摘要：【目的】建立檉柳再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系并分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳樹突觸融合蛋白（TcSYP121）基因功能，為篩選檉 柳分子抗性育種候選基因及鹽堿土的改良和生態(tài)修復(fù)提供理論參考?！痉椒ā客ㄟ^單因素篩選最佳外植體、消毒處理、 各階段（初代、分化、增殖和生根）的培養(yǎng)基類型及激素濃度建立檉柳再生體系；通過正交試驗(yàn)分析影響轉(zhuǎn)化體系的4 個(gè)因素（預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和農(nóng)桿菌濃度）；通過PCR擴(kuò)增及電泳結(jié)果驗(yàn)證檉柳轉(zhuǎn)化體系；瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因獲得過表達(dá)植株（OE）和病毒誘導(dǎo)的基因沉默植株（VI），進(jìn)行表型觀測、植物超氧陰離子染色液（NBT）和二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）染色并測定鹽腺直徑和鹽腺密度、葉綠素含量、超氧化物酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性及TcSYP12l基因相對表達(dá)量，分析TcSYP121基因的功能。【結(jié)果】最優(yōu)外植體為檉柳嫩莖段，最適宜次氯酸鈉（NaClO）消毒濃度為5%，最佳消毒時(shí)間為5min，最適合的初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，最佳分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA，最佳生根培養(yǎng)基是1/2 MS+0.5 mg/LIBA。轉(zhuǎn)化體系中正交試驗(yàn)結(jié)果為最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是2d，最佳侵染時(shí)間是5min，最佳共培養(yǎng)時(shí)間是2d，最佳 農(nóng)桿菌濃度ODm為0.8，抗生素頭孢霉素（Cef）濃度為300 mg/L，卡那霉素（Kan）篩選壓為30 mg/L。PCR擴(kuò)增及電泳結(jié)果顯示，利用該遺傳轉(zhuǎn)化體系可獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因檉柳的耐鹽功能分析結(jié)果顯示，在 鹽脅迫下，VI和對照（CK）檉柳中葉綠素含量顯著下降（Plt;0.05），而OE下降不顯著（Pgt;0.05）；OE檉柳SOD和POD活性 均高于VI與CK，且OE中TcSYPI2I基因的相對表達(dá)量高于CK和VI?！窘Y(jié)論】建立了檉柳的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過對檉柳進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化獲得過表達(dá)和沉默表達(dá)檉柳，證實(shí)TcSYPI21基因能夠提高檉柳耐鹽性。

關(guān)鍵詞：檉柳；轉(zhuǎn)化體系；再生體系；TcSYP121基因；瞬時(shí)轉(zhuǎn)化；耐鹽

中圖分類號：S793.5；S722.36

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-1191（2024）03-0823-11

Establishment of a system for regeneration and transformation of Tamarix chinensis Lour. and functional analysis on transienttransformation of TcSYP121 gene

HAN Shuai， JIN Qian-qian， YIN Nan， ZHANG Guo-jun， XU Xing-xing\"

（College of Horticultural Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology/Hebei Key Laboratory of Characteristic Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization/Hebei University Research and Development Center of Characteristic Horticultural Plant Biological Breeding Application Technology，Qinhuangdao， Hebei 066600， China）

Abstract： 【Objective】 To establish a regeneration system and genetic transformation system of Tamarix chinensis Lour. and analyze the function of transiently transformed T. chinensis syntaxin （TeSYP121） gene， in order to provide theo- retical re-ferences for the screening of candidate genes of T. chinensis molecular resistance breeding and the improvement and ecological restoration of saline and alkaline soil. 【Method] T. chinensis regeneration system was established by uni-variate analysis of the selection of explants， disinfection treatment， medium type and hormone combination concentration at each stage （primary， differentiation， proliferation and rooting）; four factors affecting the transformation system （preculture time， infestation time， co-culture time and Agrobacterium concentration） were analyzed by orthogonal test; and the transformation system of T. chinensis was established by the results of PCR amplification electrophoresis. Meanwhile， the transient transformation of TeSYP121 gene obtained overexpression plants （OE） and virus-induced gene silencing plants （VI）， and phenotypic observation， plant superoxide anion dyeing solution （NBT） and diaminobenzidine method （DAB） staining， salt gland diameter and density， chlorophyll content， superoxide dismutase （SOD） activity， peroxidase（POD） activity， and the relative expression of the TeSYP121 gene were determined to analyze the function of TeSYP121 gene. 【Result】The optimal explants were the tender stem segment of T. chinensis， the most suitable disinfection method was 5% sodium hypochlorite （NaC10） ， the best disinfection time was 5min， the most suitable primary medium was MS medium， and the best differentiation medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA. The best rooting medium was 1/2 MS+0.5 mg/L IBA. The results of orthogonal test in the transformation system were the best pre-culture time being 2 d， the optimal infection time being 5 min， the optimal co-culture time being 2 d， the optimal Agrobacterium concentration ODsoo value being 0.8， the antibiotic concentration Cef being 300 mg/L， and kanamycin （Kan） screening pressure was 30 mg/L. PCR amplification electrophoresis results showed that positive transgenic plants could be obtained using this ge- netic transformation system. The results of salt tolerance function analysis of transiently transformed TcSYP121 gene of T.chinensis showed that under salt stress， the chlorophyll content in VI and control （CK） decreased significantly （Plt;0.05）， and the OE decrease was not significant （Pgt;0.05）; OE T. chinensis had a higher level of SOD and POD activities than VI and CK， the relative expression of TcSYP121 gene in OE was higher than that in CK and VI. 【Conclusion】The regenera- tion system and genetic transformation system of T. chinensis were preliminarily established， and overexpressed and silenced T. chinensis were obtained through transient transformation of T. chinensis Lour.， which confirmed that the TeSYP121 gene could improve the salt tolerance of T. chinensis.

Key words： Tamarix chinensis; transformation system; regeneration system; TcSYP121 gene; transient transformation; salt resistance

Foundation items： Hebei Key Research and Development Project （21326346D） ;Science and Technology Research Project of Colleges and Universities of Hebei （ZD2022091）; Hebei Agriculture Research System （HBCT2024200202）

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是限制植物生長發(fā)育、 降低作物產(chǎn)量，甚至危及生態(tài)環(huán)境的主要環(huán)境因子， 已成為全球性的環(huán)境問題，對農(nóng)業(yè)活動和資源可持 續(xù)利用造成嚴(yán)重阻礙（Wu et al.，2021）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中 國鹽漬土總面積約3600萬ha，占全國可投入使用土 地總面積的4.88%，主要分布在華北、東北平原、西 北內(nèi)陸及濱海地區(qū)（楊勁松等，2022）。由于人口增 長、土地過度開發(fā)以及農(nóng)業(yè)耕作中化肥不合理施用 等因素，鹽漬化土壤面積仍呈逐年擴(kuò)大趨勢。因此， 鹽堿地的開發(fā)與利用是我國乃至全世界農(nóng)林業(yè)生產(chǎn) 面臨的重要問題。檉柳（Tamarix chinensis Lour.） 隸屬于檉柳科（Tamariaceae）檉柳屬（Tamarix）的落 葉灌木或小喬木，是耐鹽樹種，能在含鹽量4.4%水 培環(huán)境中（海水全鹽含量3.5%）存活且正常生長 （Duan et al.，2022），具有抗?jié)衬芰?，能夠在水淹環(huán)境 中存活；可抵抗一定的低溫環(huán)境，適應(yīng)性極強(qiáng)，能在 較極端的環(huán)境中生長（Ye et al.，2020），是濱海重鹽 堿地生態(tài)景觀綠化的優(yōu)良材料，也常被用作生長 在土壤環(huán)境極度惡劣的生物改良物種（Maet al.， 2009）。因此，開展建立檉柳再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體 系并通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化分析可調(diào)控囊泡運(yùn)輸離子過程影 響耐鹽性的檉柳突觸融合蛋白（TcSYP121）基因，對篩選檉柳分子抗性育種候選基因及鹽堿土的改良和 生態(tài)修復(fù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著基因 工程的大力發(fā)展，植物耐鹽性研究不僅停留在生理 生化方面，在分子生物學(xué)領(lǐng)域中篩選優(yōu)良耐鹽基因 并提高植物抗逆性成為熱點(diǎn)（李源等，2010）。遺傳 轉(zhuǎn)化是進(jìn)行基因功能驗(yàn)證、明確基因功能最直接的 手段（賀玉花等，2023），而構(gòu)建高效的再生體系是實(shí) 現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，所以檉柳再生體系的建立尤為重要。SYP121是SNARE（Soluble N-ethylmaleimide- sensitive fusion protein attachment protein receptor）家 族中的一員，屬于Qa-SNARE亞家族（Rehman et al.， 2008），在大部分植物中定位于細(xì)胞質(zhì)膜，并參與植 物對生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)（何小文，2018）。 近期的研究證實(shí)，檉柳SYPI2I（TcSYPI21）基因參與 高鹽、低鉀和干旱等各種非生物脅迫的響應(yīng)。熊雪 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)煙草SYP121基因?qū)τ诘外洝⒏啕}、干旱和脫落酸（ABA）均有響應(yīng)，外施ABA后NSYP12I基因的表達(dá)量上升，從而使煙草對干旱的 耐受性增強(qiáng)。瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化體系是指將外源基因?qū)?入靶細(xì)胞內(nèi)，使外源基因在短時(shí)間內(nèi)獲得高水平表 達(dá)或沉默的技術(shù)，因具有見效快、費(fèi)用少、操作簡單 及可批量轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用（吳水涵，2023）。 目前關(guān)于檉柳組織培養(yǎng)的研究以快繁和再生體系為 主，孫旭旭等（2009）、宿炳林（2015）、郭勇（2020）對檉柳不定芽分化培養(yǎng)進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)檉柳分化培養(yǎng)基MS添加不同濃度的6-芐腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）組合效果較好，生根培養(yǎng)基多采用1/2MS。對于轉(zhuǎn)化體系方面，Liu等（2021）研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化ThSOS3基因過表達(dá)能通過增強(qiáng)抗氧化酶活性、提高活性氧清除能力、降低細(xì)胞膜丙二醛（MDA）含量和脂質(zhì)過氧化作用，可增加剛毛檉柳和擬南芥的耐鹽能力。Luo等（2023）研究發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）表達(dá)RmNHX2基因，確定該基因通過維持離子穩(wěn)態(tài)增強(qiáng)植物的耐鹽性。Song等（2023）研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化FtIST1基因過表達(dá)可提高擬南芥的耐鹽性，通過VIGS技術(shù)沉默該基因使苦蕎抗氧化能力下降，耐鹽能力明顯降低。Zhou等（2023）研究發(fā)現(xiàn)WRKY51基因過表達(dá)可增加種子萌芽率、根長、光合速率、瞬時(shí)葉片水分利用效率和葉綠素含量，提高擬南芥的耐鹽性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)檉柳的研究主要集中于組培快繁及抗性研究方面，而關(guān)于檉柳再生與轉(zhuǎn)化體系以及耐鹽分子機(jī)制方面的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究檉柳再生體系各階段的培養(yǎng)基類型和激素組合，探究影響轉(zhuǎn)化體系條件，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因后對表型進(jìn)行觀察，同時(shí)進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）和植物超氧陰離子染色液（NBT）染色以及鹽腺直徑密度、超氧化物酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、葉綠素和基因相對表達(dá)量進(jìn)行測定，建立檉柳再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系并對TcSYP121基因功能進(jìn)行初步驗(yàn)證，為檉柳和其他林木的分子抗性育種候選基因的篩選及鹽堿土改良和生態(tài)修復(fù)提供理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以河北科技師范學(xué)院園藝園林試驗(yàn)站生長健壯的當(dāng)年生檉柳為試驗(yàn)材料。主要試劑：基本培養(yǎng)基MS或1/2 MS購自杭州百思生物技術(shù)有限公司;6-BA和NAA購自上海麥克林試劑有限公司;吲哚丁酸（IBA）購自上海源葉生物科技有限公司;根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium）GV3101購自上海昂羽生物技術(shù)有限公司;過表達(dá)載體 pNC-121-35S和植物VIGS載體pNC-TRV2-GFP購自北京睿博興科生物技術(shù)有限公司;2種載體攜帶卡那霉素抗生素耐性基因，均已連接在農(nóng)桿菌GV3101上；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒和FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司。

1.2檉柳再生體系條件篩選

1.2.1外植體選擇

將經(jīng)過消毒處理的檉柳莖段、葉片和根切至1.5cm，以MS為基本培養(yǎng)基，將外植體接種至不同濃度的6-BA（1.0、1.5和2.0mg/L）和NAA（0.05、0.10和0.50mg/L）培養(yǎng)基，后置于溫度（24±2）℃、光強(qiáng)2000～25001x、光照/黑暗時(shí)間為16h/8h的條件下培養(yǎng)。每處理接種30瓶，每瓶1個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)生長情況。1.2.2消毒方法篩選外植體用肥皂水洗凈表面，流水沖洗1～3h后置于超凈工作臺，用75%酒精晃動浸泡30s，使用不同濃度的次氯酸鈉（NaC1O）（2%、5%和10%）消毒處理1、5和10min，無菌水沖洗4～5次，取出后用無菌濾紙吸干表面水分，剪去接觸液體的外植體斷面，接種在MS培養(yǎng)基上。每瓶接種1個(gè)外植體，每消毒處理接種30瓶，15d后統(tǒng)計(jì)外植體污染率和存活率，計(jì)算公式為：

污染率（%）=（接種后有細(xì)菌或真菌污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

存活率（%）=（接種后正常生長的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

1.2.3初代培養(yǎng)基篩選

將經(jīng)過消毒處理的檉柳莖段切至1.5cm，接種于MS、WPM和1/2MS培養(yǎng) 基上。每瓶接種1個(gè)外植體，每處理接種30瓶。培 養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)生長情況。

1.2.4不定芽分化培養(yǎng)基篩選

將初代培養(yǎng)基中 長勢良好的檉柳莖段切至1.5cm，將莖段接種到含 有不同濃度的6-BA（0.5、1.0和1.5mg/L）和NAA（0.01、0.05和0.10mg/L）MS培養(yǎng)基，每處理接種30 瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30d后觀察 不定芽生長情況，根據(jù)公式計(jì)算誘導(dǎo)率：誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出不定芽數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100。

1.2.5增殖培養(yǎng)基篩選

將分化培養(yǎng)中長勢良好 的不定芽接種至含不同濃度的6-BA（0.5、1.0和1.5mg/L）和NAA（0、0.1和0.5mg/L）MS培養(yǎng)基。每處 理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)不定芽，重復(fù)3次。培養(yǎng) 30d后統(tǒng)計(jì)葉芽數(shù)并根據(jù)公式計(jì)算不定芽增殖率： 增殖率（%）=（增殖外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100。

1.2.6生根培養(yǎng)基篩選

將長勢良好的增殖培養(yǎng) 幼苗接種到不同培養(yǎng)基（MS和1/2MS）和不同濃度的IBA（0.1、0.5和1.0mg/L）中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每處 理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)幼苗，重復(fù)3次。在接種后記錄根生長情況及生根時(shí)間，培養(yǎng)15d后統(tǒng)計(jì)平均根數(shù)和平均根長并計(jì)算生根率：生根率（%）=（生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100。

1.3遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建

1.3.1農(nóng)桿菌活化和菌體的制備

轉(zhuǎn)化前將 TcSYP121基因通過NC克隆技術(shù)連接在過表達(dá)載體 pNC-121-35S上，并轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌在添加了卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）抗生素的LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h，挑取相應(yīng)的單克隆進(jìn)行12h擴(kuò)大培養(yǎng)，取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液于50mLLB液體培養(yǎng)基（加Kan和Rif）中繼續(xù)培養(yǎng)6～10h，待菌液OD600為0.4～0.8時(shí)，收集菌體于已滅菌的50mL離心 管，在室溫下5000r/min離心10min去上清液，用侵 染液[滅菌的含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基加入乙酰丁香酮（AS）和吐溫20]重懸后，調(diào)整OD600為0.4～0.8 用于侵染試驗(yàn)。

1.3.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將檉柳莖段切成約1.0cm小段，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+1.0mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)處理，后在超凈工作 臺中將檉柳莖段放入配好的侵染液進(jìn)行侵染 （28°℃、100r/min），后用滅好菌的濾紙吸干菌液，放 入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA）進(jìn)行共培養(yǎng)，接入篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)30d，將誘導(dǎo)出的 不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。

在試驗(yàn)過程中對預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí) 間和共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，根據(jù)極 差（R）結(jié)果判斷影響因素的主次，確定最優(yōu)組合。并

分別使用不同頭孢霉素（Cef）（0、100、200、300、400

和500mg/L）和Kan（0、10、20、30、40和50mg/L）濃 度確定最適宜的抑菌抗生素和篩選抗生素濃度，每 濃度各15個(gè)重復(fù)。

1.3.3PCR擴(kuò)增鑒定檉柳轉(zhuǎn)化植株

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取轉(zhuǎn)基因再生植株葉片基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物序列為F：5'-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGAACGATCTATTCTCAG-3'，R： 5'-G GTCTCAGCAGACCACAAGTTGCTGCTCGGTAT ACACA-3'。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Tag Mix25.0μL，上、下游引物各2.0μL，DNA模板2.0μL，無菌去離子水19.0μL；擴(kuò)增程序：95°℃預(yù)變性 3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，進(jìn)行35個(gè) 循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYPI21基因檉柳的耐鹽功能分析

1.4.1農(nóng)桿菌活化與菌體準(zhǔn)備

將過表達(dá)載體pNC-121-35S和植物VIGS載體pNC-TRV2-GFP按 照1.3.1制備用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2檉柳的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將檉柳幼苗置于侵染液中，在24℃下200r/min搖床振蕩培養(yǎng)4h后，取出侵 染的檉柳幼苗，置于MS固體培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)24h，將過表達(dá)和VIGS侵染的檉柳各均分成2份，1份用新的MS固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，另1份置于含200mmol/LNaC1的MS固體培養(yǎng)基上脅迫培養(yǎng)，并 和未侵染的檉柳一同培養(yǎng)48h。將上述的檉柳幼苗 葉片收集保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因后檉柳的表型觀測、 生化染色及生理指標(biāo)測定

于1、2、3和7d對瞬時(shí) 轉(zhuǎn)化的檉柳和對照進(jìn)行表型觀測，拍照記錄。并測 定對照和NaC1脅迫條件下的過表達(dá)（OE）、沉默表達(dá)（VI）和對照（CK）檉柳的鹽腺直徑和鹽腺密度（Yuan et al.，2013）。處理48h后收集新鮮植物材料，對對照和NaC1脅迫條件下OE、VI和CK檉柳進(jìn)行DAB和NBT染色（Qin et al.，2017）。測定葉綠素含量，氮藍(lán)四唑光還原法測定SOD活性，愈創(chuàng)木酚比色法測定POD活性（楊晴等，2010）。

1.4.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因后檉柳中相對表達(dá)量檢測

使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提 取對照和NaC1脅迫條件下OE、VI和CK檉柳中總RNA。FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測TeSYP121基因在不同植物材料中的表達(dá)情況，以 a-tubuLin基因作為內(nèi)參引物，引物序列α-tubuLin-F： 5'-CACCCACCGTTGTTCCAG-3'， a-tubuLin-R： 5'-ACCGTCGTCATCTTCACC-3'; C1-31982-F： 5'-CGAGTTTCAGGATTTGAGGGAGA-3'， C1-31982-R： 5'-A AAACTCTCACTCTGTCCGGTAC-3'。實(shí)時(shí)熒光定 量PCR反應(yīng)體系10.0 uL：Beastar SYBR Green qPCR Master Mix 5.0μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，無菌去離子水補(bǔ)足至10.0μL；擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2min；95℃10s，55℃30s，72℃ 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-44a法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 22.0整理分析并進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1檉柳再生體系

2.1.1檉柳再生體系建立過程

通過探究外植體 消毒、最佳外植體的和各階段培養(yǎng)的培養(yǎng)基類型，建 立檉柳的再生體系。建立過程如圖1。

2.1.2最優(yōu)外植體篩選結(jié)果

由表1可知，3種外 植體中在不加激素的MS培養(yǎng)基上處理下均未誘導(dǎo)不定芽，3種外植體誘導(dǎo)率最高的為莖段，均高于同 一培養(yǎng)基下的葉片和根的誘導(dǎo)率，在MS+1.0mg/L6-BA+0.10mg/LNAA誘導(dǎo)率達(dá)最高值為55.6%。故選用莖段作為外植體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3最佳消毒時(shí)間篩選結(jié)果

由表2可知，當(dāng) NaC1O濃度為2%，浸泡時(shí)間為1、5和10min的污染 率分別為31.1%、24.4%和21.1%，污染率較高；當(dāng) NaClO濃度為10%時(shí)，污染率顯著低于同一浸泡時(shí)間下的2%NaC1O（Plt;0.05，下同），但存活率整體上低于同一浸泡時(shí)間下5%NaClO，且植株長勢較差，褐化嚴(yán)重；當(dāng)NaClO濃度為5%、處理5min時(shí)，成活 率達(dá)最高值為91.1%，污染率僅為5.6%。故檉柳莖段的最佳NaClO消毒方法為5%NaC1O浸泡5min。

2.1.4初代培養(yǎng)基篩選結(jié)果由

表3可知，1/2MS 培養(yǎng)基下外植體長勢較快、生根較快，但整體長勢慢 于MS培養(yǎng)基，而WPM培養(yǎng)基植株長勢較慢，且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，MS長勢最好，故作為檉柳最優(yōu)的初代 培養(yǎng)基。

2.1.5不定芽分化培養(yǎng)基篩選結(jié)果

由表4可知， 當(dāng)6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度為0.01 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率只有3.3%，當(dāng)6-BA濃度為1.0mg/L，NAA濃度為0.10mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)峰值（57.8%），且長勢良 好分化較多，故適宜檉柳進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為MS+1.0mg/L6-BA+0.10mg/LNAA。

2.1.6增殖培養(yǎng)基篩選結(jié)果當(dāng)6-BA和IBA濃度

均為0.5mg/L時(shí)，增殖率最低為71.1%，當(dāng)IBA濃度為0.1mg/L時(shí)，6-BA濃度為1.0和1.5mg/L時(shí)增殖 率均為100%，但后者葉芽數(shù)最多，葉片顏色嫩綠、長 勢好（表5）。故最適宜檉柳增殖繼代的培養(yǎng)基配方為MS+1.5mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA。

2.1.7生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

由表6可知，MS 培養(yǎng)基下平均根數(shù)和生根率隨IBA濃度升高而增 加；當(dāng)培養(yǎng)基為1/2MS，IBA濃度為0.5mg/L時(shí)，平 均根數(shù)和生根率均達(dá)到最大值，生根時(shí)間最短為 8d，且根系較粗，主側(cè)根明顯，白色根毛多且明顯。故檉柳生根的培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.5mg/LIBA。

2.2檉柳遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建分析結(jié)果

2.2.1PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

TcSYP121基因的開放閱讀框（ORF）全長657bp，與PNC通用接頭連接后 序列全長為697 bp，對經(jīng)過篩選培養(yǎng)的檉柳提取 DNA，通過PCR擴(kuò)增獲得4株陽性株系（圖2）。表明利用該遺傳轉(zhuǎn)化體系可獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。

2.2.2最佳侵染條件篩選結(jié)果

試驗(yàn)的主次因素 通過R值比較，R值越大表明該因素對指標(biāo)影響越 大。由表7和表8可知，4個(gè)因素影響排序?yàn)椋侯A(yù)培養(yǎng) 時(shí)間=菌液濃度gt;共培養(yǎng)時(shí)間gt;侵染時(shí)間。根據(jù)轉(zhuǎn)化 率峰值13.33%確定轉(zhuǎn)化最佳條件為：預(yù)培養(yǎng)2d、菌液濃度OD66。=0.8、侵染5min、共培養(yǎng)2d。

2.2.3抗生素濃度篩選結(jié)果

由表9可知，莖段誘 導(dǎo)率隨Cef濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，200mg/LCef的濃度誘導(dǎo)率達(dá)到最大值為52.22%，但有少量農(nóng)桿菌存在，而Cef濃度為300mg/L處理 下，誘導(dǎo)率為51.11%，無農(nóng)桿菌存在；在此基礎(chǔ)上， 將其接入含有不同濃度梯度Kan誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，確定Kan的篩選壓。當(dāng)Kan濃度為30 mg/L時(shí)，達(dá)到抑制檉柳誘導(dǎo)效果，故抗生素濃度為300 mg/LCef和30mg/LKan（表10）。

2.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因檉柳耐鹽功能分析結(jié)果

2.3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化TcSYP121基因檉柳的表型觀測、生理指標(biāo)及染色結(jié)果在非脅迫條件（NC）下，7d后CK、VI和OE均正常生長，在鹽脅迫條件（NaCl）下，OE無明顯變化，而CK植株頂端出現(xiàn)小部分枯黃，VI除頂部出現(xiàn)枯黃外，長勢也受到影響，有少量葉片脫落（圖3）。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的檉柳7d內(nèi)鹽腺直徑和 鹽腺密度的變化如圖4所示，在NC處理下，3種表達(dá)檉柳的鹽腺直徑和密度無明顯變化，而在NaC1處理 下，鹽腺直徑和密度有小幅上升。

由DAB和NBT染色結(jié)果（圖5-A和圖5-B）可知，OE的棕色和藍(lán)色均最淺，顯示其體內(nèi)活性氧或其他過氧化物含量較低，即SOD和POD活性較高，NC條件下，OE的SOD和POD活性高于CK和VI，NaC1條件下，3種檉柳中SOD和POD活性較非脅迫均有不同程度的升高，在OE中顯著升高，而在CK和VI檉柳中不顯著（Pgt;0.05，下同）（圖6-A和圖6-B）。與本試驗(yàn)染色結(jié)果一致。NC條件下，OE中葉綠素含量高于CK和VI，NaC1條件下，3種檉柳中葉綠素含量均降低，其中CK和VI中葉綠素含量顯著降低（圖6-C）。

2.2.2TcSYP121基因在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化檉柳中的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖6-D）可知，NC條件下，TcSYP121基因在OE中的相對表達(dá)量為正，即高于CK的相對表達(dá)量，而VI中TcSYPI2I基因相對表達(dá)量為負(fù)值，低于CK；在NaC1條件下，OE中TcSYPI21基因的相對表達(dá)量較CK升高，二者相差近4倍，VI中TcSYPI21基因的相對表達(dá)量低于CK。

3討論

在檉柳組織培養(yǎng)的過程中，通常使用莖段（李利 紅等，2005）和種子（郭楠楠等，2015）等作為外植體獲得無菌苗，然后通過誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽或直接誘導(dǎo)不定芽（劉振林等，2013）兩種途徑建立再生體系。本研究通過探究再生體系建立各階段的最優(yōu)條件，建立直接誘導(dǎo)不定芽的再生體系。外植體消毒是植物組織培養(yǎng)過程中重要環(huán)節(jié)，消毒是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟（胡亞龍等，2023），消毒時(shí)間過長，外植體無法存活；時(shí)間過短，會出現(xiàn)污染導(dǎo)致外植體死亡。本研究中75%NaC1O浸泡5min為最適宜外植體滅消毒方式，替代實(shí)驗(yàn)室禁止使用的升汞消毒法。而外植體選擇是組織培養(yǎng)能否成功建立無菌培養(yǎng)體系的關(guān)鍵（羅芃睿等，2020），本研究發(fā)現(xiàn)莖段為檉柳最適宜外植體。生長素和細(xì)胞分裂素在培養(yǎng)基中的比例決定根和芽的分化情況，當(dāng)生長素濃度高于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)，有利于促進(jìn)根的形成；反之有利于芽的分化與增殖。韓琳娜等（2009）、宿炳林（2015）選用NAA作為研究對象獲得較好生根效果，本研究選用2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基和IBA的組合生根率也達(dá)到100%。劉振林等（2013）、王方琳等（2021）對長穗檉柳和白花檉柳為研究材料獲得愈傷組織，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)愈傷組織不理想，與前人研究結(jié)果不一致，猜測差異原因與檉柳不同品種有關(guān)，有關(guān)檉柳誘導(dǎo)愈傷組織的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

遺傳轉(zhuǎn)化體系受許多因素影響，包括預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等（張潤龍等，2021）。本研究選擇Cef和Kan作為抑菌劑和篩選劑，最終確定30 mg/L Kan和300mg/L Cef時(shí)，能有效地抑制農(nóng)桿菌生長并減少對不定芽分化的抑制。農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的長短因試驗(yàn)材料不同而異，時(shí)間過短導(dǎo)致農(nóng)桿菌不能有效侵染，時(shí)間過長導(dǎo)致菌液侵染到細(xì)胞組織間隙內(nèi)，材料過度污染而死亡。同樣，過短共培養(yǎng)時(shí)間無法充分侵染，過長時(shí)間則會導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度繁殖。菌液濃度過低時(shí)，農(nóng)桿菌不能有效與傷口處接觸，降低轉(zhuǎn)化效率，濃度過高會對外植體產(chǎn)生毒害，并且導(dǎo)致后期無法抑制農(nóng)桿菌的生長。本研究通過正交試驗(yàn)得出預(yù)培養(yǎng)2d，菌液濃度OD6oo=0.8，侵染5min，共培養(yǎng)2d轉(zhuǎn)化率最高。但由于轉(zhuǎn)基因植株的總體轉(zhuǎn)化率較低，后續(xù)研究可通過加大樣本數(shù)量探究提高轉(zhuǎn)化率的方法。

植物SNARE因子在離子運(yùn)輸、植物發(fā)育、脅迫應(yīng)答等生命活動中發(fā)揮重要作用（Tarte et al.，2015），而SYP121參與植物對脅迫影響的反應(yīng)（何曉文，2018），對蘋果、煙草和木薯中SYP121基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在不同植物的根、莖、葉等組織均有表達(dá)，且鹽、干旱脅迫及ABA處理均可誘導(dǎo)該基因表達(dá)（熊雪等，2018），與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)TcSYP121基因的相對表達(dá)量在OE較CK明顯增加，說明TcSYP121基因在檉柳抵御鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。植物在受到鹽堿脅迫下，細(xì)胞內(nèi)會增加對植物造成傷害的活性氧及自由基，植物會通過增加體內(nèi)抗氧化物酶活性清除體內(nèi)積累的活性氧及自由基避免植株受到傷害。本研究中DAB和NBT染色反映活性氧的水平，OE顏色淺，說明活性氧水平低，SOD和POD活性較高，表明TcSYP121基因過表達(dá)可提高檉柳耐鹽性。同時(shí)在鹽脅迫條件下，OE的葉綠素含量下降不明顯，而VI與CK的葉綠素含量明顯降低，進(jìn)一步證明TcSYP121基因能提高檉柳的耐鹽能力。

4結(jié)論

初步建立了檉柳的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系， 通過對檉柳進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化獲得過表達(dá)和沉默表達(dá)檉 柳，證實(shí)TcSYP121基因能提高檉柳耐鹽性。

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（責(zé)任編輯李洪艷）