齊 盟 , 辛雅明 , 白綏明 , 胡 亮 , 楊銀鳳

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ; 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ; 3. 內(nèi)蒙古鄂爾多斯市動物疫病預(yù)防和控制中心 , 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000 ;4. 巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究所 , 內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號公告,規(guī)定自2020年1月1日起,飼料中禁止添加抗生素[1]。抗生素添加在飼料中雖然可以發(fā)揮預(yù)防腸道疾病、降低患病率、增加飼料利用率和促進(jìn)生長等作用,但同時導(dǎo)致了畜體抗生素殘留、耐藥菌產(chǎn)生等問題[2]。解決上述問題成為了當(dāng)前科研人員共同關(guān)注的焦點(diǎn)。在科研人員的不斷探索中發(fā)現(xiàn),在飼料中添加益生菌、中草藥和后生元等物質(zhì)可以有效提高動物免疫能力[3]。后生元是在益生元基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新概念,由滅活的益生菌細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物組合而成,在刺激天然免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群和保護(hù)腸道黏膜完整性等方面發(fā)揮的作用可與益生菌比肩,但后生元發(fā)揮作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究和證實(shí)[4]。

防御素是抗菌肽家族中的一種,作為天然免疫中不可或缺的一部分,其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用[5,6]。研究發(fā)現(xiàn),防御素可以阻止病原微生物進(jìn)入呼吸道、陰道和腸道,降低感染性疾病的發(fā)病率[7]。目前,大量生產(chǎn)有活性的防御素仍是技術(shù)和經(jīng)濟(jì)難題[8],所以誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)防御素,成為實(shí)現(xiàn)提高動物免疫能力、預(yù)防疾病和輔助治療疾病的潛在方法[9]。綿羊體內(nèi)共有2種β-防御素,即綿羊β-防御素-1(Sheep β-defensin-1,SBD-1)和SBD-2。SBD-2僅在舌和回腸遠(yuǎn)端表達(dá),而SBD-1在整個消化道中均有表達(dá),且在瘤胃中表達(dá)量最多[10]。

枯草芽孢桿菌作為飼料中益生菌添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,但有關(guān)枯草芽孢桿菌后生元產(chǎn)品的報(bào)道卻少見?？莶菅挎邨U菌細(xì)胞壁中的主要成分為肽聚糖和磷壁酸,肽聚糖是免疫反應(yīng)中的重要抗原,也是后生元的重要組成成分[11]。有研究表明,益生菌肽聚糖可以有效保護(hù)胃腸道黏膜的健康[12],而致病菌肽聚糖則會刺激動物組織產(chǎn)生炎癥[13]?？莶菅挎邨U菌肽聚糖是否能夠作為后生元的組成成分參與免疫調(diào)節(jié),誘導(dǎo)綿羊防御素的表達(dá)未見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌肽聚糖和綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)為對象,通過實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),探究枯草芽孢桿菌肽聚糖誘導(dǎo)ORECs表達(dá)SBD-1的規(guī)律,對肽聚糖作為新型飼料添加劑和后生元使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 于內(nèi)蒙古呼和浩特市玉泉區(qū)北亞屠宰場選取12月齡左右的健康蒙古綿羊,裁取5 cm×5 cm 大小的瘤胃組織塊,使用含雙抗的磷酸緩沖液(Phosphate belanced solution,PBS)沖洗,沖洗干凈后撕掉肌層和漿膜層,浸泡于含雙抗的PBS中備用。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱,Thermo公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡,Nikon ECLIPSE公司產(chǎn)品;普通PCR儀,Labcycler公司產(chǎn)品;qPCR儀,ABI公司產(chǎn)品;多功能酶標(biāo)儀,Biotek公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑 枯草芽孢桿菌肽聚糖,購自Sigma公司;DMEM/F12培養(yǎng)基,購自Glibco公司;總RNA提取試劑盒,購自Axygen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR酶,均購自TaKaRa公司;綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒,購自武漢新啟迪生物科技有限公司。

1.4 ORECs培養(yǎng) 在金鑫等[14]建立的ORECs培養(yǎng)方法上改進(jìn)(縮短消化時間,免除過度消化對細(xì)胞帶來的影響)并培養(yǎng)細(xì)胞。將F3代ORECs以1×107個/mL接種于6孔板和96孔板中,加入DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理(使細(xì)胞不再分裂增殖并處于相同生長周期內(nèi))。處理好的細(xì)胞用于后續(xù)的刺激試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

1.5 不同時間條件下肽聚糖對ORECs的刺激試驗(yàn) 取出饑餓處理后的6孔板細(xì)胞,使用PBS清洗3次,對照組加入DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基2.5 mL,試驗(yàn)組加入30 μg/mL肽聚糖溶液2.5 mL,分別刺激2、4、6、8、10和12 h。

1.6 不同濃度肽聚糖對ORECs的刺激試驗(yàn) 取出饑餓處理后的6孔板細(xì)胞,使用PBS清洗3次,對照組加入DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基2.5 mL,試驗(yàn)組分別加入10、20、30、40和50 μg/mL 肽聚糖溶液2.5 mL,刺激2 h。

1.7 qPCR檢測刺激ORECs中SBD-1 mRNA的表達(dá)量 按照總RNA提取試劑盒說明書操作,提取1.5和1.6各組細(xì)胞的RNA,并反轉(zhuǎn)為cDNA。使用多功能酶標(biāo)儀將得到的cDNA調(diào)節(jié)至1 μg/μL,以β-actin為內(nèi)參基因,SBD-1為目的基因設(shè)計(jì)引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成,通過qPCR檢測ORECs中SBD-1 mRNA的相對表達(dá)量。反應(yīng)總體系為20 μL:ROX 0.4 μL,ddH2O 6 μL,上游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,下游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,cDNA模板 2 μL,TB Green 10 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,45個循環(huán);熔解程序:95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.8 ELISA檢測刺激上清中SBD-1蛋白的表達(dá)量 按照綿羊防御素β1 (DEFβ1) ELISA試劑盒說明書操作,檢測1.5和1.6各組培養(yǎng)基中(3 000 r/min離心10 min,取上清)SBD-1蛋白的表達(dá)量。

1.9 CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取出饑餓處理后的96孔板細(xì)胞,刺激操作同方法1.5和1.6,之后每孔加入10 μL CCK8溶液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。最后使用多功能酶標(biāo)儀于450 nm處檢測光密度(Optical density,OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用GraPhPad Prism 8.01對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01表示差異顯著,P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ORECs培養(yǎng) 培養(yǎng)0 d的ORECs未貼壁,細(xì)胞呈點(diǎn)狀懸浮于培養(yǎng)基中(圖1A)。培養(yǎng)3 d后,細(xì)胞呈島嶼狀分布(圖1B)。培養(yǎng)5 d后,細(xì)胞在3 d的基礎(chǔ)上呈輻射狀生長(圖1C)。培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞呈大理石鋪路狀,分布均勻,界限清晰(圖1D)。

圖1 ORECs原代細(xì)胞培養(yǎng)Fig.1 Primary culture of ORECsA:培養(yǎng)0 d; B:培養(yǎng)3 d; C:培養(yǎng)5 d; D:培養(yǎng)7 dA:Cultured for 0 d; B:Cultured for 3 d; C:Cultured for 5 d; D:Cultured for 7 d

2.2 不同時間條件下肽聚糖對ORECs中SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響 如圖2所示,qPCR擴(kuò)增曲線無異常,擴(kuò)增效果良好,熔解曲線無雜峰,分別在88.5 ℃和84.0 ℃出現(xiàn)單一峰,主峰對應(yīng)熔解溫度(Melting temperature,Tm)與引物預(yù)期Tm相同。如圖3所示,肽聚糖刺激ORECs不同時間后,各試驗(yàn)組SBD-1的mRNA相對表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.001);在2 h時SBD-1的mRNA相對表達(dá)量最多,之后表達(dá)量隨時間延長呈先降低后升高的趨勢。

圖2 β-actin和 SBD-1基因qPCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線(n=3)Fig.2 qPCR amplification curve and melting curve of β-actin and SBD-1 genes(n=3)A:β-actin擴(kuò)增曲線; B:SBD-1擴(kuò)增曲線; C:β-actin熔解曲線; D:SBD-1熔解曲線A:β-actin amplification curve; B:SBD-1 amplification curve; C:β-actin melting curve; D:SBD-1 melting curve

圖3 不同時間條件下肽聚糖對ORCEs中SBD-1 mRNA 表達(dá)量的影響(n=3)Fig.3 Effects of peptidoglycan on SBD-1 mRNA expression levels in ORCEs under different times (n=3)與對照組(0 h)相比,***:P<0.001Compared with the control group (0 h), ***: P<0.001

2.3 不同濃度肽聚糖對ORECs中SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響 如圖4所示,不同濃度肽聚糖刺激ORECs 后,除10 μg/mL試驗(yàn)組外,其他試驗(yàn)組SBD-1的mRNA相對表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.001),呈先升高后降低的趨勢,當(dāng)肽聚糖濃度為20 μg/mL時SBD-1的mRNA相對表達(dá)量最多。

圖4 不同濃度肽聚糖對ORCEs中SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響(n=3)Fig.4 Effects of peptidoglycan on SBD-1 mRNA expression levels in ORCEs under different concentrations (n=3)與對照組(0 μg/mL)相比,***:P<0.001Compared with the control group (0 μg/mL), ***: P<0.001

2.4 不同時間和不同濃度肽聚糖對ORECs上清中SBD-1蛋白表達(dá)量的影響 如圖5所示,肽聚糖濃度同為30 μg/mL,當(dāng)刺激時間為2 h時,SBD-1蛋白表達(dá)量達(dá)到最多并極顯著高于對照組(P<0.001)。刺激時間同為2 h,當(dāng)刺激濃度為20 μg/mL時,SBD-1蛋白表達(dá)量達(dá)到最多并極顯著高于對照組(P<0.001)。

圖5 不同時間(A)和不同濃度(B)肽聚糖對ORECs上清中SBD-1蛋白表達(dá)量的影響(n=3)Fig.5 Effects of peptidoglycan on SBD-1 protein expression levels in ORECs supernatant At different times (A) and concentrations (B) (n=3)與對照組相比(0 h/0 μg/mL),**:P<0.01,***:P<0.001Compared with the control group (0 h/0 μg/mL),** : P<0.01,***: P<0.001

2.5 CCK8細(xì)胞毒性試驗(yàn) 如圖6所示,不同時間和不同濃度肽聚糖刺激ORECs后,各試驗(yàn)組與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明枯草芽孢桿菌肽聚糖對ORECs無明顯毒性作用。

圖6 CCK8法檢測不同時間(A)和不同濃度(B)肽聚糖對ORECs的毒性(n=3)Fig.6 Toxicity of peptidoglycan on ORECs at different times (A) and concentrations (B) detected by CCK8 assay (n=3)

3 討論

隨著飼料中“禁抗令”的實(shí)施,防御素作為潛在的抗生素替代品被科研人員關(guān)注。益生菌誘導(dǎo)防御素表達(dá)的研究不斷增多,Singh等將8種羅伊氏乳桿菌及其外泌蛋白與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)滅活菌和外泌蛋白均能夠誘導(dǎo)β-防御素表達(dá)[15]。Jia等的研究表明,使用鼠李糖乳桿菌及其肽聚糖與雞胚小腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng),能夠誘導(dǎo)雞β-防御素-1的表達(dá)[16]?？莶菅挎邨U菌作為普遍使用的微生物添加劑已經(jīng)被證明能夠提高動物免疫能力、抵抗感染和調(diào)節(jié)免疫[17]。機(jī)體識別細(xì)菌主要依靠病原相關(guān)模式分子,如肽聚糖、磷壁酸和脂多糖等[18]。也有研究表明,機(jī)體通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)識別肽聚糖產(chǎn)生防御素,激活先天性免疫,幫助機(jī)體清除病原體。長期使用低劑量的肽聚糖可以增強(qiáng)機(jī)體的生理功能,刺激各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,維護(hù)生命健康[19]?？莶菅挎邨U菌細(xì)胞壁成分肽聚糖與防御素關(guān)系的研究少見報(bào)道,因此,本試驗(yàn)以O(shè)RECs為細(xì)胞模型,探究枯草芽孢桿菌肽聚糖誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的ORECs表達(dá)SBD-1的最佳條件。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,SBD-1的表達(dá)量呈濃度和時間依賴關(guān)系,20 μg/mL肽聚糖刺激時間2 h為肽聚糖誘導(dǎo)ORECs表達(dá)SBD-1的最佳條件。Jin等[20]和Zhang等[21]的研究表明,釀酒酵母菌甘露聚糖和β-葡聚糖最佳刺激條件分別為50 μg/mL刺激ORECs 4 h和10 μg/mL刺激ORECs 2～4 h。這可能是由于有效成分的結(jié)構(gòu)、刺激信號和誘導(dǎo)機(jī)制不同,呈現(xiàn)出不同的濃度和時間的依賴關(guān)系。

不同濃度肽聚糖誘導(dǎo)ORECs中SBD-1的mRNA和蛋白表達(dá)量的試驗(yàn)結(jié)果顯示,30、40和50 μg/mL試驗(yàn)組mRNA相對表達(dá)量均高于10 μg/mL試驗(yàn)組,但蛋白表達(dá)量相反,這可能是由于ORECs表面TLR-2受體有限,當(dāng)肽聚糖過多時,受體與肽聚糖結(jié)合達(dá)到閾值,出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制SBD-1蛋白的合成,使SBD-1的表達(dá)量下降并恢復(fù)到接近正常狀態(tài),從而保證SBD-1在機(jī)內(nèi)表達(dá)的動態(tài)平衡[22]。

CCK8毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同刺激時間和刺激濃度的試驗(yàn)條件均不會對ORECs的活性產(chǎn)生影響,表明肽聚糖不會引起細(xì)胞活性下降或細(xì)胞死亡裂解等情況。有報(bào)道稱,當(dāng)肽聚糖濃度低于50 μg/mL,刺激時間不超過12 h,不會使細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)[23]。并且肽聚糖的致炎作用與肽莖的第3個氨基酸有關(guān),第3個氨基酸為L-賴氨酸則不表現(xiàn)出炎癥反應(yīng),枯草芽孢桿菌肽聚糖肽莖第3個氨基酸為m-A2pm?？莶菅挎邨U菌肽聚糖刺激ORECs 12 h后,SBD-1表達(dá)量升高可能與產(chǎn)生炎性有關(guān)[24,25]。但本試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌肽聚糖是否能夠在不引起炎癥因子表達(dá)的條件下調(diào)控免疫有待進(jìn)一步研究證明?？莶菅挎邨U菌肽聚糖主要通過哪種受體和信號通路誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的問題還有待進(jìn)一步解決。

綜上所述,枯草芽孢桿菌肽聚糖作為免疫刺激物可以在體外誘導(dǎo)ORECs產(chǎn)生SBD-1。本試驗(yàn)是在體外進(jìn)行的,體外試驗(yàn)得出的最佳刺激條件與體內(nèi)試驗(yàn)是否一致還需要進(jìn)一步的探究和闡述。本試驗(yàn)為益生菌誘導(dǎo)防御素產(chǎn)生提供新證據(jù),為枯草芽孢桿菌肽聚糖產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。