Ezrin/YAP信號軸促進胃癌細胞增殖的作用研究

覃一晉，單漢國，陳茂良，彭肅，王春云，陽樂彬

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 胃腸外科，湖南 衡陽 421001）

根據(jù)全球癌癥流行病學(xué)的數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計，2020年胃癌在全世界所有癌癥中發(fā)病率排名第五，病死率排名第四。雖然在過去的幾十年中，胃癌的發(fā)病率和病死率已經(jīng)大大下降，但其總體存活率仍然很低[2]。美國胃癌患者的5年生存率為42.9%[3]，而中國僅為27.4%[4]。胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)顯著的性別和地域特征[5-6]。男性的胃癌發(fā)病率為女性的兩倍。東亞和東歐的發(fā)病率最高，尤其是在蒙古、日本、韓國和中國[7-8]，這可能與地區(qū)腌制食品的飲食習(xí)慣有很大關(guān)系[9-10]。對于胃癌患者來說，轉(zhuǎn)移是最常見的死亡原因，也是成功治療的主要障礙[11]。腫瘤細胞從原發(fā)部位向轉(zhuǎn)移部位的擴散是一個復(fù)雜的多階段過程，可能包括細胞增殖和遷移、基底膜降解、侵襲和黏附[12-13]。目前的臨床方法不能準確預(yù)測哪些患者將發(fā)生轉(zhuǎn)移。為了開發(fā)預(yù)測、診斷和治療胃癌轉(zhuǎn)移的有效新策略，必須確定控制轉(zhuǎn)移的分子機制。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，埃茲蛋白（Ezrin）在胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌和乳腺癌等多種腫瘤中高表達，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)[13-15]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員，其基因定位于人類染色體6q25，由585 個氨基酸組成[16]。Ezrin 的一個重要功能就是構(gòu)成細胞表面復(fù)合物而參與細胞-細胞間和細胞-基質(zhì)間的黏附。目前，關(guān)于Ezrin 在胃癌中生長和轉(zhuǎn)移的研究尚不清楚。

YAP 蛋白又稱為Yes 相關(guān)蛋白，是一種細胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，是Hippo 信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子之一，若Hippo 信號通路失活，未被磷酸化的YAP/TAZ 則轉(zhuǎn)入細胞核，與TEAD 結(jié)合，啟動Mst、WW45、Lats1、Lats2 等靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，YAP1 蛋白在細胞核高表達預(yù)示胃癌患者預(yù)后較差[7]，課題組前期對Ezrin與YAP 在胃癌組織中的表達水平進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)Ezrin 與YAP 在胃癌組織中高表達，兩者表達水平正相關(guān)，且都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。因此，在此基礎(chǔ)上，本研究進一步在胃癌細胞中分析Ezrin 蛋白及YAP 通路的關(guān)系及其功能，為胃癌的機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌細胞株MGC803 和AGS 均購自ATCC（美國模式菌種收集中心，USA）；常用的細胞培養(yǎng)試劑購自以色列Biological Industries 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司。YAP 激動劑（HY-101299B） 購自美國MCE 公司。鼠ACTIN （貨號：23660-1-AP）、YAP 抗體（貨號：13584-1-AP） 購自美國Proteintech 公司；兔WW45抗體（貨號：A18667）購自美國Abclona 公司；兔Ezrin （貨號：AF6172）、Mst （貨號：DF13152）、Lats1、Lats2（貨號：DF7517）、TEAD 抗體（貨號：DF3141）購自美國Affinity 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)所有細胞均用10%胎牛血清、10 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染細胞生長于對數(shù)生長期時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，將細胞按照每孔3×105接種在6 孔板中。常規(guī)培養(yǎng)18 h 后（細胞密度約為70%），按照Lipofectamine 2000 說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組為：si-NC（轉(zhuǎn)染si-NC 的陰性對照序列）、si-Ezrin（轉(zhuǎn)染si-Ezrin 序列）。siRNA 由中洪分子實驗室完成，分別為si-Ezrin#1：ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C；si-Ezrin#2：GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A；si-Ezrin#3：TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA。細胞轉(zhuǎn)染24 h 后，收獲細胞提取蛋白或者消化細胞鋪板進行下一步實驗。

1.2.3 qRT-PCR 檢測收集樣本，加入TRIzol 裂解液，提取總RNA。將RNA 通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 試劑盒合成 cDNA。利用熒光PCR 儀進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL。反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40 個循環(huán)。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽） 有限公司合成，Ezrin 正向：ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C，反向：GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A；YAP 正向：TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA，反向：TCA TGC TTA GTC CAC TGT CTG T；Mst 正向：ATC GCG TCC AGG TGC TTT C，反向：GCC CGA TAG ACC TTG CCA A；WW45 正向：ATG CTG TCC CGA AAG AAA ACC，反向：AGG CAT AAG ATT CCG AAG CAG A；Lats1 正向：AAT TTG GGA CGC ATC ATA AAG CC，反向：TCG TCG AGG ATC TTG GTA ACT C；Lats2 正向：ACT TTT CCT GCC ACG ACT TAT TC，反向：GAT GGC TGT TTT AAC CCC TCA；TEAD 正向：ATG GAA AGG ATG AGT GAC TCT GC，反向：TCC CAC ATG GTG GAT AGA TAG C；內(nèi)參GAPDH 正向：GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT，反向：GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG。相對表達量根據(jù)2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 Western blot 檢測用RIPA 試劑盒提取總蛋白，使用BCA protein assay kit 測定蛋白濃度。每個樣品提取40 μg 上樣，采用10%的SDS-PAGE 進行凝膠電泳分離，使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST 溶液室溫封閉后，分別滴加稀釋的一抗Ezrin、YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 4 ℃過夜，添加對應(yīng)的二抗室溫下?lián)u床孵育1 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光法使條帶顯影。在化學(xué)發(fā)光成像儀上進行條帶曝光成像。

1.2.5 CCK-8 檢測待胃癌細胞生長到對數(shù)生長期，將細胞消化下來，每孔2 000 個細胞鋪于96 孔板中。第2 天去掉舊的培養(yǎng)基，加入100 μL 新的培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，培養(yǎng)箱中處理3 h，用酶標儀檢測OD450 處的吸光值。此數(shù)據(jù)記為第1 天的數(shù)據(jù)。剩余96 孔板中的細胞按照分組加入2.5 μmol/L的HY-101299B，繼續(xù)培養(yǎng)2、4 d 后檢測OD450 處的吸光值。

1.2.6 平板克隆實驗待胃癌細胞生長到對數(shù)生長期，將細胞消化下來，每孔1 000 個細胞鋪于6 孔板中。待到第2 天，去掉舊的培養(yǎng)基，按照分組加入2.5 μmol/L 的HY-101299B，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。去掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 清洗2 次，用甲醇固定15 min，PBS 清洗2 次后，用1%結(jié)晶紫染色15 min，吸去結(jié)晶紫，PBS 清洗3 次，平板晾干后拍照。用image J 統(tǒng)計平板克隆的數(shù)目。

1.2.7 Transwell 檢測去除Transwell 小室孔中的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的細胞，加入PBS 清洗5 min，再加入0.1 %結(jié)晶紫靜置染色1 h，PBS清洗3 次，平板晾干后拍照將小室倒置在載玻片上拍照。用image J 統(tǒng)計細胞的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin沉默效果

相對于各自的空白對照組，si-Ezrin#1、si-Ezrin#2和si-Ezrin#3 轉(zhuǎn)染后的MGC803 細胞中Ezrin 的mRNA水平下降約33%、28%和18%，蛋白水平分別下降約46%、37%和28%；AGS 細胞中Ezrin 的mRNA 水平下降約36%、31%和25%，蛋白水平分別下降約42%、31% 和24%；各自的陰性對照組Ezrin 的mRNA 與蛋白水平均無明顯變化（均P＞0.05）（圖1）。根據(jù)以上結(jié)果，選擇si-Ezrin#3 進行后續(xù)實驗。

2.2 Ezrin 沉默與YAP 激動劑對胃癌細胞增殖與遷移能力的影響

預(yù)實驗結(jié)果顯示，2.5 μmol/L 的HY-101299B 對MGC803 和AGS 細胞的激活作用最佳。CCK 結(jié)果顯示；相對于陰性對照組，si-Ezrin 組胃癌細胞增殖減慢，HY-101299B 組胃癌細胞增殖加快；相對于si-Ezrin 組，si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞增殖加快（均P＜0.05）（圖2A）。平板克隆結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，si-Ezrin 組胃癌細胞克隆數(shù)目減少，HY-101299B 組胃癌細胞克隆數(shù)目增多；相對于si-Ezrin 組，si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞克隆數(shù)目增多（均P＜0.05）（圖2B）。Transwell 結(jié)果顯示：各組胃癌細胞侵襲數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2C）。

2.3 沉默Ezrin對YAP及其下游相關(guān)基因的mRNA與蛋白的表達的影響

qPCR 結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，si-Ezrin組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表達下降，HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表達升高；相對si-Ezrin 組，si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、 Mst、 WW45、Lats1、 Lats2 和TEAD 的 mRNA 水平表達升高（均P＜0.05）（圖3A）。Western blot 結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，si-Ezrin 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表達下降，HY-101299B 組為癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的對蛋白水平表達升高；相對si-Ezrin 組，si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表達升高（均P＜0.05）（圖3B）。

3 討論

在中國，胃癌是最常見的消化道腫瘤，且每年發(fā)病率呈不斷上升趨勢[17]。由于腫瘤本身的侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，給常規(guī)治療帶來了極大的困難，并直接導(dǎo)致了胃癌患者整體的不良預(yù)后和較高病死率[18]。因此，深入研究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機制，對于篩選新的胃癌診斷和治療的靶分子，提高胃癌診療效果具有十分重要的臨床意義。

腫瘤細胞獲得侵襲性、從原發(fā)灶脫離是腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)鍵，這個過程是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 實現(xiàn)的。EMT 是指具有上皮表型的細胞由于極性消失、細胞間連接丟失、細胞骨架重排從而表現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣特征的生理病理學(xué)過程[19]。EMT 與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞特性，如抗衰老和死亡、耐藥、免疫逃避、干細胞特性的獲得與維持、腫瘤相關(guān)性炎癥和免疫抑制等[20]。Ezrin 為細胞骨架連接蛋白，參與細胞黏附、生長、分化等的調(diào)節(jié)[21-22]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員。研究[23]發(fā)現(xiàn)，Ezrin 對主要通過胞內(nèi)E-cadherin 累積的方式，激活的Ezrin 使Ecadherin 在細胞內(nèi)聚集而細胞表面E-cadherin 減少，使得依賴后者形成的細胞與細胞間連接破壞，在腫瘤細胞脫離原發(fā)灶中發(fā)揮作用。研究[24]表明，Ezrin 蛋白高表達時，腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強；反之，其表達水平較低時，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力亦較弱。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin 蛋白在胃癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該結(jié)果表明，Ezrin 是胃癌中的一個明確的癌基因。本研究胃癌細胞中進一步觀察發(fā)現(xiàn)，沉默Ezrin 后胃癌細胞的增殖發(fā)生顯著降低，然而，胃癌細胞的侵襲能力沒有顯著變化，推測在細胞水平沉默Ezrin 不影響胃癌細胞的遷移，可能與胃的特殊酸性環(huán)境相關(guān)。后續(xù)研究將在此方面進一步探討。

Hippo 信號通路是一個高度保守的控制生長的信號通路，在胚胎發(fā)育、組織分化、細胞增殖、凋亡、自噬、耐藥、干細胞形成、轉(zhuǎn)移、EMT 及血管新生等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-27]。大多數(shù)Hippo通路分子組成高度保守，包括Mst、WW45、Mob、Lats、YAP 和TEAD[28]。YAP1 蛋白細胞核高表達預(yù)示胃癌患者預(yù)后較差，并且YAP1 在早期胃癌和腸型胃癌中表達較高，是腸型胃癌患者預(yù)后不良的獨立因素[29-30]。

本研究顯示，將胃癌細胞中的Ezrin 敲低后，胃癌細胞的增殖減慢的同時YAP 及其下游相關(guān)分子（Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD）的表達顯著降低。重新激活YAP 后，沉默Ezrin 導(dǎo)致的增殖抑制作用消失。綜上所述，Ezrin 是胃癌中的致癌因子，且其發(fā)揮作用是通過YAP 信號通路實現(xiàn)的。本研究通過分析了Ezrin 蛋白與YAP 的交互作用在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用、機制和臨床意義，為胃癌靶向治療提供新的靶標，以期進一步提高胃癌的療效。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：單漢國負責(zé)實驗設(shè)計、實驗指導(dǎo)、審核和修改論文，覃一晉負責(zé)文獻查閱、實驗實施及論文撰寫，陳茂良負責(zé)實驗實施、數(shù)據(jù)的收集和統(tǒng)計學(xué)分析，王春云、陽樂彬負責(zé)技術(shù)、材料支持，彭肅負責(zé)指導(dǎo)實驗、審核和修改論文。