谷成毅，陳明亮，丁松，周游

（三峽大學附屬仁和醫(yī)院骨科，湖北宜昌 443001）

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一類大分子蛋白質，分子量為289 kDa，作為細胞多種病理生理過程的關鍵調控分子，在不同的組織細胞中均有表達，在細胞病理生理過程中的作用至關重要［1］。mTOR 存在兩種不同復合物形式，即mTORC1 和mTORC2［2］。mTOR 整合細胞外多種信號刺激，參與體內多條信號通路，影響轉錄及蛋白質合成，與細胞凋亡、自噬、生長等均有重要聯(lián)系［3］。mTORC 1 在干細胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。

肌腱干細胞（tendon stem cell,TSC）是一群存在于肌腱中具有多向分化能力的間充質干細胞，在合適的條件下可以分化為肌腱組織、骨骼組織或者軟骨組織［5］。有研究發(fā)現肌腱干細胞在肌腱病的發(fā)生、發(fā)展中也扮演著重要角色［6，7］。當肌腱干細胞處于異常的誘導環(huán)境時，會朝著非肌腱細胞方向分化［8］。老齡化會使肌腱干細胞的干性降低，增殖能力、克隆能力都顯著下降，從而更易于向非肌腱細胞方向分化［9］。肌腱中殘存的干細胞對于組織的再生、修復非常重要，然而老齡化會導致肌腱中肌腱干細胞數目下降而且功能減弱［10］。有臨床研究表明，老齡化肌腱的愈合能力很差，嚴重影響老齡人群肌腱病的術后康復效果［11］。

mTOR 參與干細胞的更新分化，故本研究擬通過調控mTOR 蛋白觀察其對老年大鼠肌腱干細胞成肌腱分化的影響，從而找出針對老年肌腱損傷、疾病修復的新思路，為臨床提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，老年大鼠（1年，28 只）和青年大鼠（12 周，4 只），清潔級，由陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。體外實驗分為老年大鼠（4 只）和青年大鼠（4 只）兩組；體內實驗分為mTOR 表達（6 只）、mTOR 干擾（6 只）、GFP（6只）、空白（6 只）。

1.2 體外試驗

1.2.1 TSCs 的分離培養(yǎng)

老年和青年SD 大鼠各4 只CO2安樂處死，取跟腱剪碎，0.25%胰酶消化1 h。4℃1 000 r/min 離心，加10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液（1×10/ml）。接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)。2 d 后換液，2～3 d 換液1 次，細胞占瓶底80%左右時進行傳代。傳至3 代，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 老年大鼠TSCs 轉染

將老年大鼠TSCs 分為mTOR 表達、mTOR 干擾、GFP 和空白四組。使用腺病毒轉染制作mTOR表達、mTOR 干擾和GFP 的TSCs。取第3 代老年大鼠TSCs，通過重組腺病毒Ad-mTOR 按照預實驗測定的最大MOI 值（100）轉染，12 h 后換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。

1.2.3 Western blot 檢測

各組細胞加入RIPA 裂解液置于冰上30 min。然后12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，檢測總蛋白濃度。4%～20%梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，室溫5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗mTOR（1∶1 000）、Raptor（1∶500）、S6K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）搖晃過夜。TBST 清洗3 遍，加二抗（1∶10 000）避光搖晃1 h，洗滌3 次。BIO-RAD 凝膠電泳圖像分析儀采圖，圖像分析軟件統(tǒng)計分析，檢測各指標的表達強度。

1.2.4 肌腱修復材料制備

（1）3 瓶上述SD 老齡大鼠TSCs，腺病毒處理分為mTOR 過表達、mTOR 干擾、GFP。轉染72 h 后收細胞備用；（2）稱2.2 g 脫乙酰度＞95%的殼聚糖溶100 ml 的0.1 mol/L 的冰醋酸溶液中，配成2.15 wt%殼聚糖C 溶液。磁力攪拌器保持50℃左右攪拌4 h，121℃消毒10 min。稱5 g β-甘油磷酸鈉溶于5 ml 去離子水中，攪拌均勻得到50 wt% GP 溶液，用0.22 μm 的濾器過濾除菌。取6 ml C 溶液，再將1 ml 的GP 溶液逐滴加入到C 溶液中，混合均勻獲得C/GP溶液；（3）將水凝膠和目的細胞懸液按照2∶1 的體積比配置備用。

1.3 體內試驗

1.3.1 髕腱損傷與修復

將24 只老年大鼠分為mTOR 表達、mTOR 干擾、GFP 和空白四組，每組6 只。異氟醚麻醉，取仰臥位，酒精消毒雙側膝關節(jié)。以右側膝關節(jié)為例，膝屈曲30°，取正中切口，全長2 cm 至髕骨上下緣，切開皮膚、筋膜顯露髕腱，使用2 mm×5 mm 的模版去掉髕腱組織，得到損傷模型。在髕腱缺損處加入50 μl 的水凝膠和實驗細胞混合液，關閉切口，同法處理對側。待術后2 周和4 周，每組每次3 只取髕腱進行檢測。

1.3.2 HE 染色

制作SD 老齡大鼠髕腱損傷修復模型，分別在2周、4 周收取髕腱標本經處理成石蠟切片，將組織用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，后切片機冠狀面連續(xù)切片（5 μm），脫蠟后HE 染色。每組隨機取5張切片置于IX70 顯微鏡下觀察3 個視野中髕腱缺損的修復情況。組織學評分標準：從纖維結構、纖維排列、核圓程度、炎癥細胞、靜脈數量和細胞數量等方面進行評分。

1.3.3 免疫組化

先石蠟組織脫蠟后水化，再用胰酶修復法修復，使用SCX、Col1 的1 抗抗體溶液。染色液鏡下染色蘇木素染核，90s 后60℃水浴環(huán)境下返藍10 min。梯度乙醇脫水，常溫下晾干，中心樹膠封片。使用光密度（optical density,OD）計量。

1.3.4 生物力學測試

采用CO2安樂處死模型大鼠。取2、4 周大鼠髕腱缺損模型的完整后肢，保留髕骨和脛骨髕腱，使用生物力學測試儀進行生物力學檢測，測量修復組織的最大損毀強度（單位N）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件對數據進行分析，計量數據以±s表示，資料呈正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關蛋白表達比較

青年與老年大鼠肌腱干細胞中mTOR 及相關蛋白的表達Western blot 見表1 所示：mTOR、Raptor、P-Raptor 表達老年組顯著高于青年組（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K、P-S6k 兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

表1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

指標mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k青年組（n=3）0.9±0.1 2.2±0.3 0.7±0.0 2.3±0.1 0.8±0.0 6.2±0.6 4.7±0.4老年組（n=3）1.8±0.1 4.1±0.3 2.1±0.1 2.3±0.0 0.8±0.1 6.2±0.6 4.6±0.4 P 值0.032 0.028 0.012 0.083 0.102 0.096 0.094

2.2 老年大鼠TSCs 體外轉染后mTOR 相關蛋白表達比較

老年大鼠TSCs 體外轉染后mTOR 及相關蛋白的表達Western blot 見表2。mTOR、Raptor 及P-Raptor表達從高到低的順序：mTOR 的表達組＞GFP 組＞mTOR 干擾組（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K 和P-S6k 的表達三組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 老年大鼠TSCs 體外轉染后mTOR 相關蛋白表達比較( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

表2 老年大鼠TSCs 體外轉染后mTOR 相關蛋白表達比較( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

指標P 值mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k mTOR 表達組（n=3）3.9±0.1 1.0±0.0 4.2±0.6 1.2±0.1 3.4±0.5 4.1±0.7 3.7±0.4 mTOR 干擾組（n=3）1.2±0.0 0.3±0.0 1.5±0.2 1.2±0.0 3.1±0.4 3.9±0.6 3.3±0.4 GFP 組（n=3）2.1±0.1 0.6±0.1 2.1±0.2 1.2±0.1 3.6±0.6 4.1±0.6 3.6±0.4 0.015 0.021 0.032 0.076 0.082 0.091 0.094

2.3 體內修復檢測結果

HE 染色觀察髕腱損傷的修復效果見圖1、表3，與術后2 周相比，術后4 周四組HE 組織評分均顯著增加（P＜0.05），相應時間點分數從高到低的順序依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞mTOR 表達組＞空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組織學評分mTOR 干擾組相對其他三組纖維排列相對更整齊，炎癥細胞數量更少，靜脈數量和細胞數量明顯增多。

表3 老年大鼠髕腱修復檢測結果比較（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

表3 老年大鼠髕腱修復檢測結果比較（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

指標HE 組織評分時間點2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值P 值0.016 0.021 Col1 組化(OD)0.006 0.005 SCX 組化(OD)0.008 0.009最大損毀強度(N)0.038 0.041空白對照組（n=6）2.3±0.1 3.3±0.7 0.042 1.1±0.1 1.1±0.1 0.085 0.9±0.1 1.0±0.1 0.083 15.0±0.1 24.1±0.1 0.044 mTOR 表達組（n=6）5.1±0.8 7.2±1.0 0.047 0.4±0.1 0.4±0.1 0.079 0.4±0.1 0.4±0.1 0.069 17.1±0.2 26.1±0.3 0.041 mTOR 干擾組（n=6）13.2±1.2 17.5±1.4 0.038 4.3±0.2 4.5±0.3 0.063 5.1±0.4 5.6±0.5 0.093 36.2±0.2 46.3±0.3 0.037 GFP 組（n=6）8.1±1.0 11.5±1.2 0.046 2.7±0.2 2.9±0.2 0.068 2.1±0.1 2.2±0.1 0.077 25.1±0.2 36.2±0.2 0.035

石蠟切片免疫組化Col1 和SCX 檢測結果見圖2、圖3、表3，與術后2 周相比，術后4 周，Col1及SCX 的表達均無顯著變化（P＞0.05），相應時間點，四組間Col1、SCX 的表達定量從高到低依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞空白組＞mTOR 表達組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

圖2 四組髕腱損傷修復組織學觀察（Col1 免疫組化，×100 μm）。2a, 2e: 空白對照；2b, 2f: mTOR 表達組；2c, 2g: mTOR 干擾組；2d, 2h: GFP 組。Figure 2. Histology of patellar tendon injury repair in four groups (Col1 immunohistochemistry, ×100 μm). 2a, 2e: Blank control. 2b, 2f:mTOR expression group.2c,2g:mTOR interference group.2d,2h:GFP group.

圖3 四組髕腱損傷修復組織學觀察（SCX 免疫組化×100 μm）。3a, 3e: 空白對照；3b, 3f: mTOR 表達組；3c, 3g: mTOR 干擾組；3d, 3h: GFP 組。Figure 3.Histology observation of patellar tendon injury repair in four groups(SCX immunohistochemistry×100 μm).3a,3e:Blank control.3b,3f:mTOR expression group.3c,3g:mTOR interference group.3d,3h:GFP group.

生物力學結果見表3，與術后2 周相比，術后4周四組最大損毀強度均顯著增加（P＜0.05），相應時間點，最大損毀強度值從大到小依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞空白組＞mTOR 表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

mTOR 是一類大分子蛋白質，存在兩種不同復合物形式，即mTORC1 和mTORC2［10，12］。mTORC1 由mTOR、RAPTOR 和mLST8 組成［3］。mTORC 1 在干細胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。mTOR 整合細胞外多種信號刺激，參與體內多條信號通路［13，14］，影響轉錄及蛋白質合成，與細胞凋亡、自噬和生長等生命活動均有很重要的聯(lián)系［15～17］。有研究表明使用mTOR 抑制劑可以延長壽命減緩衰老，說明mTOR 在衰老的過程中表達是增加的［18］。本研究通過檢測青年和老年大鼠TSCs 中mTOR 及與其相關的蛋白表達，也發(fā)現mTOR、RAPTOR 在老年大鼠細胞中表達遠遠高于青年大鼠，從而證實了mTOR 的表達會隨衰老而增強。眾所周知，老齡化是導致肌腱損傷修復變得更加困難的一個重要因素，部分原因就是老齡化過程會使肌腱組織中的肌腱干細胞向肌腱方向分化的能力減弱［5］。mTOR 對于干細胞的自我更新和分化很重要，而且本實驗結果提示老年大鼠的mTOR 蛋白表達相對青年大鼠增加，故此推斷可能是mTOR 蛋白表達的增加抑制老年大鼠肌腱干細胞的成肌腱分化，從而導致老齡化肌腱損傷修復能力減弱。

有研究通過構建肌腱損傷模型，在病變部位植入自體或異體來源干細胞，調控干細胞的分化方向達到促進肌腱再生修復的作用［19～21］。Kokubu 等［22］將脂肪來源的干細胞注射到跟腱損傷模型缺損處，證明了脂肪來源的干細胞能夠促進損傷跟腱的修復。從曉霞等［23］研究發(fā)現，AKT-mTOR 軸是肌腱分化關鍵調節(jié)信號，并為肌腱損傷和肌腱相關疾病提供了新的治療靶點。本研究通過腺病毒轉染將控制mTOR 蛋白表達的老齡大鼠TSCs 混合物植入大鼠髕腱缺損處建立髕腱缺損修復模型，通過調節(jié)mTOR 蛋白的表達來探索修復效果的差異。研究結果顯示，HE 染色抑制mTOR 蛋白表達組中肌腱類似組織更多，其組織學評分、纖維結構評分均高于mTOR 蛋白過表達組。免疫組化結果也顯示抑制mTOR 蛋白表達組Col1 表達均高于mTOR 蛋白過表達組。本研究的結果說明抑制mTOR 蛋白的表達能夠促進老齡大鼠肌腱干細胞成肌腱分化，利于老年肌腱損傷組織的修復。

有研究發(fā)現，mTOR 蛋白的活性在肌腱組織損傷后出現改變，參與肌腱組織的修復過程［24］。另有研究發(fā)現，通過喂飼mTOR 蛋白抑制劑，可使損傷的肌腱組織在結構和生物力學上與成年小鼠的肌腱相似［25］。表明mTOR 蛋白參與了肌腱組織損傷后的修復過程。本實驗生物力學研究結果顯示，抑制mTOR蛋白表達后，修復的肌腱組織韌性更強，抗拉能力好，組織損傷修復效果相對較好。將來可通過對該信號通路進一步深入研究，明確其作用機制和下游的信號蛋白，為臨床上使用藥物抑制mTOR 蛋白的表達，來預防和治療老齡化的肌腱損傷和肌腱病提供理論依據。

本研究局限性在于實驗動物性別差異（雌性動物缺乏）、數量少、隨訪觀察時間短。然而，本研究結果支持了這樣的假設，即mTOR 蛋白調控TSCs 向成肌腱方向分化，可以調節(jié)老年大鼠肌腱損傷的修復。筆者認為，mTOR 蛋白在老化肌腱損傷修復中起著重要作用，但是精確分子機制尚不明確，有待進一步深入研究。