曹旭陽,袁 紅,孫 普,李 坤,楊宇軒,鄧欣雨,焦云娟,白興文,盧曾軍,權(quán)富生

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100 ; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviruses,PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬成員,是無囊膜、共價閉合環(huán)狀的單股DNA病毒,呈二十面體對稱,其直徑約17 nm。PCV是目前已知的能夠在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的最小的DNA病毒之一。目前,已經(jīng)鑒定出4個基因型的PCV,包括 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4。1974年,在豬腎細(xì)胞系(Porcine kidney-15,PK-15)中發(fā)現(xiàn)了引起非細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)污染物,直至1982年,才證實(shí)其是一種病毒,命名為PCV1[1]。然而,目前還沒有PCV1相關(guān)的臨床疾病報(bào)道,因此推測PCV1是非致病的。20世紀(jì)90年代,在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PCV2,最初被鑒定為斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的致病原[2]。此外,PCV2還與豬的多種臨床癥狀有關(guān),統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 (PCV-associated disease,PCVAD),包括豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病。2016年,美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種臨床癥狀為受孕率下降、木乃伊胎和死胎率增加的豬病,通過免疫組化和定量聚合酶鏈反應(yīng)排除了若干病原,包括PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV);隨后宏基因組分析結(jié)果顯示,致病原為一種新的豬圓環(huán)病毒基因組,進(jìn)一步測序表明,病毒基因組由2 000個核苷酸組成,其衣殼蛋白與PCV2衣殼蛋白的氨基酸同源性為26%,因此,將此新的PCV命名為PCV3[3]。2019年,在患有呼吸道疾病和腹瀉的7周齡豬的樣本中檢測到PCV4[4]。PCV3已遍及全球各個國家,引起了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究,其與PCV2較為相似?，F(xiàn)今對PCV2病原學(xué)、流行病學(xué)、預(yù)防和控制等方面的研究較多,也已開發(fā)出較好的診斷產(chǎn)品和疫苗對其進(jìn)行防控。本文從PCV3的病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀、致病機(jī)理、免疫反應(yīng)和診斷方法進(jìn)行總結(jié),為進(jìn)一步深入研究PCV3的致病機(jī)理和開發(fā)預(yù)防性生物制品提供參考。

1 PCV3病原學(xué)

所有PCV具有相似的基因結(jié)構(gòu),均由含2個方向相反的開放閱讀框(Open reading frame,ORF) 的閉合環(huán)狀單股DNA基因組組成。PCV3病毒粒子直徑介于13～25 nm,其基因組大小約2 000 bp,主要由ORF1、ORF2和ORF3組成,ORF1編碼由297個氨基酸(Amino acid,aa)組成的復(fù)制酶(Replicase,Rep)蛋白,基因長度為891 bp;ORF2編碼由214個aa組成的衣殼(Capsid,Cap)蛋白,基因長度為645 bp;ORF3編碼由231個aa組成的功能未知的蛋白,基因長度為693 bp。PCV2病毒粒子直徑介于14～17 nm,其基因組大小為1 767 bp或1 768 bp,ORF2(702 nt或705 nt)編碼Cap蛋白。PCV3與PCV家族其他成員的基因組相似性較低,已有研究表明,PCV3與PCV1、PCV2和PCV4的核苷酸相似性分別約為45.5%、46.8%和43.2%[5]。

Cap蛋白是PCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其所存在的抗原表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),因此,Cap蛋白一直是開展PCV免疫機(jī)理和疫苗研究的主要靶點(diǎn)。序列比對分析顯示,PCV3 Cap蛋白與PCV1、PCV2和PCV4 Cap蛋白的氨基酸相似性分別約為24%、26%～36%和24.5%,表明PCV Cap蛋白的氨基酸相似性較低,故推測不同基因型Cap蛋白交叉保護(hù)性較弱。對PCV Cap蛋白的研究表明,60個Cap蛋白亞單位能夠自我組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP),該VLP與PCV一樣,具有T=1的二十面體對稱結(jié)構(gòu);冷凍電鏡解析結(jié)構(gòu)顯示,與PCV2 VLP相比,PCV3 VLP 的β折疊桶核心區(qū)域(如72～79 aa和109～131 aa)的柔性區(qū)域發(fā)生了顯著變化,表明PCV3 VLP的構(gòu)象靈活性增加;此外,與PCV2 Cap蛋白相比,PCV3 Cap蛋白的N末端部分結(jié)構(gòu)靈活性增強(qiáng)[6]。根據(jù)PCV3 Cap蛋白的第24、27位氨基酸突變分型結(jié)果,PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c三種基因亞型。根據(jù)完整的(ORF1+ORF2)編碼序列,PCV3a可進(jìn)一步分為PCV3a-1、PCV3a-2和1個中間進(jìn)化支PCV3a-IM。對我國多個省份的PCV3研究表明,3種基因亞型PCV3均存在,主要流行的基因亞型為PCV3b[7]。

2 PCV3流行病學(xué)

PCV3與PCV2在流行病學(xué)方面相似,兩者均存在于家豬、野豬、牛、蚊蟲、家蠅、綿羊和嚙齒動物中,傳播途徑包括水平傳播和垂直傳播。

豬是PCV3的天然宿主,但是在其他家養(yǎng)動物和野生動物中也檢測到了PCV3的存在,包括牛、狗、小鼠、羚羊、狍子、野豬、蜱和蚊子等,目前還沒有證據(jù)表明這些物種在PCV3傳播中起作用。據(jù)報(bào)道,麂和狍也可以感染PCV3,但感染率較低[8]。在野生嚙齒動物(如黃頸鼠、林鼠和田鼠)的樣本中未檢測到PCV3,意味著野生嚙齒動物可能沒有在PCV3的傳播中發(fā)揮作用[9]。野豬被懷疑是PCV3的重要宿主之一,因?yàn)榱餍胁W(xué)報(bào)告顯示,野豬群PCV3感染率比一些家養(yǎng)豬群更高。研究發(fā)現(xiàn),蜱中能否檢測到PCV3與該地區(qū)是否存在野豬相關(guān),在野豬存在地區(qū)的蜱中能夠檢測到PCV3,反之則不能夠檢測到,表明野豬可能影響PCV3向蜱的傳播[8,9]。同樣,從PCV3陽性豬場捕獲的蚊子中也能檢測到PCV3,而且蚊子和豬中的PCV3核苷酸序列具有100%的相似性[10]。總體而言,PCV3的流行傳播與家養(yǎng)動物和野生動物之間的關(guān)系比較復(fù)雜,有待進(jìn)一步深入研究。

病豬和隱性感染豬是PCV3的主要傳染源,在患病仔豬或隱性感染豬的腦、腎臟、心臟、脾臟、血清、胸腔積液、腹腔液、口腔液、鼻腔液、糞便和精液等幾乎所有組織和體液中均可檢測到PCV3的DNA。在有癥狀和無癥狀感染小豬的各種組織和器官中的可檢測到PCV3特異性抗原,包括皮膚、肺臟、心臟、腎臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟和小腸[11]。從妊娠后期母豬收集的38份初乳樣品中,有17份(44.74%)檢測結(jié)果為PCV3陽性[12]。這些結(jié)果表明,PCV3可以在豬只中水平傳播,也可以垂直傳播。

PCV3在世界多個國家廣泛流行。2018年,德國豬群的PCV3陽性率為75%,波蘭豬群的PCV3陽性率為86%[13],巴西9個州的PCV3陽性率為47.8%[14]。2006—2017年,從泰國26個養(yǎng)豬場獲得樣本的PCV3陽性率為36.70%[15]。2018年,韓國農(nóng)場樣本的PCV3陽性率為9.8%[16]。2016年,日本收集的豬群組織樣本中PCV3陽性率為9.6%[17]。隨后在意大利、瑞典、丹麥、俄羅斯和塞爾維亞等國家相繼檢測到PCV3的流行。1993—2007年,對瑞典采集的病料進(jìn)行PCV3檢測,結(jié)果顯示,陽性率超過20%,且陽性樣本最早可追溯至1993年[18]。西班牙的流行病學(xué)研究顯示,早在1996年就存在PCV3感染[19]。

2016年,我國首次報(bào)道在廣東省豬群中發(fā)現(xiàn)PCV3的感染[20]。2018年,對我國中部14個地區(qū)的豬場進(jìn)行PCV3檢測,結(jié)果顯示,豬場陽性率為48.78%,豬只陽性率為31.18%[21]。2017年,我國東部11個地區(qū)豬場的樣本檢測結(jié)果顯示,PCV3陽性率為34.7%[22]。2018年,我國華南地區(qū)的樣品檢測結(jié)果顯示,PCV3豬場陽性率為48.78%,豬只陽性率為31.18%[23]。2017—2019年,對吉林地區(qū)10家規(guī)?；B(yǎng)殖場收集的704份樣品進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果顯示,PCV2陽性率為42.0%,PCV3陽性率為34.2%,PCV2和PCV3混合感染率為22.7%[24]。2017—2019年,對廣西地區(qū)482個規(guī)?；B(yǎng)殖場收集的917份樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,PCV3在廣西12個地區(qū)存在不同程度的流行,且具有逐年上升的趨勢[25]。鄭州地區(qū)PCV3的流行病學(xué)調(diào)查顯示,2017—2019年該地區(qū)豬場PCV3總陽性率為14.6%,呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,其中2019年陽性率最高(19.5%)[26]。1990—1999年,對我國29個省份的病料進(jìn)行回顧性檢測發(fā)現(xiàn),9個省PCV3檢出率為6.5%,最早可以追溯到1996年[27]。以上結(jié)果表明,PCV3在國內(nèi)廣泛流行,給疫病防控帶來巨大挑戰(zhàn)。

3 PCV3臨床癥狀

PCV3感染與多種臨床癥狀相關(guān)。目前的研究發(fā)現(xiàn),PCV3可導(dǎo)致多種疾病和綜合征,其臨床癥狀和PCV2相似。

3.1 生殖障礙和PDNS 研究表明,PCV3感染母豬會出現(xiàn)厭食癥、PDNS樣皮膚病變和母豬繁殖障礙(包括流產(chǎn)、木乃伊胎和死胎率增加以及受孕率下降),且死亡率增加,嚴(yán)重病變主要表現(xiàn)為多灶性丘疹、斑疹和淺表性皮炎,與PCV2感染所表現(xiàn)的PDNS沒有區(qū)別[3]。在美國哥倫比亞某農(nóng)場,分娩前的小母豬被確診為PCV3陽性,其血清病毒滴度為7.4×103copies/μL,小母豬分娩時出現(xiàn)難產(chǎn),產(chǎn)下1只木乃伊胎和10只小豬,其中2只小豬出現(xiàn)圍產(chǎn)期死亡[28]。被PCV3感染的新生仔豬病例也表現(xiàn)如先前文獻(xiàn)所報(bào)道母豬病例的癥狀,如間質(zhì)性肺炎、腸系膜淋巴結(jié)出現(xiàn)淋巴樣物質(zhì)缺乏和肉芽腫性淋巴結(jié)炎[3]。

3.2 多系統(tǒng)炎癥綜合征 在PCV3相關(guān)研究中,最常見的臨床癥狀是多系統(tǒng)炎癥。美國首次報(bào)道的PCV3病例表現(xiàn)多系統(tǒng)炎癥,包括淋巴漿細(xì)胞性心肌炎、間質(zhì)性肺炎和急性支氣管炎,但該炎癥與PCV3臨床表現(xiàn)的相關(guān)性仍不清楚。這些臨床癥狀是非特異性的,組織學(xué)評估顯示,多系統(tǒng)炎癥在圍產(chǎn)期和斷奶仔豬中是一致的[29]。病毒檢測證實(shí)了多系統(tǒng)血管炎存在于心臟、脾臟、腎臟和肝臟等的小血管內(nèi)膜和中膜上,病毒感染在心肌炎中的作用已得到證實(shí)[30]。這些是否是PCV3發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)尚不清楚,因此,有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究,以了解PCV3感染的完整發(fā)病機(jī)制和臨床相關(guān)性,以及是否因合并感染而加劇臨床表現(xiàn)或易于引起繼發(fā)感染。

3.3 亞臨床感染和混合感染 回顧性研究表明,PCV3的亞臨床感染發(fā)生于所有年齡豬群,而且在未表現(xiàn)臨床癥狀的豬只組織器官中也可檢測到PCV3。除了在表現(xiàn)亞臨床癥狀的母豬血清中檢測到PCV3特異性抗體之外[31],在隱性感染豬的口腔液中也檢測到了PCV3[5]。PCV3和多種豬病病原體混合感染病例被普遍報(bào)道,包括PCV2、PRRSV、PPV、豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬三角冠狀病毒 (Porcine delta coronavirus,PDCoV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。在美國[32]、中國[33]、韓國[34]和歐洲[35],PCV2和PCV3的混合感染率介于1.26%～70.00%。在韓國[16]、中國[36,37]和泰國[15],PRRSV和PCV3的混合感染率介于0.67%～61.54%。我國東北地區(qū)PCV3與PPV2、PPV6和PPV7的混合感染率分別為8.6%、20.0%和24.8%[38]。在我國,PCV3與豬細(xì)環(huán)病毒1型(Torque teno suis virus 1,TTSuV1)、TTSuV2以及TTSuV1和TTSuV2混合感染率分別為83.3%、71.2%和50.0%[39]。盡管目前已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道了PCV3與其他病原體混合感染的情況,但是沒有關(guān)于PCV3作為主要病原體或者非主要病原體的作用和由于混合感染導(dǎo)致病毒復(fù)制增加的信息,所有的研究僅停留在檢測層面上。因此,建立和開發(fā)混合感染模型,有利于對引發(fā)臨床疾病所需的輔助因子或者誘發(fā)因子進(jìn)行深入的研究。

3.4 病毒血癥 通過對病毒的檢測發(fā)現(xiàn),在病毒被完全清除之前,病毒血癥會持續(xù)很長時間。對西班牙4個養(yǎng)殖場進(jìn)行定期評估發(fā)現(xiàn),病毒血癥是間歇性的,其在整個生產(chǎn)周期中的陽性率介于6.5%～25.0%,表明存在PCV3長期持續(xù)感染的可能性[19]。有研究表明,母豬的PCV3載量與胎次有關(guān),第2胎病毒載量明顯高于第4胎,可能是由于整個生產(chǎn)周期中多次接觸PCV3建立了免疫;在公豬中也發(fā)現(xiàn),年輕公豬的病毒載量較高,其中小于12月齡公豬的病毒載量明顯高于年老公豬[40]。

不同研究中所檢測的PCV3基因拷貝數(shù)有所不同,一般在攻毒后3～21 d達(dá)到最大濃度,研究一致表明至少在攻毒后28 d方可檢測到持續(xù)的病毒血癥,在42 d之后仍然可以檢測到病毒血癥[41],與PCV2病毒血癥的結(jié)果一致[42]。

4 PCV3致病機(jī)理

PCV3進(jìn)入細(xì)胞的具體機(jī)制和相關(guān)受體仍然未知。在PCV3自然感染母豬的流產(chǎn)胎和木乃伊胎中,在心肌細(xì)胞、心臟和腎臟動脈的平滑肌細(xì)胞以及胎盤的滋養(yǎng)層中均檢測到了PCV3的復(fù)制[29]。同樣,在患有多系統(tǒng)炎癥的斷奶豬和育肥豬的心臟和腎臟動脈的平滑肌細(xì)胞中均檢測到了PCV3 的復(fù)制[43]。此外,在育肥豬皮下脂肪細(xì)胞、大腦白質(zhì)和灰質(zhì)的小動脈平滑肌和室管膜細(xì)胞中也檢測到PCV3[44]。在接種PCV3的6周齡豬中,除腎小管上皮細(xì)胞和腎臟中動脈的中膜外,心肌細(xì)胞和心臟動脈的中膜中也檢測到了PCV3的復(fù)制,且通過免疫組化得到了證實(shí)[44]。此外,接種PCV3的 5周齡豬的相關(guān)研究表明,PCV3在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)性心肌炎和皮質(zhì)間質(zhì)性腎炎相關(guān)的淋巴細(xì)胞、脾臟的白色髓質(zhì)、小腸道集合淋巴結(jié)和腸漿膜炎癥灶相關(guān)的淋巴細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[41]。4～8周齡無特定病原體豬的心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和肝竇以及氣管支氣管、腸系膜和腹股溝淋巴結(jié)的皮質(zhì)和髓質(zhì)巨噬細(xì)胞呈PCV3抗體陽性反應(yīng)[11]。庫旭鋼等[45]用PCV3陽性病料初始勻漿液和細(xì)胞培養(yǎng)物感染斷奶仔豬后發(fā)現(xiàn),PCV3主要感染扁桃體和淋巴結(jié)等免疫器官,脾臟、肺臟和扁桃體等組織中的病毒載量最高?？傊?研究表明PCV3具有廣泛的細(xì)胞嗜性,這些細(xì)胞可能存在某種促進(jìn)PCV3進(jìn)入和復(fù)制的共同受體。

盡管與受體和病毒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制相關(guān)的信息有限,但推測PCV3和 PCV2的機(jī)制不同。在PK-15細(xì)胞中證明,PCV3進(jìn)入細(xì)胞主要通過網(wǎng)格蛋白和動力蛋白-2介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,且病毒復(fù)制依賴于Rab5和Rab7,其介導(dǎo)早期和晚期核內(nèi)體運(yùn)輸,并影響酸性細(xì)胞質(zhì)環(huán)境[46]。此外,核仁定位信號(Nucleolar localization signal,NoLS)和核仁磷蛋白1(Nucleophosmin 1,NPM1)相互作用促進(jìn)了核定位。Cap蛋白氨基酸殘基第1～38位直接與NPM1相互作用[47]。在NPM1的N末端寡聚化結(jié)構(gòu)域中,第48位絲氨酸的電荷性質(zhì)對于Cap與NPM1相互作用和亞細(xì)胞定位至關(guān)重要[48]。同時,NPM1上調(diào)可促進(jìn)PCV3復(fù)制[47]。PCV3感染的復(fù)雜機(jī)制已經(jīng)逐漸被揭開,然而對PCV3致病機(jī)制的進(jìn)一步研究取決于穩(wěn)定的細(xì)胞系,該細(xì)胞系應(yīng)能夠持續(xù)支持PCV3的復(fù)制和病毒的分離。

5 PCV3免疫反應(yīng)

5.1 先天性免疫應(yīng)答 先天免疫反應(yīng)是由宿主通過模式識別受體和病毒DNA特有的病原體相關(guān)分子模式識別病毒,誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。體外研究結(jié)果表明,PCV3 Cap蛋白可通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)激活促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α以及NF-κB信號通路[49]。在體內(nèi)模型中評估先天免疫反應(yīng)證明,類似于PCV2感染,PCV3感染對IL-8具有調(diào)節(jié)作用[41]。IL-10和大多數(shù)促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-4)在PCV2發(fā)病中是必需的,但是否影響PCV3感染仍需進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。Temeeyasen等[41]的研究結(jié)果表明,促炎細(xì)胞因子對PCV3感染是沒有影響的,但Jing等[50]的研究結(jié)果與之相反,PCV3感染仔豬的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)量顯著上調(diào)。因此,需要進(jìn)一步的研究來闡明PCV3感染期間宿主識別以及干擾素和趨化因子產(chǎn)生的分子機(jī)制。

5.2 體液免疫應(yīng)答 目前,對PCV3體液免疫反應(yīng)的研究主要是檢測PCV3誘導(dǎo)的抗體的存在,對PCV3感染期間抗體的保護(hù)作用或者動力學(xué)水平的研究較少。Deng等[51]對我國豬場2015—2017年收集的豬血清進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,PCV3陽性率從22.35% (2015年)上升到51.88% (2017年)。研究表明,豬PCV3陽性抗體率和病毒血癥呈正相關(guān)[31]。多個農(nóng)場的研究結(jié)果顯示,6周齡以上豬只PCV3陽性率的檢測是有變化的,到24周齡時陽性動物的數(shù)量明顯增加,可能是由于母源抗體可以保護(hù)年幼的動物,但是隨著年齡的增加,母源抗體水平下降,陽性動物的比例增加[19]。Stadejek等[52]的研究結(jié)果也表明,在3～4周齡豬只中未檢測到病毒血癥?？傊?這些研究結(jié)果表明,PCV3具有與PCV2類似的母源抗體動態(tài),豬群母源免疫大約在6～10周齡消失,隨后在后期保育和早期生長階段,PCV3感染動物的比例增加。需要更多研究來證實(shí)PCV3母源抗體的存在和活性及其在群體感染動力學(xué)中的潛在作用。

5.3 細(xì)胞免疫應(yīng)答 PCV3感染細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)目前仍不太清楚。用PCV3感染性物質(zhì)結(jié)合鑰孔血藍(lán)素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH) 接種5周齡豬只,未產(chǎn)生合適的細(xì)胞反應(yīng),因此,在T細(xì)胞亞群中未觀察到差異,包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD4-CD8+high)、輔助性T細(xì)胞(CD4+CD8-)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)和記憶性T細(xì)胞(CD4+CD8+low)[41]。Jiang等[11]的研究結(jié)果顯示,PCV3感染結(jié)合植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)抑制了外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖,導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖減少[11]。類似的結(jié)果在PCV2感染中也可觀察到,其中,PBMC對超抗原或促有絲分裂劑的反應(yīng)較低或無反應(yīng)。Arruda等[29]所進(jìn)行的PCV3感染組織評估結(jié)果顯示,大部分淋巴細(xì)胞內(nèi)流與T細(xì)胞群相關(guān),表明T細(xì)胞群的不平衡發(fā)生在受感染的組織中,并不會轉(zhuǎn)化成系統(tǒng)性變化。

6 PCV3診斷方法

6.1 直接檢測方法 目前,已經(jīng)開發(fā)了幾種PCV3的PCR診斷分析方法,包括TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR(TaqMan-based real-time PCR)、SYBR Green 實(shí)時熒光定量PCR(SYBR green-based real-time qPCR) 和直接PCR,均可檢測到最低含量為102拷貝數(shù)以下的病毒[53]。Zou等[54]研究開發(fā)的液滴數(shù)字PCR可以檢測到1個拷貝數(shù)的PCV3病毒含量。重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinant polymerase amplification,RPA)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)與qPCR的靈敏度相當(dāng)[55]。最近有研究使用等溫?cái)U(kuò)增原理結(jié)合指示染料甲酚紅和酚紅,可以進(jìn)行視覺比色以檢測PCV3[56]。

由于PCV3存在與豬的其他病毒共感染的情況,現(xiàn)已開發(fā)出幾種可以同時檢測PCV3與多種豬病病毒的多重qPCR方法,且具有與單重qPCR相當(dāng)?shù)撵`敏度。Chen等[57]開發(fā)的四重qPCR可以同時檢測PCV1、PCV2、PCV3和PCV4,靈敏度與單重qPCR相當(dāng)。吳江等[58]建立的基于TaqMan探針的雙重qPCR檢測方法可用于PCV2和PCV3的檢測,具有很好的特異性和敏感性。Liu等[59]開發(fā)的液滴數(shù)字雙重PCR可用于PCV2和PCV3的檢測,檢測限分別為2拷貝/μL和1拷貝/μL。還有研究利用RNAScope平臺開發(fā)檢測方法,用探針靶向PCV3ORF1 mRNA序列進(jìn)行檢測[29,41]。

6.2 間接檢測方法 為了檢測PCV3的特異性抗體,現(xiàn)已開發(fā)了多種ELISA檢測方法。目前,大多數(shù)ELISA檢測方法是基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)去除N末端的核定位序列的截短肽,將其作為包被抗原[44]。王俊偉等[60]建立的基于PCV3-Cap蛋白的間接ELISA檢測方法具有很好的特異性,與PCV2、CSFV、PRV和PRRSV均無交叉反應(yīng)?，F(xiàn)有的ELISA檢測方法都是針對PCV3 IgG開發(fā)的,而Mora-Díaz等[44]開發(fā)了基于PCV3 IgM的ELSIA檢測方法。

7 總結(jié)和展望

本文就當(dāng)前PCV3病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀、致病機(jī)理、免疫反應(yīng)和診斷方法6個方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。目前,對PCV3研究的不足之處主要包括:(1)病毒在亞臨床感染中的作用;(2)持續(xù)病毒血癥和病毒在環(huán)境中永久存在的作用;(3)病毒在共感染中的作用;(4)病毒引發(fā)的不同的臨床表現(xiàn)。這些都是未來需要重點(diǎn)關(guān)注和研究的內(nèi)容。

PCV3對養(yǎng)豬業(yè)有嚴(yán)重影響,目前其致病機(jī)理和傳播機(jī)制尚不太清楚,防治技術(shù)也不完善,需要畜牧獸醫(yī)技術(shù)人員的不斷努力,對病毒進(jìn)行全方位研究,攻克該病毒的傳播和清除問題,以保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。