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      Ezrin/YAP信號軸促進胃癌細胞增殖的作用研究

      2023-12-28 12:14:24覃一晉單漢國陳茂良彭肅王春云陽樂彬
      中國普通外科雜志 2023年10期
      關(guān)鍵詞:貨號胃癌蛋白

      覃一晉,單漢國,陳茂良,彭肅,王春云,陽樂彬

      (南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 胃腸外科,湖南 衡陽 421001)

      根據(jù)全球癌癥流行病學(xué)的數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計,2020年胃癌在全世界所有癌癥中發(fā)病率排名第五,病死率排名第四。雖然在過去的幾十年中,胃癌的發(fā)病率和病死率已經(jīng)大大下降,但其總體存活率仍然很低[2]。美國胃癌患者的5年生存率為42.9%[3],而中國僅為27.4%[4]。胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)顯著的性別和地域特征[5-6]。男性的胃癌發(fā)病率為女性的兩倍。東亞和東歐的發(fā)病率最高,尤其是在蒙古、日本、韓國和中國[7-8],這可能與地區(qū)腌制食品的飲食習(xí)慣有很大關(guān)系[9-10]。對于胃癌患者來說,轉(zhuǎn)移是最常見的死亡原因,也是成功治療的主要障礙[11]。腫瘤細胞從原發(fā)部位向轉(zhuǎn)移部位的擴散是一個復(fù)雜的多階段過程,可能包括細胞增殖和遷移、基底膜降解、侵襲和黏附[12-13]。目前的臨床方法不能準確預(yù)測哪些患者將發(fā)生轉(zhuǎn)移。為了開發(fā)預(yù)測、診斷和治療胃癌轉(zhuǎn)移的有效新策略,必須確定控制轉(zhuǎn)移的分子機制。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn),埃茲蛋白(Ezrin)在胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌和乳腺癌等多種腫瘤中高表達,且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)[13-15]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員,其基因定位于人類染色體6q25,由585 個氨基酸組成[16]。Ezrin 的一個重要功能就是構(gòu)成細胞表面復(fù)合物而參與細胞-細胞間和細胞-基質(zhì)間的黏附。目前,關(guān)于Ezrin 在胃癌中生長和轉(zhuǎn)移的研究尚不清楚。

      YAP 蛋白又稱為Yes 相關(guān)蛋白,是一種細胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,是Hippo 信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子之一,若Hippo 信號通路失活,未被磷酸化的YAP/TAZ 則轉(zhuǎn)入細胞核,與TEAD 結(jié)合,啟動Mst、WW45、Lats1、Lats2 等靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明,YAP1 蛋白在細胞核高表達預(yù)示胃癌患者預(yù)后較差[7],課題組前期對Ezrin與YAP 在胃癌組織中的表達水平進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)Ezrin 與YAP 在胃癌組織中高表達,兩者表達水平正相關(guān),且都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。因此,在此基礎(chǔ)上,本研究進一步在胃癌細胞中分析Ezrin 蛋白及YAP 通路的關(guān)系及其功能,為胃癌的機制研究提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      人胃癌細胞株MGC803 和AGS 均購自ATCC(美國模式菌種收集中心,USA);常用的細胞培養(yǎng)試劑購自以色列Biological Industries 公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司。YAP 激動劑(HY-101299B) 購自美國MCE 公司。鼠ACTIN (貨號:23660-1-AP)、YAP 抗體(貨號:13584-1-AP) 購自美國Proteintech 公司;兔WW45抗體(貨號:A18667)購自美國Abclona 公司;兔Ezrin (貨號:AF6172)、Mst (貨號:DF13152)、Lats1、Lats2(貨號:DF7517)、TEAD 抗體(貨號:DF3141)購自美國Affinity 公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 細胞培養(yǎng)所有細胞均用10%胎牛血清、10 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染細胞生長于對數(shù)生長期時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞,將細胞按照每孔3×105接種在6 孔板中。常規(guī)培養(yǎng)18 h 后(細胞密度約為70%),按照Lipofectamine 2000 說明書進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染分組為:si-NC(轉(zhuǎn)染si-NC 的陰性對照序列)、si-Ezrin(轉(zhuǎn)染si-Ezrin 序列)。siRNA 由中洪分子實驗室完成,分別為si-Ezrin#1:ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C;si-Ezrin#2:GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A;si-Ezrin#3:TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA。細胞轉(zhuǎn)染24 h 后,收獲細胞提取蛋白或者消化細胞鋪板進行下一步實驗。

      1.2.3 qRT-PCR 檢測收集樣本,加入TRIzol 裂解液,提取總RNA。將RNA 通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 試劑盒合成 cDNA。利用熒光PCR 儀進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下:RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL。反應(yīng)步驟如下:預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40 個循環(huán)。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽) 有限公司合成,Ezrin 正向:ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C,反向:GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A;YAP 正向:TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA,反向:TCA TGC TTA GTC CAC TGT CTG T;Mst 正向:ATC GCG TCC AGG TGC TTT C,反向:GCC CGA TAG ACC TTG CCA A;WW45 正向:ATG CTG TCC CGA AAG AAA ACC,反向:AGG CAT AAG ATT CCG AAG CAG A;Lats1 正向:AAT TTG GGA CGC ATC ATA AAG CC,反向:TCG TCG AGG ATC TTG GTA ACT C;Lats2 正向:ACT TTT CCT GCC ACG ACT TAT TC,反向:GAT GGC TGT TTT AAC CCC TCA;TEAD 正向:ATG GAA AGG ATG AGT GAC TCT GC,反向:TCC CAC ATG GTG GAT AGA TAG C;內(nèi)參GAPDH 正向:GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT,反向:GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG。相對表達量根據(jù)2-ΔΔCt法計算。

      1.2.4 Western blot 檢測用RIPA 試劑盒提取總蛋白,使用BCA protein assay kit 測定蛋白濃度。每個樣品提取40 μg 上樣,采用10%的SDS-PAGE 進行凝膠電泳分離,使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST 溶液室溫封閉后,分別滴加稀釋的一抗Ezrin、YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 4 ℃過夜,添加對應(yīng)的二抗室溫下?lián)u床孵育1 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光法使條帶顯影。在化學(xué)發(fā)光成像儀上進行條帶曝光成像。

      1.2.5 CCK-8 檢測待胃癌細胞生長到對數(shù)生長期,將細胞消化下來,每孔2 000 個細胞鋪于96 孔板中。第2 天去掉舊的培養(yǎng)基,加入100 μL 新的培養(yǎng)基和10 μL CCK-8,培養(yǎng)箱中處理3 h,用酶標儀檢測OD450 處的吸光值。此數(shù)據(jù)記為第1 天的數(shù)據(jù)。剩余96 孔板中的細胞按照分組加入2.5 μmol/L的HY-101299B,繼續(xù)培養(yǎng)2、4 d 后檢測OD450 處的吸光值。

      1.2.6 平板克隆實驗待胃癌細胞生長到對數(shù)生長期,將細胞消化下來,每孔1 000 個細胞鋪于6 孔板中。待到第2 天,去掉舊的培養(yǎng)基,按照分組加入2.5 μmol/L 的HY-101299B,繼續(xù)培養(yǎng)10 d。去掉培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS 清洗2 次,用甲醇固定15 min,PBS 清洗2 次后,用1%結(jié)晶紫染色15 min,吸去結(jié)晶紫,PBS 清洗3 次,平板晾干后拍照。用image J 統(tǒng)計平板克隆的數(shù)目。

      1.2.7 Transwell 檢測去除Transwell 小室孔中的培養(yǎng)基,用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的細胞,加入PBS 清洗5 min,再加入0.1 %結(jié)晶紫靜置染色1 h,PBS清洗3 次,平板晾干后拍照將小室倒置在載玻片上拍照。用image J 統(tǒng)計細胞的數(shù)目。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

      應(yīng)用 GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 法。檢驗水準α=0.05,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 Ezrin沉默效果

      相對于各自的空白對照組,si-Ezrin#1、si-Ezrin#2和si-Ezrin#3 轉(zhuǎn)染后的MGC803 細胞中Ezrin 的mRNA水平下降約33%、28%和18%,蛋白水平分別下降約46%、37%和28%;AGS 細胞中Ezrin 的mRNA 水平下降約36%、31%和25%,蛋白水平分別下降約42%、31% 和24%;各自的陰性對照組Ezrin 的mRNA 與蛋白水平均無明顯變化(均P>0.05)(圖1)。根據(jù)以上結(jié)果,選擇si-Ezrin#3 進行后續(xù)實驗。

      2.2 Ezrin 沉默與YAP 激動劑對胃癌細胞增殖與遷移能力的影響

      預(yù)實驗結(jié)果顯示,2.5 μmol/L 的HY-101299B 對MGC803 和AGS 細胞的激活作用最佳。CCK 結(jié)果顯示;相對于陰性對照組,si-Ezrin 組胃癌細胞增殖減慢,HY-101299B 組胃癌細胞增殖加快;相對于si-Ezrin 組,si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞增殖加快(均P<0.05)(圖2A)。平板克隆結(jié)果顯示,相對于陰性對照組,si-Ezrin 組胃癌細胞克隆數(shù)目減少,HY-101299B 組胃癌細胞克隆數(shù)目增多;相對于si-Ezrin 組,si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞克隆數(shù)目增多(均P<0.05)(圖2B)。Transwell 結(jié)果顯示:各組胃癌細胞侵襲數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2C)。

      2.3 沉默Ezrin對YAP及其下游相關(guān)基因的mRNA與蛋白的表達的影響

      qPCR 結(jié)果顯示,相對于陰性對照組,si-Ezrin組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表達下降,HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表達升高;相對si-Ezrin 組,si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、 Mst、 WW45、Lats1、 Lats2 和TEAD 的 mRNA 水平表達升高(均P<0.05)(圖3A)。Western blot 結(jié)果顯示,相對于陰性對照組,si-Ezrin 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表達下降,HY-101299B 組為癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的對蛋白水平表達升高;相對si-Ezrin 組,si-Ezrin+HY-101299B 組胃癌細胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表達升高(均P<0.05)(圖3B)。

      3 討論

      在中國,胃癌是最常見的消化道腫瘤,且每年發(fā)病率呈不斷上升趨勢[17]。由于腫瘤本身的侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,給常規(guī)治療帶來了極大的困難,并直接導(dǎo)致了胃癌患者整體的不良預(yù)后和較高病死率[18]。因此,深入研究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機制,對于篩選新的胃癌診斷和治療的靶分子,提高胃癌診療效果具有十分重要的臨床意義。

      腫瘤細胞獲得侵襲性、從原發(fā)灶脫離是腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)鍵,這個過程是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 實現(xiàn)的。EMT 是指具有上皮表型的細胞由于極性消失、細胞間連接丟失、細胞骨架重排從而表現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣特征的生理病理學(xué)過程[19]。EMT 與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞特性,如抗衰老和死亡、耐藥、免疫逃避、干細胞特性的獲得與維持、腫瘤相關(guān)性炎癥和免疫抑制等[20]。Ezrin 為細胞骨架連接蛋白,參與細胞黏附、生長、分化等的調(diào)節(jié)[21-22]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員。研究[23]發(fā)現(xiàn),Ezrin 對主要通過胞內(nèi)E-cadherin 累積的方式,激活的Ezrin 使Ecadherin 在細胞內(nèi)聚集而細胞表面E-cadherin 減少,使得依賴后者形成的細胞與細胞間連接破壞,在腫瘤細胞脫離原發(fā)灶中發(fā)揮作用。研究[24]表明,Ezrin 蛋白高表達時,腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強;反之,其表達水平較低時,腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力亦較弱。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),Ezrin 蛋白在胃癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該結(jié)果表明,Ezrin 是胃癌中的一個明確的癌基因。本研究胃癌細胞中進一步觀察發(fā)現(xiàn),沉默Ezrin 后胃癌細胞的增殖發(fā)生顯著降低,然而,胃癌細胞的侵襲能力沒有顯著變化,推測在細胞水平沉默Ezrin 不影響胃癌細胞的遷移,可能與胃的特殊酸性環(huán)境相關(guān)。后續(xù)研究將在此方面進一步探討。

      Hippo 信號通路是一個高度保守的控制生長的信號通路,在胚胎發(fā)育、組織分化、細胞增殖、凋亡、自噬、耐藥、干細胞形成、轉(zhuǎn)移、EMT 及血管新生等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-27]。大多數(shù)Hippo通路分子組成高度保守,包括Mst、WW45、Mob、Lats、YAP 和TEAD[28]。YAP1 蛋白細胞核高表達預(yù)示胃癌患者預(yù)后較差,并且YAP1 在早期胃癌和腸型胃癌中表達較高,是腸型胃癌患者預(yù)后不良的獨立因素[29-30]。

      本研究顯示,將胃癌細胞中的Ezrin 敲低后,胃癌細胞的增殖減慢的同時YAP 及其下游相關(guān)分子(Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD)的表達顯著降低。重新激活YAP 后,沉默Ezrin 導(dǎo)致的增殖抑制作用消失。綜上所述,Ezrin 是胃癌中的致癌因子,且其發(fā)揮作用是通過YAP 信號通路實現(xiàn)的。本研究通過分析了Ezrin 蛋白與YAP 的交互作用在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用、機制和臨床意義,為胃癌靶向治療提供新的靶標,以期進一步提高胃癌的療效。

      利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

      作者貢獻聲明:單漢國負責(zé)實驗設(shè)計、實驗指導(dǎo)、審核和修改論文,覃一晉負責(zé)文獻查閱、實驗實施及論文撰寫,陳茂良負責(zé)實驗實施、數(shù)據(jù)的收集和統(tǒng)計學(xué)分析,王春云、陽樂彬負責(zé)技術(shù)、材料支持,彭肅負責(zé)指導(dǎo)實驗、審核和修改論文。

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