艾絨的HPLC 指紋圖譜及主要成分含量測(cè)定

★ 姚閩 袁銘銘 吳西 雷景邦 白吉慶（.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 南昌 009；.江西省藥品監(jiān)督管理局 南昌 009；.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西 咸陽(yáng) 7046）

艾葉為菊科蒿屬植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥葉，可溫經(jīng)止血，散寒止痛［1］。艾葉主要含有黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、三萜等成分［2-5］。艾葉具有止血、解熱鎮(zhèn)靜、平喘鎮(zhèn)咳、祛痰、抗凝血、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用［4-6］。艾絨是由艾葉料剔除塵土粗梗、粉碎后，過(guò)篩除葉肉、葉脈和葉梗等粉末得到篩上層艾絨［7］。目前市場(chǎng)上出售的艾絨，多約定俗成采用葉絨比作為艾絨質(zhì)量評(píng)判的一個(gè)要素，市面上的艾絨多數(shù)標(biāo)以比例2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、30∶1，如葉絨比2∶1 表示將2 kg 艾葉制備得到1 kg 的艾絨，即艾絨在加工過(guò)程中篩掉的雜質(zhì)越多，得到的艾絨量越低，艾絨的純度就越高，質(zhì)量越好。目前，主要對(duì)其揮發(fā)性成分、粉碎度、燃燒值以及氮元素進(jìn)行研究［8-12］，而對(duì)其非揮發(fā)性成分黃酮類和酚酸類成分未進(jìn)行研究。基于此，通過(guò)HPLC 構(gòu)建艾絨的指紋圖譜，并對(duì)23 批不同艾絨樣品中7 個(gè)指標(biāo)成分（黃酮類和酚酸類）進(jìn)行含量測(cè)定，為艾絨的等級(jí)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Agilent 1260 型HPLC 儀，ME204TE 型XSE-205 型電子天平，HH-6 型六孔數(shù)顯恒溫水浴鍋，DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)。

1.2 主要藥品與試劑

隱綠原酸（批號(hào)CFN99117，純度99.0%）、異綠原酸B（批號(hào)CFN99119，純度99.2%）、異綠原酸A（批號(hào)CFN99118，純度99.5%）、異綠原酸C（批號(hào)CFN99120，純度98.5%）、宗矢車菊素（批號(hào)CFN90386，純度99.5%）、異澤蘭黃素（批號(hào)CFN99117，純度99.2%）均購(gòu)于上海洽姆儀器科技有限公司；綠原酸（批號(hào)110753-202018，純度96.1%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

本研究所有樣品均由江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院萬(wàn)林春鑒定為植物艾的干燥葉。參考艾絨制備工藝流程，采用DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)將各批次艾葉粉碎，將粉碎的艾葉過(guò)篩，過(guò)篩后剩余艾絨制成不同葉絨比的艾絨飲片，具體艾絨信息見表1。

表1 23批不同葉絨比等級(jí)的艾絨信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品的制備 精密稱取艾絨0.5 g，置于具塞錐形瓶，加入50 mL 80%甲醇，首次稱重，采用加熱回流法回流1 h，放冷，再次稱重，采用80%甲醇補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾。

2.1.2 混合對(duì)照品的制備 精密稱取綠原酸、異綠原酸A、隱綠原酸、異澤蘭黃素、異綠原酸B、宗矢車菊素、異綠原酸C 7 個(gè)成分對(duì)照品，加80%甲醇制成含綠原酸對(duì)照品濃度為0.022 2 mg/mL、異綠原酸A 對(duì)照品濃度為0.008 3 mg/mL、隱綠原酸對(duì)照品濃度為0.014 6 mg/mL、異澤蘭黃素對(duì)照品濃度為0.035 6 mg/mL、異綠原酸B 對(duì)照品濃度為0.034 7 mg/mL、宗矢車菊素對(duì)照品濃度為0.008 0 mg/mL 和異綠原酸C 對(duì)照品濃度為0.020 4 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 空白溶液 以80%甲醇溶液作為空白溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18MG Ⅱ S5（4.6 mm×250 mm, 5 μm），洗脫溶液：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），條件（0～12 min，13%A；12～15 min，13%→21%A；15～40 min，21%A；40～60 min，21%→70%A）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.3 專屬性考察

精密吸取按“2.1”項(xiàng)下所制備的空白、供試品、混合對(duì)照品等溶液，并采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行檢測(cè)。各成分的分離度良好（理論塔板數(shù)按綠原酸色譜峰計(jì)不低于5 000），空白溶液對(duì)待測(cè)成分均無(wú)干擾，表明專屬性較好。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 方法學(xué)考察 精密稱取艾絨樣品（編號(hào)AR-1）0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，以異綠原酸C（9號(hào)峰）為參照峰，測(cè)得12 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%（n=6），表明精密度較好。取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1）的供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按照“2.2”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，12 個(gè)峰與上述指標(biāo)的RSD均小于2.0%（n=6），表明在室溫下，該樣品放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。稱取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1）6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品，利用“2.2”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，RSD均小于2.0%（n=6），表明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.2 HPLC 指紋圖譜的構(gòu)建和相似度評(píng)價(jià) 從23 批艾絨中分別稱取0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)。將23 批艾絨圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 年版），以S12圖譜為參照，采用中位數(shù)法自動(dòng)匹配，生成并對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。同時(shí)，確認(rèn)對(duì)照指紋圖譜色譜峰，確定12 個(gè)共有峰，并以9 號(hào)色譜峰（異綠原酸C）作為參照峰，比對(duì)對(duì)照品的保留時(shí)間和色譜峰，指認(rèn)了其中7 個(gè)共有峰，為綠原酸（2 號(hào)峰）、隱綠原酸（3 號(hào)峰）、異綠原酸B（6 號(hào)峰）、異綠原酸A（8 號(hào)峰）、異綠原酸C（9 號(hào)峰）、宗矢車菊素（11 號(hào)峰）和異澤蘭黃素（12 號(hào)峰）。各圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度為0.885～0.998，可見23 批艾絨具有較高相似度。23 批艾絨對(duì)照與疊加指紋圖譜、相似度評(píng)價(jià)見圖2、表2。

圖2 23批艾絨的對(duì)照與疊加指紋圖譜

表2 23批艾絨指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

2.5 7 個(gè)成分的含量測(cè)定

2.5.1 線性范圍考察 取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，以7 個(gè)成分的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，各成分具有較好的線性關(guān)系。見表3。

表3 艾絨中7個(gè)成分方法學(xué)考察參數(shù)

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取艾絨樣品（編號(hào)AR-1）0.5 g，按 “2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果7 種成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.33%、0.42%、0.17%、0.51%、0.36%、0.62%、0.25%，說(shuō)明檢測(cè)儀器的精密度較好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1）6 份，每份0.5 g，分別按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，然后按照“2.2”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，記錄7 個(gè)成分的峰面積，并計(jì)算含量（外標(biāo)法）。結(jié)果7 種成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.52%、1.03%、0.42%、0.37%、0. 28%、0.72%、0.41%，均小于2%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1），按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備后在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)。7 個(gè)成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.62%、0.89%、0.43%、0.37%、0. 29%、0.74%、0.46%，均小于2%，表明該艾絨樣品在室溫下24 h之內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的艾絨樣品（編號(hào)AR-1）0.25 g，各6 份，按已知量的100%分別加入相對(duì)應(yīng)的混合對(duì)照品溶液含綠原酸（0.011 1 mg/mL）、隱綠原酸（0.004 2 mg/mL）、異綠原酸B（0.007 3 mg/mL）、異綠原酸A（0.017 8 mg/mL）、異綠原酸C（0.017 4 mg/mL）、宗矢車菊素（0.004 mg/mL）、異澤蘭黃素（0.010 2 mg/mL）50 mL，按 “2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率。見表4。

表4 艾絨中綠原酸等7個(gè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5.6 艾絨樣品中7 個(gè)主要黃酮類和酚酸類成分的含量測(cè)定 取23 批艾絨樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，計(jì)算艾絨樣品中7 個(gè)成分的含量（外標(biāo)法）。見表5。

表5 艾絨中7個(gè)成分的含量測(cè)定（n=3） mg/g

3 討論

3.1 樣品提取方法的優(yōu)化

采用30%、50%、80%、100%甲醇以及乙醇、水提取艾絨，發(fā)現(xiàn)采用80%甲醇提取時(shí)，各個(gè)色譜峰的分離度較好，化合物信息量最多。因此，選擇80%甲醇提取艾絨樣品。分別考察超聲提取和回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者色譜峰峰面積有較大差別，超聲提取法的峰面積明顯小于回流提取法，7 個(gè)主成分的含量更高，故本研究選擇回流提取法提取艾絨樣品?？疾焯崛悠窌r(shí)間（30、60、90 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶200 g/mL）對(duì)色譜峰影響，研究選擇60 min，1∶100 g/mL 提取。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

考察3 種流動(dòng)相體系（乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水），采用乙腈-0.1%磷酸溶液洗脫分離度較好，化合物信息量更大。同時(shí)，DAD檢測(cè)器掃描在200～400 nm 范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)12 個(gè)共有峰均在330 nm 附近有較大吸收，且各待測(cè)成分與其他成分的色譜峰分離較好，因此以330 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 指紋圖譜分析及主成分含量測(cè)定結(jié)果分析

指紋圖譜作為整體、穩(wěn)定的化學(xué)鑒別手段，在中藥材和中成藥的質(zhì)量控制中具有非常重要的作用，為此構(gòu)建23 批艾絨樣品的HPLC 指紋圖譜，共確認(rèn)12 個(gè)共有峰，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果本研究共指認(rèn)7 個(gè)成分，23 批樣品的相似度均大于0.885，表明不同葉絨比的艾絨具有較高相似度，但是葉絨比增大，相似度減少。為進(jìn)一步考察艾絨的質(zhì)量，并建立相應(yīng)的含量測(cè)定方法，并對(duì)23 批次不同艾絨進(jìn)行了測(cè)定，雖然指紋圖譜的相似均較高，但不同批次的各成分的含量差異較明顯，同時(shí)指紋圖譜相似度和各成分含量測(cè)定結(jié)果顯示，葉絨比越大，相似度和含量越低，這可能與艾絨在加工制備時(shí)需要不斷地過(guò)篩，篩除掉艾粉和艾渣，艾粉主要為艾葉的葉肉組織，其內(nèi)含有大量的有機(jī)成分。因此，葉絨比越大的艾絨，所含的雜質(zhì)和艾粉越少，其相似度和各成分含量就越低。

綜上，本研究建立的方法，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，且艾絨指紋圖譜和主要成分含量測(cè)定可為艾絨等級(jí)的鑒定提供新的參考依據(jù)。