利用微載體系統(tǒng)規(guī)模化生產(chǎn)雞成肌細(xì)胞

劉屹森，蔡佳琦，李石磊，李瑩瑩，王守偉，楊 峰，胡海娟，劉文婷，李雨爽，董圣艷，陳嘉璇，梁 俊,

（1.天津科技大學(xué) 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

細(xì)胞培育肉又稱作細(xì)胞培養(yǎng)肉、生物培育肉、培育肉等[1]，是利用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方式控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一種新型肉類食品[2]，該技術(shù)被認(rèn)為是未來緩解環(huán)境污染、可持續(xù)發(fā)展、解決全球公共健康和動(dòng)物福利等問題的潛在方案[3]。細(xì)胞培育肉的生產(chǎn)需要借助細(xì)胞大規(guī)模體外培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)[4]，然而細(xì)胞貼壁培養(yǎng)所需相對(duì)較大的表面空間，從而限制了細(xì)胞培育肉工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞能否有效地附著取決于細(xì)胞的特性、細(xì)胞與載體表面之間的有效接觸面積及微載體材料本身的生物相容性水平[5-8]。長(zhǎng)期以來，傳統(tǒng)的Dish培養(yǎng)皿適合于基礎(chǔ)科學(xué)研究，然而，對(duì)于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，Dish培養(yǎng)皿的比表面積利用率已成為“瓶頸”。因此，為提升細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)效率，研究人員將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了可用于細(xì)胞3D培養(yǎng)的微載體開發(fā)以及生物反應(yīng)器相關(guān)培養(yǎng)工藝的開發(fā)領(lǐng)域[9]，通過不斷提升微載體的比表面積利用率和生物相容性，從而提高細(xì)胞的綜合培養(yǎng)效率、不斷降低細(xì)胞培養(yǎng)所需空間體積。

如今微載體得到了廣泛研究，其材料主要包括殼聚糖[10]、水凝膠[11]、海藻酸鹽[12]、膠原[13]、透明質(zhì)酸[14]和聚苯乙烯等。微載體的實(shí)用性主要反映在它們的機(jī)械性能[15]、生物相容性[16]、沉降系數(shù)[17]、能否降解以及物理和化學(xué)刺激。在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，微載體的培養(yǎng)效率因研究目的、細(xì)胞類型和培養(yǎng)環(huán)境的不同而有所差異[18]。微載體的選擇按細(xì)胞直徑分類：胚胎干細(xì)胞為50～100 μm，間充質(zhì)干細(xì)胞為100～300 μm，多細(xì)胞混合物為200～600 μm，在使用過程中也依據(jù)細(xì)胞的類型進(jìn)行選擇[19]。優(yōu)化基于微載體的細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)于其大規(guī)模應(yīng)用非常重要[20-22]。一種常用方法是利用微載體、生物反應(yīng)器、細(xì)胞和培養(yǎng)基構(gòu)建細(xì)胞微生態(tài)系統(tǒng)，旋轉(zhuǎn)燒瓶反應(yīng)容器被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)，因?yàn)樗梢蕴峁┚鶆虻呐囵B(yǎng)環(huán)境[23]，在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞也受外界因素的影響，例如培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速和微載體的類型[24-26]。目前為止，有關(guān)成肌細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用于細(xì)胞培育肉生產(chǎn)的研究鮮有報(bào)道。

本研究對(duì)Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體進(jìn)行對(duì)比，篩選出更為適合大規(guī)模培養(yǎng)成肌細(xì)胞的微載體。以3D TableTrixTM微載體為研究對(duì)象，探討起始攪拌條件、細(xì)胞接種密度、微載體質(zhì)量濃度、攪拌速率、不同補(bǔ)料方式、血清、珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移等因素對(duì)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響，并采用單因素變量法優(yōu)化細(xì)胞三維培養(yǎng)的重要參數(shù)。通過珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移進(jìn)行細(xì)胞更大規(guī)模的培養(yǎng)，并將帶有細(xì)胞的微載體進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，對(duì)比觀察帶有細(xì)胞的微載體和解凍細(xì)胞之間的增殖狀況和形態(tài)差異，旨在為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)和探索性實(shí)踐，為細(xì)胞培育肉的工業(yè)化生產(chǎn)提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3D TableTrixTM北京華龕生物科技有限公司；Cytodex 1美國(guó)Sigma公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶消化液、杜氏磷酸緩沖鹽溶液（Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI）溶液、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）標(biāo)記鬼筆環(huán)肽溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT噻唑藍(lán)、臺(tái)盼藍(lán)染色液 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；50 mg/dL和100 mg/dL谷氨酸-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 山東省科學(xué)院生物研究所；3D FloTrixTMDigest 北京華龕生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3D FloTrix? mini SPIN單通道生物反應(yīng)器 北京華龕生物科技有限公司；真空凍干機(jī) 德國(guó)Christ公司；生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡 日本Nikon公司；掃描電子顯微鏡 捷克Tecan公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器 美國(guó)Thermo Fisher公司；多探測(cè)器酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 微載體的預(yù)處理

Cytodex 1：稱量干燥的微載體置于玻璃瓶中，加入DPBS進(jìn)行水合，4 h后去除上清液，加入新鮮的DPBS（50 mL/g），121 ℃高溫滅菌，放置在4 ℃冰箱備用；3D TableTrixTM：將微載體直接加入培養(yǎng)基水合使用即可。

1.3.2 微載體的結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.2.1 掃描電子顯微鏡

將Cytdex 1 粉末樣品鍍金后上機(jī)觀察。將3D TableTrixTM片劑溶于去離子水并置于10 cm培養(yǎng)皿中，在-20 ℃下冷凍2 h，真空冷凍干燥5～6 h，得到粉末狀3D TableTrixTM微載體樣品，鍍金后上機(jī)觀察。

1.3.2.2 粒徑分析

使用光學(xué)顯微鏡觀察Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體的結(jié)構(gòu)，并使用顯微鏡自帶的軟件測(cè)量微載體的孔徑大小。

1.3.3 成肌細(xì)胞的平皿培養(yǎng)

細(xì)胞取自25 日齡雞胚。在細(xì)胞提取中，將肌肉組織剪碎，0.25%胰酶消化30 min，每隔10 min觀察一次，之后加入2 倍體積的培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）以終止消化。收集消化液，1 500 r/min離心5 min，去上清液，將細(xì)胞重新懸浮在新的培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞覆蓋度達(dá)到80%后傳代。

1.3.4 成肌細(xì)胞在3D TableTrix?和Cytodex 1兩種微載體的增殖效率測(cè)定

將3D FloTrix-mini SPIN平臺(tái)安裝在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，并與旋轉(zhuǎn)速率控制器相連，將125 mL轉(zhuǎn)瓶中的磁葉輪調(diào)整到適當(dāng)高度，將轉(zhuǎn)瓶高壓滅菌，并在65 ℃烘箱中干燥后使用。

將3D TableTrixTM和Cytodex 1以質(zhì)量濃度2 mg/mL加入125 mL無(wú)菌轉(zhuǎn)瓶中，從培養(yǎng)皿中收獲細(xì)胞，在轉(zhuǎn)瓶中加入適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)基加至最終體積為100 mL。單獨(dú)設(shè)置一個(gè)微載體混合培養(yǎng)組，將3D TableTrixTM和Cytodex 1分別以質(zhì)量濃度1 mg/mL混合加入125 mL無(wú)菌旋轉(zhuǎn)燒瓶中，培養(yǎng)條件與上述相同。將旋轉(zhuǎn)燒瓶放置在3D FloTrix-mini旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上，設(shè)置轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速為40 r/min，每48 h從轉(zhuǎn)瓶中吸取1 mL樣品，對(duì)樣品進(jìn)行熒光染色并計(jì)數(shù)，觀察對(duì)比細(xì)胞在兩種微載體上的貼附情況。

1.3.5 基于微載體的成肌細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件的測(cè)定

1.3.5.1 最佳起始條件的確定

取成肌細(xì)胞置于普通培養(yǎng)皿中，使用0.25%胰酶消化5 min，加入2 倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入培養(yǎng)基使細(xì)胞重新懸浮。將3D TableTrixTM加入到含10 mL培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)瓶中，最后把細(xì)胞懸液加入到轉(zhuǎn)瓶中，使細(xì)胞與微載體充分混合。攪拌速率設(shè)置為0（靜止）、40 r/min（連續(xù)攪拌）和24 個(gè)周期（40 r/min×10 min和0 r/min×50 min）（間隔攪拌）。接種24 h后，攪拌速率恒定為40 r/min。從轉(zhuǎn)瓶側(cè)臂取1 mL樣品，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)樣品染色和計(jì)數(shù)。為確保采樣均勻，在吸取微載體樣品時(shí)保持40 r/min的持續(xù)攪拌。通過測(cè)定接種后2、12 h和24 h樣本上清液中的細(xì)胞數(shù)評(píng)估細(xì)胞貼附效率。

1.3.5.2 最佳細(xì)胞接種數(shù)量的確定

3D TableTrixTM用量為2 mg/mL，培養(yǎng)基體積為100 mL，轉(zhuǎn)速為40 r/min。細(xì)胞接種數(shù)量分別為1×104、5×104、1×105、2×105個(gè)/mL。將細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，在37 ℃培養(yǎng)箱中攪拌懸浮培養(yǎng)，每隔48 h采集1 mL樣品監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)樣品進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)曲線，篩選出細(xì)胞的最佳接種數(shù)量。

1.3.5.3 最佳微載體質(zhì)量濃度的確定

3D TableTrix?以0.5、1、2、4 mg/mL 4 個(gè)不同質(zhì)量濃度接種到轉(zhuǎn)瓶中，細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL，培養(yǎng)基體積為100 mL。將細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，在37 ℃培養(yǎng)箱中攪拌懸浮培養(yǎng)，每隔48 h采集1 mL樣品，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)樣品進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)曲線，確定3D TableTrix?的最佳使用量。

1.3.5.4 最佳攪拌速率的確定

將細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)瓶中，細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)/mL，微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL，培養(yǎng)基體積為100 mL，24 h間隔攪拌后，細(xì)胞基本完全貼附在微載體上，分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為20、40、60 r/min 3 種攪拌速率進(jìn)行持續(xù)攪拌培養(yǎng)，每隔48 h觀察細(xì)胞在3D TableTrixTM上生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)，確定最佳攪拌速率。

1.3.5.5 血清對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

首先將10 片微載體和一定數(shù)量細(xì)胞轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)瓶中，加入血清體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和20%的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)瓶中，加入培養(yǎng)基使最終體積均為100 mL，同時(shí)以40 r/min的速率進(jìn)行攪拌，每次攪拌10 min后，靜置50 min。在循環(huán)第2、12、24次后，吸取轉(zhuǎn)瓶中上清液并測(cè)定其中的細(xì)胞數(shù)，評(píng)估血清體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞貼附微載體效率的影響，并使用DAPI染液對(duì)細(xì)胞在不同血清體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)24 h后吸取的樣品進(jìn)行染色觀察，每隔48 h采集1 mL樣品觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以血清體積分?jǐn)?shù)10%的培養(yǎng)基作為對(duì)照，分析血清含量對(duì)細(xì)胞增殖效率的影響。

1.3.5.6 補(bǔ)料方式對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

取細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)瓶中，細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL，接種微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL，使用含20%胎牛血清（V/V）的DMEM培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，接種24 h后加入相同體積的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)基最終體積為100 mL。分別采用每天更換20%培養(yǎng)基、接種后隔天更換50%培養(yǎng)基、接種后每3 d更換80%培養(yǎng)基3 種不同補(bǔ)料策略進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48 h取樣觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)狀況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5.7 珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移

將細(xì)胞接種于兩個(gè)轉(zhuǎn)瓶中，細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL，接種微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL，培養(yǎng)基體積均為100 mL。細(xì)胞在37 ℃、5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)8 d，第8天分離轉(zhuǎn)瓶中攜帶細(xì)胞的微載體，加入至一個(gè)新的125 mL轉(zhuǎn)瓶中，該瓶?jī)?nèi)有10 片新鮮的3D TableTrixTM，加入培養(yǎng)基至最終體積為100 mL，另一個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)微環(huán)境保持不變，細(xì)胞在40 r/min的恒定攪拌速率下繼續(xù)培養(yǎng)6 d。每48 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用細(xì)胞的熒光染色量化細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.3.5.8 基于微載體的細(xì)胞培養(yǎng)過程中葡萄糖和乳酸濃度的變化

從普通培養(yǎng)皿中收獲成肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL，微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL，培養(yǎng)基最終體積為100 mL。將細(xì)胞在37 ℃、5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每隔12 h，從轉(zhuǎn)瓶中吸取上清液1 mL，將吸取的上清液用生化分析緩沖液稀釋5 倍，加入到生物傳感分析儀中，記錄所取上清液中葡萄糖和乳酸的濃度。

1.3.5.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系的擴(kuò)大

按1.3.5.7節(jié)方法，將1×107個(gè)細(xì)胞在100mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，將載有細(xì)胞的微載體從轉(zhuǎn)瓶中分離出來，用于珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移到1 L轉(zhuǎn)瓶中。將90 片新鮮的3D TableTrixTM、載有細(xì)胞的微載體和1 L培養(yǎng)基通過容器的側(cè)臂添加到2 L轉(zhuǎn)瓶中，每96 h取樣并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞在更大規(guī)模的轉(zhuǎn)瓶中的生長(zhǎng)情況。

1.3.5.10 微組織的凍存和復(fù)蘇

從轉(zhuǎn)瓶中取出含有細(xì)胞的微載體樣品，離心去上清液，加入含10% DMSO、20%血清和70% DMEM的1 mL冷凍保存劑，將凍存樣品封裝到凍存管中，并將凍存管置于凍存盒內(nèi)存放到-80 ℃冰箱中冷凍24 h，之后轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

將凍存盒中的微組織從液氮中取出，立即浸入37 ℃的水浴中2 min，輕輕晃動(dòng)凍存管以促進(jìn)解凍。解凍完全后，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，緩慢加入10 mL培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，沉淀微組織，棄上清液。從解凍的微組織中獲取細(xì)胞，并對(duì)凍存3、7、14、30 d的細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)。使用顯微鏡對(duì)從解凍后微組織中獲取的細(xì)胞和普通細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)，并使用MTT法對(duì)其增殖效率進(jìn)行對(duì)比。

1.3.5.11 細(xì)胞的收獲和計(jì)數(shù)

吸取攜帶細(xì)胞的微載體到EP管中，微載體沉降后去除上清液。3D FloTrixTMDigest裂解液以0.15 mL/mg微載體的比例加入，37 ℃孵育30 min，用臺(tái)盼藍(lán)染色法通過自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)式（1）計(jì)算細(xì)胞回收率，式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率：

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytodex 1和3D TableTrixTM的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 Cytodex 1和3D TableTrixTM的外觀表征

3 D Table TrixTM是一種新型的大孔明膠微載體，這種微載體以固定質(zhì)量的片劑狀態(tài)存在，厚度為（1.57±0.01）mm，直徑為（8.01±0.05）mm（圖1A1）。而Cytodex1是一種帶正電、無(wú)孔的聚乙烯微載體，以粉末狀態(tài)存在（圖1B1），經(jīng)常用于在攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞[27]。圖1A2、A3和圖1B2、B3分別顯示了3D TableTrixTM片劑和Cytodex 1粉末在顯微鏡以及掃描電鏡下的放大圖像。3D TableTrixTM是一種表面多孔且孔隙較大的不規(guī)則球體，這種多孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞在微載體上的附著和生長(zhǎng)提供了較大的可用面積。Cytodex 1是一種表面光滑的球體，無(wú)大孔結(jié)構(gòu)。

圖1 3D TableTrix?片劑（A）和Cytodex 1粉末（B）目測(cè)及其微觀圖Fig.1 Visual measurement and electron microscopic images of 3D TableTrix? (A) and Cytodex 1 powder (B)

2.1.2 微載體的粒徑分布

通過顯微鏡測(cè)量相同質(zhì)量的兩種微載體水合后的粒徑分布情況，結(jié)果如圖2所示，Cytodex 1的平均粒徑為265 μm，明顯高于平均粒徑為195 μm的3D TableTrixTM，而且3D TableTrixTM的粒徑大小相比Cytodex 1更加不均勻。

圖2 微載體的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of microcarriers

2.2 細(xì)胞在兩種微載體的生長(zhǎng)情況分析

2.2.1 細(xì)胞在兩種微載體的增殖效果分析

基于微載體的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖3a所示，在接種最初的24 h內(nèi)，大部分細(xì)胞都貼附在微載體上。基于兩種微載體培養(yǎng)的細(xì)胞均在第2天進(jìn)入指數(shù)期，在第7天進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線之間的生長(zhǎng)趨勢(shì)沒有區(qū)別，均呈S型曲線。然而，細(xì)胞在微載體上的分布不同，從細(xì)胞附著在微載體上生長(zhǎng)的第4天開始，細(xì)胞在兩種微載體上的增殖效率有顯著差異（圖3b），并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量在兩種微載體上的差異越來越大。最終細(xì)胞的收獲量如圖3b所示，3D TableTrixTM顯著高于Cytodex 1，為8.97×105個(gè)/mL，細(xì)胞在3D TableTrixTM比Cytodex 1有更高的增殖效率。

圖3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（a）和差異性分析（b）Fig.3 Cell growth curves (a) and difference analysis (b)

2.2.2 細(xì)胞在兩種微載體的附著效果分析

細(xì)胞在微載體上附著48 h后，通過使用DAPI和FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽兩種染液對(duì)微載體進(jìn)行染色觀察，圖4A1～A4表明細(xì)胞可以較好附著在Cytodex 1上，圖4B1～B4表明細(xì)胞同樣可以附著在3D TableTrixTM上。將兩種微載體以相同質(zhì)量與細(xì)胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后，取混合液染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在兩種微載體上的附著有顯著差異（圖4C1～C4）。

2.2.3 細(xì)胞在兩種微載體的存活率和回收率分析

Cytodex 1由于其表面剛性強(qiáng)，不容易被裂解，因此，使用差速離心法對(duì)Cytodex 1附著的細(xì)胞進(jìn)行收集；3D TableTrixTM可以通過用其特定的裂解試劑3D FloTrixTMDigest實(shí)現(xiàn)完全裂解，并且裂解后細(xì)胞的收獲效率更高。在顯微鏡下觀察到，3D TableTrixTM在30 min內(nèi)完全溶解（圖5），細(xì)胞回收率達(dá)到（98.6±0.1）%，細(xì)胞存活率維持在（94.2±0.1）%。雖然Cytodex 1可以通過差速離心法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的收集，但在胰酶消化和離心過程中對(duì)細(xì)胞的收獲效率存在很大影響，而3D TableTrix?通過其特定的裂解液實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高效回收。綜合來看，3D TableTrixTM相比Cytodex 1更適合進(jìn)行成肌細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)3D TableTrixTM微載體細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化和完善。

圖5 3D TableTrixTM溶解的明場(chǎng)圖Fig.5 Bright field images of cells during the dissolution of 3D TableTrixTM

2.3 攪拌方式對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系的影響

本研究測(cè)定了3 種不同的攪拌模式（即靜止（不攪拌）、持續(xù)攪拌和間隔攪拌）在接種的前24 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞附著的影響，結(jié)果如圖6a所示。2、12 h和24 h細(xì)胞的貼附率并沒有顯著差異（P＞0.05）。對(duì)吸取的樣品進(jìn)行染色觀察結(jié)果見圖6b～d，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)24 h后，間隔攪拌使細(xì)胞在微載體上的分布更加均勻，有利于細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞接種后在高速和低速之間（或攪拌和非攪拌周期的間隔）間隔攪拌，可最大限度地提高細(xì)胞與微載體的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞均勻分布，同時(shí)在低速攪拌或不攪拌期間將細(xì)胞貼附在微載體上[28-30]。因此，采用間隔攪拌用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以促進(jìn)細(xì)胞均勻貼附在微載體上。

圖6 攪拌方式對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系的影響Fig.6 Effects of stirring methods on cell culture in spinner flasks

2.4 細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

為了探索適合微載體培養(yǎng)的最佳細(xì)胞接種密度，本實(shí)驗(yàn)使用固定質(zhì)量濃度的微載體，并將不同數(shù)量的細(xì)胞與微載體混合，以探索適合微載體細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明在細(xì)胞增殖過程中，不同數(shù)量接種的細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著差異（P＜0.05）（圖7A）。接種數(shù)量為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞在培養(yǎng)10 d后未能進(jìn)入指數(shù)期。按照其增殖趨勢(shì)，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)期需要較長(zhǎng)時(shí)間，不利于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)接種數(shù)量為5×104個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞正常增殖進(jìn)入指數(shù)期，達(dá)到有效增殖，其擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于其他細(xì)胞接種的密度，但第10天細(xì)胞生長(zhǎng)曲線尚未到達(dá)平臺(tái)期（圖7B）。雖然5×104個(gè)/mL可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，效率較低。相比之下，1×105個(gè)/mL和2×105個(gè)/mL兩組效果好于其他組。由于接種數(shù)量的差異，1×105個(gè)/mL組在第8天達(dá)到平臺(tái)期，2×105個(gè)/mL在第6天達(dá)到平臺(tái)期。但是2×105個(gè)/mL組因?yàn)榻臃N數(shù)量較多，其擴(kuò)增倍數(shù)相較于其他幾組比較低，同時(shí)細(xì)胞在微載體上出現(xiàn)大量聚團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞大量脫落死亡（圖7F2）。接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)良好增殖，細(xì)胞微載體聚團(tuán)較少（圖7E2）。因此，細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL適合細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

圖7 細(xì)胞接種數(shù)量對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on cell culture

2.5 微載體質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，不同微載體質(zhì)量濃度環(huán)境下的細(xì)胞生長(zhǎng)有著較大差異。如圖8A所示，0.5 mg/mL組微載體質(zhì)量濃度較低，細(xì)胞在貼附微載體后，在第4天達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)相比其他組少（圖8B），不適于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。4 mg/mL組，由于微載體質(zhì)量濃度比較高，大量微載體空載（圖8F2），導(dǎo)致細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)效率較低，考慮到細(xì)胞接種到生長(zhǎng)抑制的周期為7 d，因此，4 mg/mL也不適于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。1 mg/mL和2 mg/mL組細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)情況好于其他兩組，通過圖8A發(fā)現(xiàn)2 mg/mL組細(xì)胞數(shù)量顯著高于1 mg/mL組。因此，確定最佳微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

圖8 微載體質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響Fig.8 Effect of microcarrier concentration on cell culture

2.6 攪拌速率對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

為了評(píng)估攪拌速率對(duì)細(xì)胞增殖的影響，在轉(zhuǎn)瓶中以20、40 r/min和60 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)攪拌速率為20 r/min時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，最大細(xì)胞數(shù)量為8.91×105個(gè)/mL，但在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中，微載體無(wú)法實(shí)現(xiàn)懸浮失重，在顯微鏡下觀察細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)分布不均勻且細(xì)胞微載體聚團(tuán)較多，因此在20 r/min攪拌速率下不利于細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。攪拌速率為40 r/min和60 r/min時(shí)，細(xì)胞最大數(shù)量分別為9.86×105個(gè)/mL和7.92×105個(gè)/mL。攪拌速率為60 r/min時(shí)，細(xì)胞數(shù)量從1×105個(gè)/mL增加到第8天的7.92×105個(gè)/mL，顯著低于其他兩組（圖9），而且細(xì)胞增殖速率較慢，同時(shí)觀察到部分細(xì)胞從微載體上脫落。提高轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速可以增加細(xì)胞與微載體的接觸率，然而這一過程也會(huì)增加剪切力，降低細(xì)胞活力[31]，并且不利于細(xì)胞與微載體的貼附。因此，采用40 r/min為細(xì)胞培養(yǎng)的最佳攪拌速率。

圖9 不同轉(zhuǎn)速下細(xì)胞數(shù)量的差異性分析（a）和生長(zhǎng)曲線（b）Fig.9 Differential analysis of cell number at different rotation speeds (a) and cell growth curves (b)

2.7 補(bǔ)料方式對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

在細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系中，為避免吸出微載體導(dǎo)致細(xì)胞的損失，無(wú)法進(jìn)行100%培養(yǎng)基的交換。本研究中采用每天更換20%培養(yǎng)基、隔天更換50%培養(yǎng)基以及第3天一次性更換80%培養(yǎng)基3 種不同的補(bǔ)料方式，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如圖10所示。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，3 種補(bǔ)料方式最終所收獲細(xì)胞密度差異較為顯著。其中每天更換20%培養(yǎng)基的補(bǔ)料方式獲得的細(xì)胞密度最低，收獲細(xì)胞數(shù)量為7.41×105個(gè)/mL；第3天一次性更換80%培養(yǎng)基略優(yōu)于每天更換20%培養(yǎng)基的補(bǔ)料方式，其獲得的細(xì)胞數(shù)量為7.79×105個(gè)/mL；隔天更換50%培養(yǎng)基的補(bǔ)料方式獲得了最多的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞收獲數(shù)量達(dá)8.84×105個(gè)/mL，并且收獲的細(xì)胞密度顯著高于其他兩組，其他兩組因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了更多有害的代謝物質(zhì)，因此，選擇隔天更換50%培養(yǎng)基為最優(yōu)補(bǔ)料方式。

圖10 不同補(bǔ)料方式下細(xì)胞的生長(zhǎng)差異性分析（a）和生長(zhǎng)曲線（b）Fig.10 Effect of different feeding methods on cell growth

2.8 血清體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

在體外培養(yǎng)中，血清中必須含有大量的生長(zhǎng)因子才能維持細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[32]。較高的血清體積分?jǐn)?shù)可維持細(xì)胞的良好狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[33]。細(xì)胞使用含5%、10%、20%血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分析不同血清體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞的影響，以此來探索合適的培養(yǎng)方法。圖11a表明，隨著初始血清含量的增加，細(xì)胞在微載體上的貼附率顯著增加，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有了明顯改善，從圖11c細(xì)胞的染色結(jié)果中也可以發(fā)現(xiàn)，隨著血清含量的增加，每個(gè)微載體上的平均細(xì)胞貼附數(shù)量也顯著增加，20%血清組細(xì)胞貼附率顯著好于其他兩組（P＜0.05）。根據(jù)細(xì)胞貼附數(shù)量的不同，20%初始血清是較優(yōu)方案。而在之后細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在達(dá)到細(xì)胞最大濃度之前，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)速率隨著血清體積分?jǐn)?shù)的增大而加快，但是10%血清和20%血清兩組間細(xì)胞密度無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖11b），分別為9.1×105個(gè)/mL和9.25×105個(gè)/mL。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，較高的血清體積分?jǐn)?shù)可以有效地確保細(xì)胞的活性和增殖能力[34]，但成本會(huì)相應(yīng)增加。通常情況下，細(xì)胞培養(yǎng)過程使用血清體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)基。一方面，初始培養(yǎng)過程中高血清含量提高了細(xì)胞和微載體之間的生物相容性；另一方面，增加了細(xì)胞的活力，促進(jìn)了細(xì)胞貼壁的效率。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞在24 h內(nèi)貼附在微載體上時(shí)，逐漸增加培養(yǎng)基，將血清稀釋到10%，降低培養(yǎng)成本的同時(shí)又可以提高細(xì)胞貼附和增殖效率。

圖11 血清體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響Fig.11 Effect of serum volume fraction on cell culture

2.9 珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移

細(xì)胞增殖與其生長(zhǎng)所需的表面積息息相關(guān)，為促進(jìn)細(xì)胞增殖以獲得更高的產(chǎn)量，提供更大的表面積至關(guān)重要。在常見的單層培養(yǎng)中需從培養(yǎng)皿消化收集細(xì)胞，再接種到更多的新培養(yǎng)皿中，而微載體培養(yǎng)是在適當(dāng)時(shí)間提供新的微載體，從而擴(kuò)大細(xì)胞生長(zhǎng)所需的表面積，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞連續(xù)擴(kuò)增，不需要采集細(xì)胞和重新接種，這種擴(kuò)增效果需要珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用，該技術(shù)可使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)移到新的微載體上[35]。本研究的珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移效果如圖12a所示，加入了新的微載體后細(xì)胞開始進(jìn)一步生長(zhǎng)。由于細(xì)胞在微載體間的轉(zhuǎn)移，細(xì)胞的染色圖像出現(xiàn)了細(xì)胞橋（圖12c4）。添加新微載體后隔天的染色圖像可以進(jìn)一步證實(shí)這種轉(zhuǎn)移（圖12c1～c3）。同時(shí)利用珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，由圖12b可以看到，當(dāng)微載體質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，最大細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到7.42×105個(gè)/mL；微載體質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，最大細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到1.08×106個(gè)/mL；而當(dāng)微載體質(zhì)量濃度增加到6 mg/mL時(shí)，最大細(xì)胞數(shù)量可達(dá)1.74×106個(gè)/mL，利用珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

圖12 珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的影響Fig.12 Effect of bead-to-bead transfer on cell culture

2.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)和代謝分析

在細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸濃度的變化直接反映了細(xì)胞在微載體上增殖的代謝情況[36]?；谏鲜鰞?yōu)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系進(jìn)行代謝分析，主要代謝產(chǎn)物的變化如圖13所示，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度隨著細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)程而變化。由圖13可知，在細(xì)胞貼附微載體的初期，葡萄糖的消耗量較低，同時(shí)乳酸的累積量也很低，在細(xì)胞進(jìn)入活躍的指數(shù)增長(zhǎng)期后，葡萄糖的消耗量增大，產(chǎn)生的乳酸量也快速升高，培養(yǎng)120 h后隨著細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)密度的增加細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，這時(shí)雖然細(xì)胞的密度不再增加，但葡萄糖的消耗和乳酸的分泌在更新培養(yǎng)基后仍然呈現(xiàn)快速變化，這說明動(dòng)物細(xì)胞的葡萄糖代謝與細(xì)胞的數(shù)量之間呈現(xiàn)正相關(guān)，葡萄糖代謝不僅可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需的能量和原料，也可以維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，因此，在培養(yǎng)過程中調(diào)控這兩者間的平衡對(duì)于提高葡萄糖的綜合利用至關(guān)重要。

圖13 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中細(xì)胞的葡萄糖代謝情況Fig.13 Glucose metabolism of cells in spinner flask culture

2.11 微載體轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系的擴(kuò)大

通過對(duì)3D TableTrixTM進(jìn)行珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移的可行性驗(yàn)證，進(jìn)行更大規(guī)模的培養(yǎng)。將1×107個(gè)細(xì)胞和10 片（0.2 g）微載體加入到125 mL的轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)8 d后一共收獲9.81×107個(gè)細(xì)胞（9.81 倍擴(kuò)增）。將含有9.81×107個(gè)細(xì)胞的微載體接種到100 片（2 g）微載體上，置于2 L轉(zhuǎn)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。最終獲得的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1.07×109個(gè)，存活率達(dá)到95%以上（圖14）。因此，在24 d內(nèi)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了107 倍的擴(kuò)張。

圖14 細(xì)胞在2 L轉(zhuǎn)瓶中的生長(zhǎng)曲線Fig.14 Growth curves of cells in 2 L spinner flasks with 3D TableTrixTM

2.12 顯微組織的冷凍保存

在冷凍保存3、7、14 d和30 d后解凍，細(xì)胞仍保持80%以上的存活率（圖15a），使用解凍微載體后的細(xì)胞（微組織）也成功進(jìn)行了細(xì)胞擴(kuò)增，這與正常解凍細(xì)胞作為開始擴(kuò)增的種子細(xì)胞增殖狀況（圖15b）和形態(tài)（圖1 5 c1、c2）沒有顯著差異（P＞0.0 5），3 D TableTrixTM可與傳統(tǒng)的冷凍保存技術(shù)兼容，細(xì)胞復(fù)蘇后仍然附著在微載體上（圖15c3、c4），從而證明了將微組織凍存作為后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)中種子細(xì)胞的可行性。

圖15 微組織凍存對(duì)細(xì)胞的影響Fig.15 Effect of microtissue cryopreservation on cell survival

3 結(jié)論

雞成肌細(xì)胞是生產(chǎn)細(xì)胞培育肉的細(xì)胞來源，將細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用于細(xì)胞培育肉中，需要大量細(xì)胞，因此細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)至關(guān)重要。本研究分析了細(xì)胞在Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體上的生長(zhǎng)情況，篩選出3D TableTrixTM作為成肌細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的微載體。3D TableTrixTM是一種可分散、可溶解的多孔微載體片劑，操作簡(jiǎn)單，可通過珠對(duì)珠的轉(zhuǎn)移消除細(xì)胞傳代過程中的酶解離過程，極大簡(jiǎn)化了成肌細(xì)胞擴(kuò)增的流程。此外，細(xì)胞可以在3D TableTrixTM微載體上冷凍保存，解凍后仍具有高活力且保留了3D宏觀結(jié)構(gòu)。微載體作為種子細(xì)胞在后續(xù)批次的培養(yǎng)中進(jìn)行珠對(duì)珠轉(zhuǎn)移，可用作植入性載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。然而，微載體Cultispher-G和3D TableTrixTM具有相似的化學(xué)組成和宏觀結(jié)構(gòu)。3D TableTrixTM相比Cultispher-G主要優(yōu)勢(shì)如下：1）3D TableTrixTM孔隙更大，細(xì)胞生長(zhǎng)更多；2）細(xì)胞在3D TableTrixTM相比Cultispher-G生長(zhǎng)效率更高[37-38]；3）3D TableTrixTM可以通過特定的裂解液3D FloTrixTMDigest進(jìn)行裂解，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高效回收。因此，在符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范下，使用這種高效的微載體，以工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)成肌細(xì)胞產(chǎn)品（如細(xì)胞培育肉）成為一種可能。

微載體通常在攪拌式生物反應(yīng)器中使用，因?yàn)槲⑤d體具有高的表面積-體積比，所以細(xì)胞的增殖效率高，同時(shí)微載體的沉降系數(shù)也很關(guān)鍵，微載體既要在一定時(shí)間實(shí)現(xiàn)沉降，又要在生物反應(yīng)器的一定轉(zhuǎn)速下實(shí)現(xiàn)懸浮。相比于無(wú)孔球形微載體，使用大孔微載體可以提供更高的表面積-體積比，從而獲得更高的細(xì)胞密度，對(duì)3D TableTrixTM的研究可支持這一理論，即多孔微載體更能促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)，這為細(xì)胞培育肉的生產(chǎn)提供了新思路，將微載體用于細(xì)胞培育肉的有3種可能情況：1）作為支持細(xì)胞增殖的臨時(shí)載體，之后細(xì)胞被取出并進(jìn)一步加工；2）被溶解或降解以釋放細(xì)胞的臨時(shí)載體；3）與最終產(chǎn)品相結(jié)合的可食用載體。目前為止，專為細(xì)胞培育肉行業(yè)開發(fā)的商用微載體尚無(wú)，該領(lǐng)域有很大的需求和潛力，開發(fā)可食用的或可被降解和溶解的微載體至關(guān)重要。