胡凇茗，麻俊淵,2，宋曉琛，武殿虎，向文迪，楊妍梅，扎西英派*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.甘南州畜牧技術服務中心，甘肅 合作 747000）

近年來我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的結構由傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式為主逐漸向集約化、規(guī)?；a業(yè)化養(yǎng)殖模式為主的方向改變，一定程度上提高了畜禽養(yǎng)殖綜合效益，這離不開飼料的穩(wěn)定供應。但受管理方式等因素的影響，飼料生產、加工、運輸以及儲存等環(huán)節(jié)均難以完全避免霉菌或霉菌毒素混入的情況，導致飼料或飼料原材料霉變，營養(yǎng)價值和適口性下降。目前，可產毒素的霉菌達300多種，其中有30多種產生的毒素可以在自然條件下對人或動物的健康造成影響[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，每個國家每年約有1/4的谷物受到霉菌污染[3]。因此，如何防止畜禽飼料和飼料原材料受到霉菌毒素的污染，成為當前畜牧行業(yè)亟待解決的難題。

在全面禁止使用抗生素作為飼料添加劑的時代背景下，如何在畜禽健康養(yǎng)殖環(huán)節(jié)合理利用中草藥和益生菌等生物制劑受到了廣泛關注。甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）及其提取物均具有多種藥理活性，如抗癌[4]、抑菌[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]和免疫調節(jié)[8]等。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是最早被用作飼料發(fā)酵劑的一類益生菌，它將飼料中的大分子營養(yǎng)物質降解成利于畜禽消化吸收的小分子物質，可以大幅度提高飼料利用率[9]。同時，乳酸菌可通過產生乳酸抑制或殺滅腸道病原菌[10]。目前，對于甘草及乳酸菌聯(lián)合應用于禽類生產的研究報道較少，李帥兵等[11]通過在肉雞生長過程中添加甘草及乳酸菌，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用可顯著提高肉雞的生長性能、屠宰性能和表觀消化率等，且聯(lián)合作用效果明顯優(yōu)于單獨作用效果。本試驗以上述報道為參考，通過在霉變飼料中添加甘草與乳酸菌，探討其對肉雞健康的影響，以期為家禽養(yǎng)殖業(yè)中霉菌毒素的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草浸膏，由甘草根莖經(jīng)水煮取上清、濃縮、干燥和研磨所得。乳酸菌，為成品嗜酸乳桿菌凍干粉，活菌數(shù)約3×1010cfu/kg。發(fā)霉玉米，自然霉變所得，通過高效液相色譜法檢測出其中含有2種霉菌毒素，分別為玉米赤霉烯酮（ZEA）和嘔吐毒素（DON），其中ZEA濃度為（2 090±52.25）μg/kg（國家限定值為≤500 μg/kg），DON濃度（1 331±33.28）μg/kg（國家限定值為≤5 mg/kg）。為防止玉米在試驗期間繼續(xù)霉變，將其置于干燥、通風、陰涼的環(huán)境下妥善儲存。

1.2 試驗主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 全自動生物組織脫水機、生物組織包埋機、粘附載玻片、組織包埋盒、組織切片機、臺式高速冷凍離心機、酶標檢測儀、全自動生化分析儀。

1.2.2 主要試劑 總超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛測試盒、過氧化氫酶測試盒、雞免疫球蛋白G（IgG）ELISA試劑盒、雞免疫球蛋白A（IgA）ELISA試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測定試劑盒、γ-谷氨?；D移酶測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒、肌酐測定試劑盒。

1.3 試驗動物

試驗期42 d，選取150只體重相近且健康狀況一致的32日齡肉雞（已接種疫苗），待其適應1周新環(huán)境后進入正試期。

1.4 試驗設計

將150只肉雞隨機分成5個組，每個組設5個重復，每個重復6只雞：對照組（Con組，30只）、低毒濃度組（Ⅰ組，30只）、中毒濃度組（Ⅱ組，30只）、高毒濃度組（Ⅲ組，30只）和中毒濃度+乳酸菌+甘草浸膏組（Ⅳ組，30只）。Con組：于40日齡開始飼喂基礎玉米飼料；Ⅰ組：于40日齡開始飼喂基礎玉米飼料+25%的霉變玉米；Ⅱ組：于40日齡開始飼喂基礎玉米飼料+50%的霉變玉米；Ⅲ組：于40日齡開始飼喂100%的霉變玉米；Ⅳ組：于40日齡開始飼喂基礎玉米飼料+50%的霉變玉米+0.3%甘草浸膏+3×109cfu/kg乳酸菌（前21 d在基礎日糧中只添加50%的霉變玉米，后21 d在添加50%霉變玉米的基礎上加入乳酸菌和甘草浸膏）。

1.5 試驗方法

1.5.1 肉雞腹瀉率與腹瀉指數(shù)測定 試驗期間每天8∶00—9∶00、13∶00—14∶00和18∶00—19∶00詳細觀察與記錄腹瀉肉雞只數(shù)，并對腹瀉糞便進行評分，當糞便評分≥1分時，認定為發(fā)生腹瀉。評分規(guī)則如表1所示。

表1 腹瀉評分表[12]

1.5.2 血清生化指標測定 肉雞飼養(yǎng)至第43天，于早晨在各試驗組各重復中隨機抽取5只肉雞進行頸動脈放血處死，采集各組肉雞的血液至抗凝管中，室溫靜置15 min后，置于離心機中3 000 r/min離心10 min，獲得血清，-80 ℃下冷凍保存以備用。

嚴格按照相應試劑盒說明書測定肉雞血清中的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-GT）、肌酐（CRE）和尿素氮（UN）含量。

1.5.3 免疫器官指數(shù)測定 于試驗的第43天早晨，在5個試驗組各重復中隨機抽取5只肉雞，提前對需要采樣的肉雞做好體重記錄。在解剖過程中先用溫水將肉雞腹部的羽毛打濕，再迅速剖開腹腔分離出胸腺、肝臟、法氏囊和脾臟，分別使用吸水濾紙將取出的器官表面吸干并稱重，記錄其重量，最后計算免疫器官指數(shù)。

1.5.4 臟器組織病理學觀察 取肉雞的肝、腎、胸腺、法氏囊和脾臟等組織器官，用10%的中性福爾馬林溶液進行固定，24 h后換液繼續(xù)固定3周左右。取大小不超過1 cm3的組織塊，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）等處理后進行蘇木精-伊紅染色（HE）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

對以上所得所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2019進行整理，之后再通過GraphPad Prism 8.0.2軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），計算平均數(shù)±標準誤（Mean±SD），當P＜0.05時，表示差異顯著。

2 試驗結果

2.1 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞腹瀉率與腹瀉指數(shù)的影響

如圖1A所示，在整個試驗期內，各組雞只均有腹瀉發(fā)生。當對照組肉雞發(fā)生腹瀉時，糞便顏色正常，水分較低，并有白色尿酸鹽混合在糞便中。而在其余各組肉雞腹瀉時，所排稀便呈棕褐色、紅褐色或黑色，外觀疑似血便，水分明顯增多。Ⅳ組在未給食甘草與乳酸菌前，糞便外觀與Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組相同，飼料中添加甘草與乳酸菌后，雞只糞便逐漸趨于正常。

圖1 試驗期間肉雞腹瀉情況

圖1 試驗期間肉雞腹瀉情況

試驗期間肉雞的腹瀉率與腹瀉指數(shù)見圖1B—1E。在第1～21天，與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組肉雞的腹瀉率與腹瀉指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），同時Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組互相之間也都具有顯著性差異（P＜0.05）。在第22～42天，當Ⅳ組飼料中加入甘草和乳酸菌后，與Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組相比，其腹瀉率與腹瀉指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.2 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞血清生化指標的影響

血清免疫指標檢測結果（表2）顯示，與Con組相比，Ⅱ組、Ⅲ組肉雞血清中的IgA含量和IgY含量均顯著降低（P＜0.05），Ⅳ組無顯著性變化（P＞0.05）。與Ⅳ組相比，Ⅰ組肉雞血清中的IgA含量和IgY含量沒有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），而Ⅱ組和Ⅲ組則是顯著降低（P＜0.05）。

表2 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞血清免疫指標的影響

如表3所示，與Con組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組血清中的SOD活性顯著降低（P＜0.05），Ⅳ組顯著上升（P＜0.05）。與Ⅲ組相比，Con組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅳ組血清中的MDA含量顯著降低（P＜0.05）。各組之間血清中的CAT含量無顯著性變化（P＞0.05）。

表3 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞血清抗氧化指標的影響

如表4所示，AST和ALT檢測結果顯示，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組均顯著高于Con組（P＜0.05），但Ⅳ組顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）。γ-GT檢測結果顯示，Ⅱ組、Ⅲ組顯著高于Con組、Ⅰ組和Ⅳ組（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅳ組顯著高于Con組（P＜0.05），但Ⅰ組與Ⅳ組之間無顯著性差異（P＞0.05）。UN檢測結果顯示，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組血清中的UN含量顯著低于Con組和Ⅳ組（P＜0.05），但這3組之間并無顯著性差異（P＞0.05），Ⅳ組與Con組相比，UN含量顯著降低（P＜0.05）。CRE檢測結果顯示，與Con組相比，其余各組均顯著降低（P＜0.05），但Ⅳ組顯著高于Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05），Ⅱ組與Ⅰ組和Ⅲ組之間差異不顯著，Ⅲ組與Ⅰ組相比顯著降低（P＜0.05）。

表4 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞血清中肝臟、腎臟生化指標的影響

2.3 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞組織器官指數(shù)的影響

如圖2A所示，與Con組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組肉雞的肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），Ⅳ組無顯著性變化（P＞0.05）。各組肉雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)（圖2B—2D）均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞組織器官指數(shù)的影響

2.4 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞臟器組織形態(tài)的影響

各處理組肉雞肝臟病理損傷見圖3，Con組肝臟細胞排列整齊，結構完整，未發(fā)生明顯的病理學變化。相反，在Ⅰ組、Ⅱ組中，肝細胞出現(xiàn)大面積的水泡變性，同時，在肝細胞內和肝細胞間也有彌散的脂滴出現(xiàn)，由于肝細胞的腫脹、擠壓，導致肝板之間的血竇結構消失，并伴有淤血出現(xiàn)。在Ⅲ組中，除了上述病變外，還出現(xiàn)了局部壞死灶，在壞死灶內，染色較淺，部分肝細胞核出現(xiàn)溶解、碎裂的情況。與3個毒素組相比，Ⅳ組肝臟內除了局部淤血外，并未出現(xiàn)其他明顯的病變。

圖3 肉雞肝臟組織病理損傷觀察（HE染色，100×）

各處理組肉雞腎臟病理損傷見圖4，Con組未觀察到任何明顯的病理學變化。與Con組相比，其余各組腎小管間質內均出現(xiàn)淤血、出血等現(xiàn)象，部分腎小管內皮細胞發(fā)生腫脹，其中Ⅰ組、Ⅳ組病變較輕，Ⅱ組、Ⅲ組病變較重。

圖4 肉雞腎臟組織病理損傷觀察（HE 染色，100×）

各處理組肉雞法氏囊病理損傷見圖5，在Con組和Ⅳ組中，法氏囊組織結構正常，并未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，而在Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中，法氏囊組織結構雖然未發(fā)生明顯改變，但可以觀察到部分囊小結中有輕微出血現(xiàn)象。

圖5 肉雞法氏囊組織病理損傷觀察（HE染色，100×）

各處理組肉雞脾臟病理損傷見圖6，各組肉雞脾臟組織結構完整，并未出現(xiàn)明顯病變。

圖6 肉雞脾臟組織病理損傷觀察（HE染色，100×）

各處理組肉雞胸腺病理損傷見圖7，與Con組相比，其余各組部分胸腺小葉內出現(xiàn)大量紅細胞淤積在皮質與髓質之間，其中Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組病變較為嚴重，Ⅳ組最輕。

圖7 肉雞胸腺組織病理損傷觀察（HE染色，100×）

3 討論

3.1 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞腹瀉的影響

肉雞腹瀉是一種以肉雞排便頻率增加和糞便中水分增多為特點的疾病。由于低齡肉雞消化系統(tǒng)發(fā)育不完善和免疫能力較弱等原因，容易發(fā)生腹瀉，輕則導致生長受阻和營養(yǎng)不良，重則導致脫水而亡。肉雞攝入被霉菌毒素污染的飼料后，易發(fā)生腹瀉。程志斌等[13]在飼料中混入750 μg/kg的ZEA飼喂仔豬21 d后，仔豬腹瀉率大幅升高。有研究顯示，甘草與乳酸菌可以促進腸道有益微生物增殖，抑制沙門氏菌等有害菌的生長，調節(jié)消化道pH值、酶活性和消化吸收功能，由此減少腹瀉發(fā)生率[14-15]。本研究中，肉雞的腹瀉率與腹瀉指數(shù)隨著飼料中霉菌毒素含量的增加而明顯上升，在加入甘草與乳酸菌后，肉雞的腹瀉率及腹瀉指數(shù)顯著降低，表明在霉變飼料中添加甘草與乳酸菌能夠較好地改善霉菌毒素導致的肉雞腹瀉癥狀。

3.2 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞免疫能力及器官的影響

免疫器官作為免疫細胞分化、發(fā)育與成熟的部位，其指數(shù)的升高或降低能夠在極大程度上反映動物體自身的免疫狀況。霉菌毒素對禽類免疫器官的影響，集中體現(xiàn)在胸腺、法氏囊和脾臟等器官中[16]。耿芳芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當雛雞食入含有嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）與黃曲霉毒素B1（Aflatoxin 1，AFB1）的玉米后，其胸腺和法氏囊質量顯著減輕。本研究中，3個毒素組肉雞的脾臟、法氏囊和胸腺指數(shù)雖未發(fā)生顯著性變化，但隨著霉菌毒素濃度的上升，脾臟與胸腺指數(shù)出現(xiàn)了下降趨勢。與此不同的是，宮佳杰[18]研究發(fā)現(xiàn)，270 μg/kg DON作用肉雞36 d后，肉雞脾臟、法氏囊指數(shù)顯著升高，這與本文不同。DON既有免疫刺激作用，又有免疫抑制作用，由于試驗時間較短及投喂方式不同等，最終導致肉雞脾臟指數(shù)與法氏囊指數(shù)顯著升高[19]。本研究中免疫器官指數(shù)差異雖未達到顯著水平，但呈現(xiàn)降低趨勢，可能是因為試驗時間不夠長。有研究表明，霉菌毒素對雞器官指數(shù)的影響與時間長短相關，短時間接觸霉菌毒素會導致雞的免疫器官發(fā)生腫脹，指數(shù)有所升高，隨著時間的延長，雞的免疫器官逐漸萎縮，指數(shù)降低[20]。這提示本試驗中霉菌毒素對肉雞免疫器官的抑制正處于過渡階段，隨著霉菌毒素濃度的升高及試驗時間的延長，最終會導致肉雞免疫器官明顯萎縮和指數(shù)顯著降低。Chen等[21]與Samaha等[22]的研究表明，飼料中加入甘草與乳酸菌能夠促進雛雞免疫器官發(fā)育，顯著提高雞的免疫器官指數(shù)。相同的是，與中毒素組相比，其胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢。

在禽類血清中，IgA與IgY是組成體液免疫的基礎，同樣也是衡量體液免疫的重要指標[23]。據(jù)報道，DON和ZEA均能抑制淋巴細胞對IgG、IgM和IgA的分泌能力，顯著降低動物血清中的免疫球蛋白水平[24-25]。本試驗中，隨著霉菌毒素濃度的增加，中毒素組和高毒素組均顯著降低了肉雞血清中的IgA與IgY含量，這與前人的研究結果基本一致，表明霉菌毒素對肉雞的體液免疫過程具有抑制作用，從而降低肉雞機體免疫能力。有研究顯示，在飼料中添加0.1%的甘草提取物可提升肉雞機體內的抗體滴度，從而增強肉雞體液免疫能力[26]。在有關植物乳桿菌的報道中，同樣發(fā)現(xiàn)其對畜禽體液免疫能力有很好的提升效果[27]。一致的是，與中、高毒素組相比，甘草與乳酸菌組血清中的IgA和IgY含量均有顯著提升，表明甘草與乳酸菌對霉菌毒素導致的肉雞體液免疫抑制作用具有較好的緩解效果。

霉菌毒素能導致禽類免疫系統(tǒng)調節(jié)失衡，引發(fā)慢性損傷[28]。本試驗通過組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，各毒素組肉雞的胸腺均有不同程度的出血，與以往報道結果類似[19]，表明飼喂霉變玉米會對家禽的免疫器官造成損傷，從而對免疫器官指數(shù)及功能造成影響。與3個毒素組相比，甘草與乳酸菌組皮質和髓質內出血較少，僅部分胸腺小葉中有零星紅細胞散在分布。此結果說明，在霉變飼料中添加甘草與乳酸菌可以對霉菌毒素導致的肉雞免疫器官損傷起到一定的保護。

3.3 霉菌毒素作用下飼喂甘草與乳酸菌對肉雞肝臟、腎臟的影響

動物血清中，AST、ALT、γ-GT等含量的高低可以直接反映肝臟受損程度。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA、DON等能夠導致動物血清中AST和ALT的濃度顯著升高[29]。本試驗中，3個毒素組肉雞血清中的AST、ALT和γ-GT濃度均顯著升高，結合肝臟組織切片觀察結果發(fā)現(xiàn)，低、中毒素組大片肝細胞發(fā)生腫脹、脂肪變性和淤血等病變，而高毒素組肝細胞除上述病變外，還有部分發(fā)生壞死。這與李樵鋒等[30]的研究結果基本一致。當中毒素組加入甘草與乳酸菌后，肉雞血清中的AST、ALT和γ-GT含量雖然顯著高于對照組，但同樣顯著低于3個毒素組。從肝臟組織切片結果來看，肉雞肝臟中除了局部淤血外，并未觀察到其他明顯病變。據(jù)報道，甘草對四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝臟損傷具有很好的治療效果，顯著降低了大鼠血清中的AST和ALT含量[31]。這與本文結果類似，表明甘草與乳酸菌對霉菌毒素誘導的肝臟損傷能夠起到一定的保護作用。

在臨床上，尿素氮與肌酐是判斷動物腎臟功能與損傷狀況的主要指標，當腎臟受到損傷時，肌酐和尿素氮含量會有所升高。朱于斌等[32]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在DON與ZEA的共同作用下，肌酐與尿素氮含量顯著升高。本試驗中，各處理組肉雞血清中的尿素氮與肌酐含量顯著降低。結合腎臟組織切片結果來看，除對照組外，各組腎小管間質間均有淤血出現(xiàn)，部分腎小管內皮細胞腫脹，表明腎臟有所損傷，其中高毒素組和中毒素組較為嚴重，低毒素組和甘草與乳酸菌組癥狀較輕。查閱資料發(fā)現(xiàn)，在動物血清中，肌酐與尿素氮含量的升高或降低并不全由腎臟功能決定，如心功能不全、脫水和肌肉肥大等會導致肌酐含量上升，肌肉萎縮和營養(yǎng)不良等則會導致肌酐含量明顯降低；脫水和尿路阻塞等會導致尿素氮含量升高，而肝功能不全和營養(yǎng)不良則會導致尿素氮含量明顯降低。本試驗中尿素氮和肌酐含量之所以顯著降低，可能與霉菌毒素降低了飼料中的營養(yǎng)成分和肝臟受損等有關。王慧容[33]研究發(fā)現(xiàn)，霉菌毒素不僅使肉雞體重下降，而且降低了肉雞體內尿素氮的含量。據(jù)報道，甘草與乳酸菌可以提高肉雞對飼料的營養(yǎng)吸收率[11]。當在中毒素組加入甘草與乳酸菌后，肉雞體內肌酐含量與尿素氮含量雖然顯著低于對照組，但卻顯著高于3個毒素組，此結果正好同本文中所猜測的尿素氮與肌酐含量降低的原因有所呼應，甘草與乳酸菌提高肉雞的生長性能和緩解肝臟損傷后，肉雞體內尿素氮與肌酐含量逐漸回歸正常水平，但它們之間是否具有關聯(lián)性還需進一步驗證。