產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及鑒定

陳美蓮 白睿璇 林琳

陳美蓮，白睿璇，林琳.產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（9）：63-68.

收稿日期：2023-08-20

作者簡(jiǎn)介：陳美蓮，女，1987年生，博士，助理研究員，主要從事微生物學(xué)分子生物方面研究。

基金項(xiàng)目：福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT190627）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020J05177）。

摘? 要：為了挖掘更多的產(chǎn)脂肪酶菌種資源，通過(guò)橄欖油平板檢測(cè)（透明圈觀察），采用高通量從海水、灘涂泥壤以及濱海植物分離篩選了324株真菌菌株，在pH 9.4的平板上篩選獲得了48個(gè)候選產(chǎn)脂肪酶菌株；經(jīng)ITS序列分析，初步鑒定了其中的12個(gè)菌株，分別為鐮刀菌、青霉屬、枝孢菌、交鏈孢屬等，其中多數(shù)為枝孢屬和青霉屬；進(jìn)一步利用氫氧化鈉滴定法檢測(cè)其中2個(gè)菌株（#89和#260）培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液，#89菌株產(chǎn)生的脂肪酶酶活為（6.92±2.40）U·mL-1，#260菌株產(chǎn)生的脂肪酶酶活為（7.67±1.70）U·mL-1。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；菌株資源；ITS序列；篩選

中圖分類號(hào)：Q 936??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：0253-2301（2023）09-0063-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.09.010

Screening and Identification of Lipase-producing Strains

CHEN Mei-lian1，2， BAI Rui-xuan1， LIN Lin1，2

（1. College of Materials and Chemical Engineering， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108，

China; 2. Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to explore more lipase-producing strain resources， 324 fungal strains were isolated and screened from the plants in seawater， coastal wetland & mud soil and coastal areas by high throughput through the olive oil plate detection （transparent circle observation）. Forty-eight candidate lipase-producing strains were screened on the plate with pH 9.4. Through the ITS sequence analysis， 12 strains were preliminarily identified as Fusarium， Penicillium， Cladosporium， Alternaria， etc.， most of which were Cladosporium and Penicillium. The fermentation broth of the two strains （#89 and #260） cultured for 24 h was further detected by using the titration method of sodium hydroxide. The lipase activity produced by #89 strain was （6.92±2.40） U·mL-1， and the lipase activity produced by #260 strain was （7.67±1.70） U·mL-1.

Key words： Lipase； Strain resources； ITS sequence； Screening

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），即三?；视王；饷福且活愄厥獾孽ユI水解酶，可催化水解、酯化、酯交換、對(duì)映體拆分等多種化學(xué)反應(yīng)[1]。與化學(xué)催化劑相比，脂肪酶催化的反應(yīng)具有低能耗、選擇性好和轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于洗滌工業(yè)、食品加工、醫(yī)藥和化妝品生產(chǎn)、生物能源合成和皮革加工等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域[2-3]。

微生物脂肪酶種類多、作用溫度和pH值范圍廣泛、穩(wěn)定性和活性均較高、且對(duì)底物純度要求不嚴(yán)、便于工業(yè)生產(chǎn)和獲取，是工業(yè)脂肪酶的主要來(lái)源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年微生物脂肪酶的市場(chǎng)消費(fèi)約為4.25億美元，預(yù)計(jì)到2023年將達(dá)到5.902億美元[4]。隨著高效篩選技術(shù)和基因工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的應(yīng)用，目前已有不少微生物脂肪酶實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)[5]。我國(guó)雖也很早開始開展對(duì)脂肪酶的研究開發(fā)，但目前已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的菌種種類少、產(chǎn)量低，多數(shù)企業(yè)還是依賴昂貴的進(jìn)口脂肪酶，因此，挖掘新的或質(zhì)量更優(yōu)的脂肪酶產(chǎn)生菌種具有重要研究意義。目前常用的產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩方法主要有：以溴甲酚紫為指示劑的油脂平板篩選法、以羅丹明 B為指示劑的平板篩選法、三丁酸甘油酯平板透明圈法、以橄欖油乳化液為底物的平板透明圈法等，通過(guò)以上方法，越來(lái)越多的產(chǎn)脂肪酶菌株被篩選獲得[6-10]。而ITS序列，指真菌5.8S、18S和28S rDNA序列之間的轉(zhuǎn)錄間隔（Internal Transcribed Spacer），在自然中變異較快，在絕大多數(shù)真菌中表現(xiàn)出序列多態(tài)性，且其序列片段較小，易于分析，故被廣泛用于快速鑒定各種真菌[11]。

篩選不同來(lái)源的脂肪酶產(chǎn)生菌是脂肪酶研究的基礎(chǔ)，特別是一些極端環(huán)境或特殊生境中的產(chǎn)脂肪酶菌種具有重大開發(fā)潛力。生活在海水、灘涂泥壤以及濱海植物中的微生物，因其特殊的生境，具有更高的耐鹽性、耐堿性等抗逆性，同時(shí)也可能具有更好的酶學(xué)特性。因此，本研究以橄欖油為底物，通過(guò)橄欖油平板檢測(cè)（透明圈觀察），采用高通量從海水、灘涂泥壤以及濱海植物分離篩選324株真菌菌株，在pH 9.4的堿性平板上初步獲得候選脂肪酶產(chǎn)生菌，并通過(guò)ITS序列分析鑒定了其中的12個(gè)菌株，研究結(jié)果可為后期的脂肪酶酶學(xué)性能改造研究（如產(chǎn)酶最適條件優(yōu)化、作用條件改進(jìn)等）提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，從而拓展微生物脂肪酶的應(yīng)用價(jià)值。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試菌株? 海洋生物與藥物福建省高校工程研究中心從海水、灘涂泥壤以及濱海植物中分離得到的真菌（共324株），并以菌絲塊置于無(wú)菌水（含20%甘油）中，于-20℃凍存。

1.1.2? 主要藥品及試劑? PDA預(yù)制粉末（主要成分為馬鈴薯浸粉6 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），橄欖油、氫氧化鈉、氯化鉀、異丙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），聚乙烯醇124型、甘氨酸（上海麥克林生化科技股份有限公司），Taq PCR Mix、DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]；引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.1.3 ??試驗(yàn)儀器? 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司）、勻漿機(jī)（江蘇東鵬科技有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、智能光照培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、多樣品組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、臺(tái)式離心機(jī)（艾本德中國(guó)有限公司）、微量紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）、基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、pH計(jì)（德國(guó)賽多利斯公司）等。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 菌株的活化與培養(yǎng)? 在無(wú)菌條件下，切取一小塊供試菌株的菌絲塊，轉(zhuǎn)接至新的PDA固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃、黑暗、倒置培養(yǎng)3～5 d，拍照記錄供試菌株的菌落形態(tài)。

1.2.2? 橄欖油固體平板制作? 量取適量橄欖油與2倍體積的4%聚乙烯醇混勻，勻漿器高速攪拌使之乳化；在緩沖液（不同pH值）中加入2%瓊脂，加熱融化后與適量的橄欖油乳化液（5%）混勻，制成厚度約為2 mm的橄欖油固體平板，用打孔器等距離打孔（孔徑為2 mm）。

1.2.3? 產(chǎn)脂肪酶菌株的平板篩選? 用無(wú)菌牙簽挑取一小團(tuán)上述活化培養(yǎng)的供試菌株的氣生菌絲，轉(zhuǎn)接至橄欖油固體平板的孔中，于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃、黑暗、正置培養(yǎng)1～5 d，在此期間，每天觀察并記錄透明圈的形成情況，并拍照；有透明圈形成的菌株即為候選脂肪酶產(chǎn)生菌。

1.2.4? 候選產(chǎn)脂肪酶菌株的基因組DNA的快速提取? 于1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入少量石英砂，及420 μL提取緩沖液（1 mol·L-1 KCl），切取適量菌絲塊（約5 cm×7 cm）于上述離心管中，利用多樣品組織研磨儀進(jìn)行組織破碎，65 Hz振蕩2 min，之后12000 r·min-1，離心10 min；吸取200 μL上清液至新的離心管中，加入0.6倍體積（即120 μL）的異丙醇，上下顛倒混勻，于-20℃冷凍1 h以上，使DNA沉淀；之后12000 r·min-1，離心10 min，棄上清液；用70%乙醇洗滌1次，12000 r·min-1，離心5 min后，棄乙醇，室溫下靜置5～10 min，待酒精揮發(fā)之后，加入60 μL無(wú)菌水，溶解DNA；樣品保存于4℃冰箱。

1.2.5? 候選產(chǎn)脂肪酶菌株的ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序分析? 按上述步驟提取候選菌株的基因組DNA，利用ITS序列通用引物（ITS1：5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3′，ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取少量產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證，確認(rèn)有條帶后，再將所得PCR產(chǎn)物送公司（生工生物）測(cè)序，最后通過(guò)NCBI的Blast功能（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將上述測(cè)序所得的樣品ITS序列與數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6? 產(chǎn)脂肪酶菌株發(fā)酵的粗酶液制備? 為進(jìn)一步檢測(cè)候選菌株所產(chǎn)脂肪酶的活性，無(wú)菌條件下將上述獲得的候選產(chǎn)脂肪酶菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基[橄欖油乳化液10

mL·L-1，（ NH4）2SO4 1 g·L-1，K2HPO4 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，蔗糖5

g·L-1，自然pH]中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)24～48 h，離心收集上清液，即為粗酶液。

1.2.7? 氫氧化鈉滴定法檢測(cè)粗酶液中脂肪酶活力? 將橄欖油乳化液與0.1 mol·L-1 Gly-NaOH（pH 9.4）緩沖液1∶3混合乳化后吸取8 mL于燒杯中37℃水浴5 min，加入50 μL 粗酶液后立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min后將其放入95℃水浴中溫浴5 min終止反應(yīng)，取出反應(yīng)液后常溫放置2 min，再用pH計(jì)測(cè)量初始pH，用0.02 mol·L-1 NaOH滴定反應(yīng)液至pH=10，記錄消耗NaOH體積，根據(jù)消耗的堿量計(jì)算其酶活力。

酶活（U·mL-1）=40×（V1-V2）×n÷t其中，V1為待測(cè)樣品消耗的NaOH體積（mL）；V2為空白對(duì)照消耗的NaOH體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；t為酶作用時(shí)間。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 供試菌株的菌落形態(tài)觀察

由圖1可知，供試菌株的菌落形態(tài)各異，說(shuō)明待測(cè)菌株比較多樣化。

2.2? 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

采用橄欖油固體檢測(cè)平板篩選324株真菌菌株。由圖2可知，在堿性（pH 9.4）的檢測(cè)板中，有多個(gè)菌株（共48個(gè)）可形成透明圈，且透明圈大小不一（直徑為0.5～1.2 cm），以上結(jié)果說(shuō)明這些候選菌株為堿性脂肪酶產(chǎn)生菌，且產(chǎn)生的脂肪酶活性強(qiáng)弱不一。

2.3? 候選產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

2.3.1? ITS序列擴(kuò)增與測(cè)序? ITS序列擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示，所檢測(cè)的樣品均是在750 bp左右有1條特異的條帶，符合ITS序列的特征，表明后續(xù)可直接將PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序分析。

2.3.2? 測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析? 由表1可知，ITS序列分析結(jié)果顯示，所檢測(cè)的12個(gè)候選產(chǎn)脂肪酶菌株分別有鐮刀菌、青霉、枝孢菌、交鏈孢屬等，主要鑒定到屬，其中多數(shù)為枝孢屬和青霉屬。

2.3.3? 脂肪酶活力測(cè)定? 由圖4可知，所檢測(cè)的2個(gè)產(chǎn)酶菌株（#89、#260）在培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)液逐漸變清澈，推測(cè)是培養(yǎng)液中酶的底物（橄欖油乳化物）被消耗減少造成的，進(jìn)一步說(shuō)明了這兩個(gè)菌株產(chǎn)生的脂肪酶具有一定的活性。

由表2可知，在培養(yǎng)24 h所得的粗酶液中，#89菌株產(chǎn)生的脂肪酶酶活為（6.92±2.40）U·mL-1，#260菌株產(chǎn)生的脂肪酶酶活為（7.67±1.70）U·mL-1。橄欖油平板檢測(cè)結(jié)果顯示，所得粗酶液在平板上均能誘導(dǎo)透明圈產(chǎn)生，且#89的透明圈更大一些，但滴定結(jié)果是#260的酶活更高，推測(cè)可能跟堿滴定法的不穩(wěn)定性以及菌株本身的產(chǎn)酶條件、作用pH范圍、作用溫度等有關(guān)，后續(xù)將通過(guò)其他試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3? 結(jié)論與討論

本研究利用橄欖油平板透明圈法篩選，初步獲得了多個(gè)堿性產(chǎn)脂肪酶菌株，這些菌株主要來(lái)自海水、灘涂泥壤以及濱海植物中分離的真菌；進(jìn)一步通過(guò)ITS序列分析，初步鑒定了其中的12個(gè)產(chǎn)酶菌株，多數(shù)為枝孢屬和青霉屬。后續(xù)將通過(guò)以下試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定菌種及其產(chǎn)生的脂肪酶的酶學(xué)性能：一是觀察形態(tài)學(xué)特征，根據(jù)《常見與常用真菌》鑒別[12]；二是根據(jù)ITS序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步構(gòu)建目標(biāo)菌株的ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹[13-14]；三是通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定產(chǎn)酶條件[15]；四是結(jié)合平板檢測(cè)和對(duì)硝基苯酚法分析目標(biāo)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)，以及不同條件對(duì)其活力、穩(wěn)定性的影響等[16-17]。

相較于傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑，脂肪酶具有高度的催化特異性，其帶來(lái)的副反應(yīng)較少，對(duì)提升產(chǎn)物的品質(zhì)有很好的作用。工業(yè)用脂肪酶大多來(lái)源于微生物，但由于天然微生物來(lái)源的脂肪酶的作用條件、穩(wěn)定性等無(wú)法滿足諸多生產(chǎn)的實(shí)際需求，因此，國(guó)際范圍內(nèi)工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶主要是通過(guò)分子改造而獲得的具有優(yōu)良特性的工程菌生產(chǎn)的。目前，丹麥的諾和諾德公司、美國(guó)的杜邦公司、荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)以及丹麥的漢森公司是全球脂肪酶的主要供應(yīng)商（http：//www.marketsandmarkets.com， 2020）。近幾年，國(guó)內(nèi)在微生物產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化、基因工程及蛋白質(zhì)工程改造等方面，均有深入研究并取得了一定的成果，但尚未見其大量應(yīng)用于生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。因此，挖掘更多酶活力高、產(chǎn)量高和成本較低的脂肪酶產(chǎn)生菌，或是運(yùn)用已有的和開發(fā)新的技術(shù)去改良已知脂肪酶的酶學(xué)特性，均有利于提高微生物脂肪酶的應(yīng)用前景，幫助其實(shí)現(xiàn)商業(yè)價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）