌的一種抗菌肽防御素β2能夠增強(qiáng)豬對APP的抵抗力,為在治療PCP上減少抗生素的使用提供了新思路[16]。防控該病最重要的還是養(yǎng)豬場內(nèi)避免引入攜帶新血清型菌株的豬,從源頭上阻斷感染源[13]。

4 小結(jié)

本病例診斷結(jié)果可見,死亡豬的肺臟等臟器中分離出的細(xì)菌鑒定為APP,血清型為7型;大體剖檢可見胸腔積液和肺臟出血,組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示出血性纖維素性肺炎,均符合PCP的大體病變和組織病理學(xué)特征。因此,此病例確診為PCP。