王立新 馬步芳 張培培 姚尚辰 寧保明 常艷

摘要：目的 對四烯類抗真菌抗生素的效價(jià)含量測定方法進(jìn)行改進(jìn)，提高方法的可靠性與可操作性。方法 管碟法。改進(jìn)培養(yǎng)基pH 6.0～6.2；pH 6.0磷酸鹽緩沖液；檢定菌為啤酒酵母菌（ATCC9763）；培養(yǎng)溫度為30℃±2℃；培養(yǎng)時(shí)間為（20±2） h；抗生素濃度范圍為10～50 U/mL；可信限率（FL%）為不得大于5%。結(jié)果 抑菌圈大小符合規(guī)定，邊緣清晰可以使用儀器進(jìn)行測量；制霉菌素、制霉素分別在9.45～56.34 U/mL和8.43～50.23 U/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程分別為y=0.08854x+1.31343（R2= 0.99978）和y=0.10454x+1.28875（R2=0.99843）；重現(xiàn)性與重復(fù)性好[日內(nèi)精密度分別為1.95%（n=6）和1.95%（n=6），日間精密度分別為1.83%（n=12）和1.84%（n=12）]。結(jié)論 改進(jìn)方法可以作為四烯類抗真菌抗生素及其制劑的常規(guī)質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：四烯類抗真菌抗生素；抗生素微生物檢定法；效價(jià)測定；制霉菌素；制霉素；不確定度

中圖分類號：R917 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Improvement of microbiological potency measurement of tetraenes

antifungal antibiotics

Wang Lixin， Ma Bufang， Zhang Peipei， Yao Shangchen， Ning Baoming and Chang Yan

（National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629）

Abstract ? ?Objective A potency determination method for tetraene antifungal antibiotics was established to improve the reliability and operability of existing methods. Methods The cylinder plate method with medium （pH 6.0～6.2） and pH 6.0 phosphate buffer was used. The test organism was Saccharomyces cerevisiae （ATCC 9763）. Incubation lasted 18～22 hours at the temperature 30℃ ±2℃. The range of test dilution concentration was 10 to 50 U/mL. The fiducial limit （FL%） was not more than 5%. Results The size of circular area （zone） of growth inhibition around the cylinder was moderate and the brim of ones was clear， which can be determined by the measuring instrument. The linearity was achieved over the range of 9.45～56.34 U/mL （y=0.08854x+1.31343， R2=0.99978） and 8.43～50.23 U/mL （y=0.10454x+1.28875， R2=0.99843） for nystatin and nysfungin， respectively. The reproducibility and recovery were acceptable. For nystatin and nysfungin， the relative standard deviation （RSD） of intra-day repeatability was 1.95% （n=6） and 1.95% （n=6） and the RSD of inter-day repeatability was 1.83% （n=12） and 1.84% （n=12）， respectively. Conclusion The method has the potential to become the routine quality control method for tetraenes antifungal antibiotics.

Key words Tetraenes antifungal antibiotics; Microbiological assay of antibiotics; Potency determination; Nystatin; Nysfungin; Uncertainty

多烯類抗生素由于結(jié)構(gòu)中含有一系列共軛雙鍵使其具有抗真菌活性，按其中共軛雙鍵可以分為四烯、五烯、六烯和七烯類化合物，臨床常用藥物包括，四烯類：制霉菌素、制霉素；七烯類兩性霉素B等[1]。

制霉菌素（nystatin）在1950年被Hazen和Brown從土壤微生物Streptomyces noursei的培養(yǎng)物中分離獲得[2]，該品種被國際藥典（IntP）、歐洲藥典（EP）、英國藥典（BP）、美國藥典（USP）和日本藥典（JP）所收載，在各國藥典中定義該品種為多組分抗生素[3-7]，其主要組分為制霉菌素A1（圖1）[3-6]，組分限度規(guī)定：制霉菌素A1不得低于85.0%，其他任一組分不得大于4.0%[4-6]。

制霉素（nysfungin）是從廣東土壤中分離的鏈霉菌Norse actinomycetes的培養(yǎng)物中分離獲得[8-9]，該品種為中國特有品種，執(zhí)行部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS1-C2-0025-89）。制霉素為多組分抗生素，但其在組分構(gòu)成上與制霉菌素存在明顯差異，其主要組分為制霉菌素A1（2.12%～15.56%）、制霉菌素 A3（27.22%～53.52%）、多真菌素B（19.13%～39.83%）[10]（圖1）和其他成分[11]，目前標(biāo)準(zhǔn)中尚未對各組分的含量限度進(jìn)行規(guī)定。

目前，各國藥典[3-7]和部頒標(biāo)準(zhǔn)中均采用抗生素微生物檢定法（管碟法）測定四烯類抗真菌抗生素的效價(jià)含量。但在實(shí)際檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有各標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件均存在相同的問題：抑菌圈邊緣模糊不清，無法使用抑菌圈測量儀進(jìn)行測量，嚴(yán)重影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了改善現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中遇到的主要問題，本研究在現(xiàn)有試驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，對試驗(yàn)菌選擇、菌懸液制備、培養(yǎng)基配方、雙碟制備方式、菌碟的培養(yǎng)溫度和時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，建立了針對四烯類抗真菌抗生素效價(jià)含量測定的改進(jìn)方法。

1 儀器與試藥

1.1 材料與試劑

制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)品（批號130375-201802，效價(jià)含量5900 U/mg）、制霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號130344-201703，效價(jià)含量5581 U/mg）由中國食品藥品檢定研究院提供；制霉菌素原料（批號4011010）由羅馬尼亞Antibiotice S.A公司提供；制霉素原料（批號01-060-151128）由浙江震元制藥有限公司提供。

色譜純乙腈購自美國Fisher公司；分析純N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉和醋酸銨購自北京化學(xué)試劑公司；現(xiàn)有方法所用培養(yǎng)基按EP中F號培養(yǎng)基配方自制（pH 6.0～6.2）、改進(jìn)培養(yǎng)基、滅菌緩沖液（pH 6.0）均由中國食品藥品檢定研究院提供；自制培養(yǎng)基中各配方購自三藥技術(shù)開發(fā)公司；啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ATCC 9763和ATCC2601購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心。

1.2 儀器

Waters e2695液相色譜儀、Waters 2998 Photodiode Array Detector、Empower工作站（美國waters公司）；CHB-1抗生素效價(jià)測量儀（北京超聲技術(shù)發(fā)展公司）；GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 效價(jià)測定方法

照抗生素微生物檢定法（中國藥典2020年版四部通則1201）測定[12]?，F(xiàn)有方法中高、低劑量分別為28和14 U/mL，培養(yǎng)溫度為30℃±2℃，培養(yǎng)時(shí)間為（20±2） h；改進(jìn)方法中高、低劑量分別為50和25 U/mL，培養(yǎng)溫度為30℃±2℃，培養(yǎng)時(shí)間為（20±2） h。培養(yǎng)基、滅菌緩沖液、試驗(yàn)菌均見“儀器與試藥”。

2.2 HPLC分析方法[4-6]

色譜柱：CAPCELL PAK C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；梯度洗脫（表1）；流動相A：乙腈：0.05 mol/L（3.85 g/L）醋酸銨（29：71， V/V），流動相B：乙腈：0.05 mol/L（3.85 g/L）醋酸銨（60：40， V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：305 nm; 進(jìn)樣量：20 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 現(xiàn)有效價(jià)測定方法實(shí)驗(yàn)條件的比較（表2）

制霉素在研發(fā)之初曾一度被認(rèn)為是“國產(chǎn)制霉菌素”，因此，部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS1-C2-0025-89）中的質(zhì)控項(xiàng)目和實(shí)驗(yàn)條件等與當(dāng)時(shí)的USP基本保持一致。故將制霉菌素和制霉素現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載的效價(jià)測定實(shí)驗(yàn)條件一并比較（表2）。各標(biāo)準(zhǔn)中，相同點(diǎn)：起始母液濃度和溶劑、培養(yǎng)基配方、緩沖液基本一致；不同點(diǎn)：在試驗(yàn)菌、是否為單菌層、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、最終點(diǎn)樣溶液的濃度范圍上存在較大差異。

由于四烯類（制霉菌素和制霉素）和七烯類（兩性霉素B）同屬多烯類抗真菌抗生素，基于本實(shí)驗(yàn)室早期對兩性霉素B的研究基礎(chǔ)[13]，結(jié)合現(xiàn)有試驗(yàn)中遇到的抑菌圈邊緣模糊的主要問題，本研究選擇試驗(yàn)菌、菌懸液制備、培養(yǎng)基配方、雙碟中是否增加底層、菌碟的培養(yǎng)溫度和時(shí)間等作為優(yōu)化對象，對改進(jìn)方法中的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行逐一確定。

3.2 試驗(yàn)菌的選擇

目前各標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的四烯類抗真菌抗生素（制霉菌素和制霉素）效價(jià)測定用試驗(yàn)菌分為兩個不同的種屬，分別為假絲酵母屬熱帶假絲酵母種[4-5]和酵母屬釀酒酵母種[3-7]，其中釀酒酵母種為各標(biāo)準(zhǔn)中的通用菌，但在具體應(yīng)用上存在差異，其中：IntP 9th[3]、EP10.0[4]、BP2022[5]和JP17[7]采用Saccharomyces cerevisiae菌種，具體標(biāo)準(zhǔn)菌株（NCYC 87、CIP 1432-83、ATCC9763）分別向英國NCYC（National Collection of Yeast Cultures， AFRC Food Research Institute， Colney Lane， Norwich NR4 7UA， England）、法國CIP（Collection of the Institute Pasteur， Rue du Dr. Roux， Paris 15， France）和美國ATCC（American Type Culture Collection， 10801 University Boulevard， Manassas， Virginia 20110-2209， USA）菌種保藏機(jī)構(gòu)進(jìn)行溯源；USP2021[6]和部頒（WS1-C2-0025-89）采用Saccharomyces kudriavzevii菌種，具體標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC2601）向美國ATCC進(jìn)行溯源。從標(biāo)準(zhǔn)菌株溯源角度，國內(nèi)ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株最為易得。根據(jù)ATCC官方網(wǎng)站提供的資料顯示：ATCC9763的染色體組型為多倍體，且較ATCC2601的使用范圍廣，ATCC2601僅用于制霉菌素和兩性霉素B的效價(jià)測定，而ATCC 9763除用于制霉菌素和兩性霉素B的含量測定外，還用于茴香霉素（anisomycin）、殺假絲菌素（candicidin）、納他霉素（natamycin）等品種的含量測定。通過試驗(yàn)，在現(xiàn)有條件下ATCC2601和ATCC9763形成的抑菌圈情況并無明顯差異，邊緣均模糊不清無法使用抑菌圈測量儀進(jìn)行測量。根據(jù)菌株易得性和本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，最終選擇ATCC9763開展后續(xù)研究。

3.3 培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基為檢定菌提供生長所需的營養(yǎng)，因此在抗生素微生物檢定法中選用的培養(yǎng)基的成分應(yīng)包含檢定菌生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）在生長過程中需要充足的碳源及氮源，而最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和蛋白胨[15]?；诒緦?shí)驗(yàn)室早期對兩性霉素B的研究基礎(chǔ)[13]，選擇培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、氯化鈉10 g、瓊脂約13 g，加水至1000 mL，調(diào)滅菌后pH值為6.0～6.2。采用2種不同培養(yǎng)模式：20 mL底層加5 mL菌層和無底層僅15 mL單菌層，在相同溫度和時(shí)間下對ATCC 9763進(jìn)行培養(yǎng)，比較菌株在不同培養(yǎng)模式下的生長狀態(tài)，ATCC9763在雙層條件下的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于單菌層，故選擇20 mL底層加5 mL菌層的方式制備雙碟開展后續(xù)研究。在應(yīng)用該改進(jìn)培養(yǎng)基時(shí)需注意，因該配方中葡萄糖含量較高，如配制后反復(fù)加熱融化或多次高壓滅菌，培養(yǎng)基的顏色會隨加熱或高壓次數(shù)的增加而明顯變深，從淺土黃色變至深褐色，可能是其中糖在高溫條件下轉(zhuǎn)化為醛所致，而ATCC 9763在顏色變深的培養(yǎng)基中，即便在20 mL底層加5 mL菌層的培養(yǎng)模式下，生長速度和狀態(tài)都會明顯受到抑制。因此，在使用該改進(jìn)培養(yǎng)基時(shí)需臨用現(xiàn)制。

3.4 菌懸液的制備

在管碟法中需要使用一定濃度的菌懸液來制備菌層，菌懸液的質(zhì)量與抑菌圈的邊緣清晰度直接相關(guān)[14]。各國藥典中均對啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌懸液的制備作出規(guī)定[3-5，7，12]，但在具體要求間存在較大差異（表3），主要差異點(diǎn)：培養(yǎng)溫度、時(shí)間，制備菌懸液的溶劑以及菌懸液是否可以儲存使用。為了改善現(xiàn)有抑菌圈邊緣模糊的現(xiàn)象，對上述因素進(jìn)行逐一考察。根據(jù)ATCC官網(wǎng)信息，ATCC 9763在30 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。故本研究中選擇不同溫度（27℃±2℃、30℃±2℃、35℃±2℃）和時(shí)間[（24±2） h、（48±2） h、（72±2） h]條件下對ATCC9763在斜面培養(yǎng)物上的生長狀態(tài)進(jìn)行觀察，并采用不同溶劑（滅菌水和生理鹽水）制備菌懸液，分別在菌懸液制備后的第0、1、3、7、14天按“3.3”中確定的改進(jìn)培養(yǎng)基制備雙碟觀察抑菌圈邊緣的清晰情況。通過試驗(yàn)觀察，在30℃±2℃培養(yǎng)（48±2） h的斜面培養(yǎng)物ATCC9763的菌落形態(tài)最為理想，呈現(xiàn)奶油色、光滑扁平并散發(fā)出濃郁的啤酒香氣；不同溶劑制備的菌懸液所形成的抑菌圈形態(tài)并無明顯差別；但隨菌懸液放置時(shí)間的延長抑菌圈邊緣明顯出現(xiàn)模糊的現(xiàn)象，其中由新制菌懸液（放置0 d）獲得的抑菌圈邊緣最為清晰，可以滿足儀器測量需求。最終確定：將ATCC9763接種于沙氏或YPD斜面上，在30℃±2℃培養(yǎng)（48±2） h，用滅菌水或生理鹽水將菌苔洗下置含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻（應(yīng)避免劇烈震蕩），該菌懸液需臨用現(xiàn)制，當(dāng)天使用。此外，雖然均使用臨用現(xiàn)制的菌懸液，但制霉素形成的抑菌圈邊緣仍較制霉菌素形成的抑菌圈邊緣模糊，有時(shí)甚至出現(xiàn)“雙圈”現(xiàn)象，這正是由于制霉素和制霉菌素在組分構(gòu)成上存在差異所致（圖2）。當(dāng)待測抗生素由多個組分構(gòu)成時(shí)，不同組分可能具有不同的MIC值，各組分形成的抑菌圈直徑可能存在差異，各組分共同作用時(shí)可能形成多個抑菌圈疊加的現(xiàn)象，致使該多組分抗生素所形成的抑菌圈邊緣模糊呈現(xiàn)“雙圈”現(xiàn)象，此時(shí)更應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)菌傳代和菌懸液的制備操作[14]。

3.5 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的選擇

按前述“3.2”至“3.4”確定的改進(jìn)試驗(yàn)條件制備雙碟，選擇不同溫度（30℃±2℃、35℃±2℃）和時(shí)間[（17±2） h、（20±2） h、（46±2） h]條件下培養(yǎng)，對菌層生長、抑菌圈形成過程和鋼管內(nèi)剩余抗生素溶液的量進(jìn)行觀察。通過試驗(yàn)觀察，在30℃±2℃培養(yǎng)（20±2） h的菌層生長和抑菌圈形成情況最為理想，可以直接使用抑菌圈測量儀進(jìn)行測定，且在培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)各鋼管內(nèi)均有剩余抗生素溶液。35℃±2℃溫度條件下菌層的生長較30℃±2℃受到抑制，這與啤酒酵母菌（saccharomyces cerevisiae）自身的生長特性相關(guān)。雙碟培養(yǎng)（17±2） h時(shí)菌層中試驗(yàn)菌呈現(xiàn)的整體狀態(tài)略薄、顏色較培養(yǎng)（20±2） h明顯偏淺，由于ATCC 9763呈現(xiàn)奶油色，菌層顏色偏淺時(shí)和培養(yǎng)基的顏色較為接近，不利于儀器測量時(shí)對抑菌圈邊緣的判斷；雙碟培養(yǎng)（46±2） h時(shí)菌層狀態(tài)最優(yōu)，但菌圈邊緣較培養(yǎng)（20±2） h明顯出現(xiàn)模糊的現(xiàn)象，這可能由于各鋼管中的抗生素溶液在培養(yǎng)24 h后逐漸耗盡所致。根據(jù)抑菌圈形成的原理：培養(yǎng)基中的試驗(yàn)菌開始生長與鋼管中的抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散同時(shí)發(fā)生，當(dāng)培養(yǎng)到某一時(shí)間段，培養(yǎng)基中的兩種互動作用達(dá)到動態(tài)平衡，培養(yǎng)基中形成透明的抑菌圈，在抑菌圈邊緣處抗生素的濃度恰好等于此抗生素對于該試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度[14]。如果當(dāng)鋼管中的抗生素溶液耗盡后繼續(xù)培養(yǎng)，隨著時(shí)間的不斷延長，已形成的抑菌圈邊緣處的動態(tài)平衡將被打破，邊緣外的菌將逐漸向圈內(nèi)生長或抑菌圈內(nèi)原本受到抑制的試驗(yàn)菌隨抗生素濃度的不斷下降將逐漸恢復(fù)生長，最終呈現(xiàn)出邊緣模糊的現(xiàn)象。故最終確定培養(yǎng)溫度和時(shí)間分別為30℃±2℃和（20±2） h。

3.6 對改進(jìn)方法的驗(yàn)證

按中國藥典2020年版四部通則指導(dǎo)9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對改進(jìn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[12]。

3.6.1 線性與范圍

取制霉菌素和制霉素標(biāo)準(zhǔn)品（130375-201802批和130344-201703批，效價(jià)含量5900 U/mg和5581 U/mg），分別精密稱定19.1和18.0 mg，各置于100 mL容量瓶中，加入N，N－二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋制成約1000 U/mL的母液，再分別精密量取制霉菌素和制霉素母液適量，以pH6.0磷酸鹽緩沖液為稀釋劑，采用0.8作為劑間比進(jìn)行9點(diǎn)等比稀釋，并確保各溶液中DMF的含量均為5%（V/V），即：制霉菌素各溶液濃度分別為56.34、45.08、36.06、28.85、23.08、18.46、14.77、11.82和9.45 U/mL；制霉素各溶液濃度分別為50.23、40.18、32.15、25.72、20.57、16.46、13.17、10.53和8.43 U/mL。采用改進(jìn)培養(yǎng)基，按抗生素微生物檢定法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得制霉菌素和制霉素回歸方程分別為y=0.08854x+1.31343（R2=0.99978）和y=0.10454x+1.28875（R2=0.99843），即在9.45～56.34 U/mL、8.43～50.23 U/mL的濃度范圍內(nèi)，制霉菌素、制霉素各自濃度的對數(shù)劑量和抑菌圈半徑的平方值呈直線關(guān)系。綜上，確定四烯類抗真菌抗生素效價(jià)測定的濃度范圍為10～50 U/mL。

3.6.2 精密度

對同一批樣品的效價(jià)含量進(jìn)行測定，制霉菌素和制霉素日內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.95%（n=6）和1.95%（n=6），制霉菌素和制霉素日間的RSD為1.83%（n=12）和1.84%（n=12）。

3.6.3 準(zhǔn)確度

對現(xiàn)有方法與改進(jìn)方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較。采用所間協(xié)作方式分別對同一批制霉菌素和制霉素樣品進(jìn)行效價(jià)測定，采用測量結(jié)果的不確定度（即測量的分散性）作為準(zhǔn)確度的評價(jià)指標(biāo)，即在兩種方法測定結(jié)果間無顯著性差異時(shí)，測量結(jié)果的不確定度越小則結(jié)果的準(zhǔn)確度越高，其中：制霉菌素以JP17中二劑量作為現(xiàn)有方法，由3個協(xié)作單位采用現(xiàn)有方法測得34組結(jié)果；另外4個協(xié)作單位采用改進(jìn)方法測得51組結(jié)果；制霉素以部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS1-C2-0025-89）中二劑量作為現(xiàn)有方法，由5個協(xié)作單位采用現(xiàn)有方法測得60組結(jié)果；另外5個協(xié)作單位采用改進(jìn)方法測得60組結(jié)果。測定結(jié)果及其不確定度詳見表4～5。利用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)對由現(xiàn)有方法和改進(jìn)方法獲得的測定結(jié)果間的差異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，制霉菌素和制霉素的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別為P=0.608>0.05和P=0.097>0.05，即2種方法獲得的制霉菌素和制霉素測量結(jié)果間均無顯著性差異。但現(xiàn)有方法結(jié)果的不確定度約是改進(jìn)方法的3～4倍。根據(jù)不確定度評定中的1/3原則，即某一分量的不確定度數(shù)值小于最大分量不確定度數(shù)值的1/3時(shí)，該分量對總不確定度的貢獻(xiàn)可以忽略不計(jì)的原則[16]，由此可以認(rèn)為改進(jìn)方法測定結(jié)果的分散程度小于現(xiàn)有方法測定結(jié)果的分散程度，即改進(jìn)方法可以明顯提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

3.6.4 可信限率（FL%）

分別計(jì)算出采用現(xiàn)有方法與改進(jìn)方法測定結(jié)果FL%的平均值（表6），可見改進(jìn)方法的可信限率更低。因此，將改進(jìn)方法中的可信限率要求由現(xiàn)有方法中的7%下調(diào)為“不得大于5%”。

4 結(jié)論

本研究以現(xiàn)有試驗(yàn)中遇到的抑菌圈邊緣模糊的主要問題為出發(fā)點(diǎn)，從試驗(yàn)菌選擇、菌懸液制備、培養(yǎng)基配方、雙碟制備方式、各關(guān)鍵環(huán)節(jié)的培養(yǎng)條件等幾個方面入手對現(xiàn)有測定方法進(jìn)行了改進(jìn)。改進(jìn)方法中形成的抑菌圈邊緣清晰可以使用抑菌圈測量儀進(jìn)行測量，可以大大提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，證明了改進(jìn)方法的可靠性，該方法可以作為四烯類抗真菌抗生素（制霉菌素和制霉素）原料及其制劑的常規(guī)質(zhì)量控制方法。目前，該方法已作為常規(guī)標(biāo)定方法在制霉素國家標(biāo)準(zhǔn)品的換批標(biāo)定工作中使用。

參 考 文 獻(xiàn)

Gallis H A， Drew R H， Pickard W W. Amphotericin B： 30 year of clinical experience[J]. Rer Infect Dis， 1990， 12（2）： 308-329.

Hazen E L， Brown R. Two antifungal agents produced by a soil actinomycete[J]. Science， 1950， 112（2911）： 423.

World Health Organization. The International Pharmacopoeia[S/OL]. （9th Ed）. Geneva， WHO Press， 2019. http：//www.internetpip.com.

The European Pharmacopoeia Commission. The European Pharmacopoeia[S]. （10.0th Ed）. Strasbourg： Council of Europe， 2020： 3401-3402.

The British Pharmacopoeia Commission. The British Pharmacopoeia[S/OL]. （2022）. London， The Stationary Office， 2022. http：//www.internetpip.com.

The United States Pharmacopoeia Commission Inc. The United States Pharmacopeia[S]. （2021）. Rockville， Md： the United States Pharmacopeia Convention， Inc， 2021. http：//www.internetpip.com.

The Ministry of Health， Labour and Welfare. The Japanese pharmacopoeia[S]. （17th Ed）. Tokyo： Society of Japanese Pharmacopoeia， 2011： 1328.

蔡潤生， 吳淑云， 沈麗君， 等. 制霉菌素A-94的研究[J]. 科學(xué)通報(bào)， 1959， （23）： 795-796.

蔡潤生， 包琴珠， 吳淑云， 等. 從中國南方土壤分離的3種放線菌產(chǎn)生的多烯類抗菌素[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1960， 8（1）： 47.

汪素巖， 王健， 孟錚. 制霉素中制霉素A1、A3和多真菌素B含量比例的研究[J]. 中國藥事， 1996， 10（1）： 41.

孫勝男， 冷霄云， 李怡然， 等. 制霉素中未知成分的結(jié)構(gòu)鑒定及UHPLC法含量測定[J]. 藥物分析雜志， 2021， 41（8）： 1375-1380.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版四部）. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020： 480-483.

常艷， 胡昌勤. 兩性霉素B效價(jià)測定方法的改進(jìn)[J]. 中國抗生素雜志， 2013， 38（6）： 434-438.

張治錟.《抗生素藥品檢驗(yàn)》[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1987： 12-18.

周羽中， 張四槐， 譚周進(jìn)， 等. 釀酒酵母菌培養(yǎng)條件的研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2011， 11（23）： 4465-4467.

中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會， 化學(xué)分析中不確定度的評價(jià)指南[S]. 北京： 中國計(jì)量出版社， 2006： 149.