基于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中馬和驢成分檢測方法用于騾肉檢測的分析

周 藏，項(xiàng)佳林，劉立兵，王金鳳，付 琦，孫曉霞，王建昌,

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；3.河北省環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017）

2002年歐盟頒布的一般食品法中強(qiáng)調(diào)食品安全是食品政策和健康的關(guān)鍵優(yōu)先事項(xiàng)，確認(rèn)食品真?zhèn)问潜ＷC食品安全的重要內(nèi)容之一[1]。然而，自2013年歐洲爆發(fā)了“馬肉風(fēng)波”后，肉類摻假事件在全球范圍內(nèi)層出不窮[2-4]，嚴(yán)重危及了消費(fèi)者對食品行業(yè)安全的信任，引起人們對肉類摻假現(xiàn)象的關(guān)注，促使加強(qiáng)食品安全監(jiān)管的需求增加?？焖佟⒂行?、準(zhǔn)確、可靠的檢測技術(shù)是監(jiān)管和檢測食品摻偽的關(guān)鍵。

目前已有多種關(guān)于動物源性成分檢測方法用于肉類摻假鑒別，但其中大多數(shù)方法主要用于實(shí)驗(yàn)室研究，很少應(yīng)用于食品行業(yè)的常規(guī)分析檢測。色譜法和光譜法所需儀器昂貴，后續(xù)數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，對操作人員的專業(yè)水平要求較高，不適用于在資源有限的地區(qū)開展檢測[5-6]；而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)不能區(qū)分密切相關(guān)的物種，且因目的蛋白易變性，適用范圍小，難以推廣使用[7-8]；與之相比，基于分子生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法靈敏度高，特異性好，操作簡單，且DNA受熱穩(wěn)定，使得其可用于熱加工肉制品的檢測。因此，PCR是應(yīng)用最廣泛的成熟動物源性成分檢測方法[9-10]。目前我國已基于實(shí)時PCR（real-time PCR）技術(shù)建立了食品中多種動物源性成分檢測的相關(guān)國家、行業(yè)或地方標(biāo)準(zhǔn)。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實(shí)時熒光PCR法》和SN/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實(shí)時熒光PCR法》以驢和馬線粒體基因ATPase 6為靶基因進(jìn)行檢測，是目前常用于馬、驢成分檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。但在實(shí)際樣品檢測過程中，發(fā)現(xiàn)對于已知來源的單一動物源性成分的肉制品，存在兩種源性成分均有檢出的情況，即結(jié)果顯示馬、驢兩種成分均有檢出，與實(shí)際情況不符；考慮樣品為騾肉的情況，則與線粒體基因的嚴(yán)格母系遺傳理論相悖[11]。針對在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)的上述問題，本研究基于SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013分別對馬肉、驢肉和騾肉中馬、驢成分的檢測結(jié)果進(jìn)行分析，并就上述標(biāo)準(zhǔn)在騾肉中出現(xiàn)馬、驢成分均可檢出的情況進(jìn)行深入的原因分析，旨在為實(shí)驗(yàn)室中騾肉樣品的檢測結(jié)果判定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共收集9 份生肉樣品，包括3 份馬肉H1～H3、3 份驢肉D1～D3和3 份騾肉L1～L3，所有樣品均來自張家口蔚縣某屠宰場。

食品基因組DNA 提取試劑盒 美國Promega公司；Perfect Start?II Probe qPCR SuperMix（2×）、2×EasyTaqPCR SuperMix（＋dye）北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖 上海貝晶生物技術(shù)有限公司；DNA Marker I分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1-14臺式離心機(jī) 德國Sigma公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司；Quant Studio 5實(shí)時熒光定量PCR儀 美國ABI公司；SL 202電子天平 德國賽多利斯公司；BT-20T恒溫金屬浴 上海本亭儀器有限公司；T-Gradient梯度PCR儀德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針

參照SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013合成檢測馬、驢成分的特異性引物和探針；參考諶陽等[12]的方法分別合成基于線粒體基因和核基因檢測馬、驢成分的特異性引物。所有引物和探針均由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，序列如表1所示。

表1 所需引物和探針序列信息Table 1 Information of the primers and probes used in this study

1.3.2 動物基因組DNA的提取

使用干凈無菌的剪刀對樣品深層組織進(jìn)行多點(diǎn)取樣，置于研缽中使用液氮研磨成粉末，每取完一份樣品更換一把剪刀。分別取50 mg已研磨均勻的肉粉，置于1.5 mL離心管中，按照食品基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行核酸提取，最終以100 μL無菌水溶解基因組DNA。使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度，置于-20 ℃貯存，備用。同時提取實(shí)驗(yàn)室保存的馬、驢肉粉各50 mg，重復(fù)以上步驟提取基因組DNA，作為陰、陽性對照模板。

1.3.3 樣品種源確定

以提取的9 份生肉樣品的基因組DNA為模板，參考文獻(xiàn)[12]的引物分別基于線粒體基因和核基因?qū)悠分械鸟R、驢成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，分析其種源情況。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為2 μL，模板DNA為1 μL，無菌水7.5 μL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

1.3.4 SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測

以提取的9 份生肉樣品的基因組DNA 為模板，以ddH2O為空白對照，以馬、驢基因組DNA分別為陰性對照和陽性對照，使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物和探針對樣品中馬、驢成分分別進(jìn)行檢測。real-time PCR體系總體積為25 μL：2×PerfectStart?II Probe qPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為1 μL，10 μmol/L探針為1 μL，模板DNA為1 μL，無菌水8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環(huán)，在退火延伸時采集熒光信號。所有樣品重復(fù)檢測3 次，并記錄循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。

同時使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物對樣品中馬、驢成分分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR體系總體積為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為2 μL，模板DNA為1 μL，無菌水7.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增的產(chǎn)物由擎科生物（北京）科技有限公司測序。使用Megalign軟件結(jié)合Clustal W算法對擴(kuò)增序列與馬或驢的同源性進(jìn)行分析，將同源性大于98%的樣品歸為同一種[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA的濃度和純度

使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)對提取的樣品DNA質(zhì)量濃度和純度進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所提取的樣品DNA質(zhì)量濃度均在200～500 ng/μL范圍內(nèi)，A260nm/A280nm值在1.7～2.0之間，A260nm/A230nm值在2.0左右，可用于后續(xù)PCR[14-15]。

2.2 樣品種源的分析結(jié)果

使用引物馬-MF/R、驢-MF/R、馬-NF/R、驢-NF/R分別對9 份樣品中的馬、驢線粒體基因和核基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，分析其種源情況。如圖1A所示，H1～H3在基于線粒體基因和核基因的檢測中，均只檢出馬成分，其擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為馬M-H1～H3和馬N-H1～H3；D1～D3在基于線粒體基因和核基因的檢測中，均只檢出驢成分，其擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為驢M-D1～D3和驢N-D1～D3。而L1～L3在基于線粒體基因檢測中，只檢出馬成分，其擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為馬M-L1～L3；而在基于核基因的檢測中，馬、驢成分均有檢出，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為馬N-L1～L3和驢N-L1～L3。

圖1 樣品中馬、驢成分的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

進(jìn)一步對擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示馬M-H1和馬M-L1～L3對馬的同源性分別為99.3%、100%、100%、99.3%，驢M-D1對驢的同源性為100%；馬N-H1和馬N-L1～L3對馬的同源性分別為98.4%、99.2%、99.2%、98.4%，驢N-D1和驢N-L1～L3對驢的同源性均為100%。測序分析結(jié)果與凝膠電泳成像顯示的馬、驢成分?jǐn)U增情況一致，即H1～H3只含有馬成分，D1～D3只含有驢成分，L1～L3既含有馬成分，又含有驢成分。判斷H1～H3均為馬肉，D1～D3均為驢肉，L1～L3均為馬騾肉，符合預(yù)期樣品情況。

2.3 SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測結(jié)果

以9 份樣品的基因組DNA為模板，設(shè)立ddH2O為空白對照，馬、驢基因組DNA各自為陰性對照和陽性對照，同時進(jìn)行馬、驢成分的real-time PCR方法檢測。結(jié)果如圖2所示，對于馬成分檢測，以驢基因組DNA作為陰性對照，未見擴(kuò)增曲線，以馬基因組DNA作為陽性對照，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；對于驢成分檢測，以馬基因組DNA作為陰性對照，未見擴(kuò)增曲線，以驢基因組DNA作為陽性對照，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。

圖2 樣品中馬、驢源性成分real-time PCR擴(kuò)增情況Fig.2 Real-time PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

對9 份樣品分別進(jìn)行馬、驢成分檢測，結(jié)果顯示，樣品H1～H3、L1～L3均檢出馬成分，且Ct值在15.00～18.00范圍內(nèi)；樣品D1～D3未檢出馬成分。樣品D1～D3、L1～L3均檢測出驢成分，其中D1～D3的Ct值在13.00～15.00范圍內(nèi)，L1～L3的Ct值在25.00～35.00范圍內(nèi)；樣品H1～H3未檢出驢成分。重復(fù)3 次real-time PCR檢測，結(jié)果一致，所得Ct值如表2所示。

表2 real-time PCR方法檢測結(jié)果Table 2 Real-time PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物分別對9 份樣品中的馬、驢成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，對測序結(jié)果進(jìn)行分析。如圖1B所示，馬、驢特異性的real-time PCR方法中的引物在普通PCR反應(yīng)中對9份樣品均有擴(kuò)增，將SN/T 3730.5—2013中馬成分的引物對樣品1、樣品4和樣品7～9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為馬-H1、馬-D1、馬-L1～L3；將SN/T 3730.4—2013中驢成分的引物對樣品1和樣品7～9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為驢-H1、驢-L1～L3。對擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行分析，如圖3所示，馬-H1、馬-L1～L3與馬的同源性均為100%，與驢的同源性分別為86.1%、85.9%、86.1%、86.1%；馬-D1與馬的同源性為86.1%，與驢的同源性為100%。驢-H1與馬的同源性為100%，與驢的同源性為86.1%；驢-L1～L3與馬的同源性為91.0%、89.9%、88.6%，與驢的同源性為85.9%、91.1%、89.9%。將同源性大于98%的樣品歸為同一種，具體分類情況如表3所示。

圖3 SN/T 3730.5—2013和SN/T 3730.4—2013對樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列Fig.3 Sequences of PCR amplification products from samples using SN-T 3730.5-2013 and SN/T 3730.4-2013 methods

表3 樣品中馬、驢源性成分測序結(jié)果的種源分析Table 3 Origin analysis of sequencing results of horse-and donkeyderived ingredients in samples

3 討論

騾是馬驢雜交的后代，自身不具有繁育生殖能力，因此并不屬于一個物種。目前尚無針對食品中騾成分特異性檢測的相關(guān)研究。對騾成分的檢測，通常是基于馬和驢成分的檢出情況進(jìn)行綜合判斷：以核基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測時，若馬、驢成分同時檢出，則可判斷為騾成分[11]。根據(jù)母系不同，騾又可分為馬騾和驢騾。此時，根據(jù)線粒體基因嚴(yán)格母系遺傳的理論，基于線粒體基因進(jìn)行馬和驢成分檢測時，騾肉中可檢出其母系物種，即馬成分或驢成分[16-17]。在本研究中，先根據(jù)基于線粒體基因和核基因的檢測確定了樣品的種源情況，即樣品H1～H3均為馬肉，D1～D3均為驢肉，L1～L3均為馬騾肉，從而可以進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013均以線粒體基因ATPase 6為靶基因，進(jìn)行馬、驢成分檢測時，能夠特異性區(qū)分馬和驢成分，也是目前應(yīng)用最為廣泛的食品中馬、驢成分特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。本實(shí)驗(yàn)室在使用上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行日常實(shí)際樣品檢測過程中，發(fā)現(xiàn)部分明確為非混合肉樣品，存在馬、驢兩種成分均有檢出的情況，并且一種成分Ct值一般≤20.00，另一種成分的Ct值則在25.00～35.00之間。該現(xiàn)象嚴(yán)重困擾了檢測人員的判斷。本研究中針對馬騾肉樣品，使用SN/T 3730.4—2013驢成分real-time PCR法檢測時，Ct值在25.00～35.00范圍內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中的結(jié)果判定原則，應(yīng)判為檢出驢成分，但是與實(shí)際樣品成分不符。

李亞楠等[18]在SN/T 3730.4—2013標(biāo)準(zhǔn)中檢出限合理性的探討中，指出以非混合肉樣品的基因組DNA為模板，馬成分real-time PCR方法檢測Ct值為17.00～20.00的同時，驢成分real-time PCR方法檢測Ct值在25.00～35.00范圍內(nèi)，原因可能是對非混合肉樣品中馬成分的非特異性擴(kuò)增。與其結(jié)論相比，本研究中使用SN/T 3730.4驢成分檢測Ct值為25.00～35.00的樣品也檢出了馬成分（Ct值為16.00～18.00），但并非所有Ct值在16.00～18.00范圍內(nèi)的馬基因組DNA在驢成分檢測方法中都出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且李亞楠等[18]的研究僅對樣品檢出的馬成分進(jìn)行了測序分析，未確定樣品的種源，不能排除馬騾肉的情況。

使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013的引物，通過普通PCR方法擴(kuò)增馬肉、驢肉的基因組DNA后，出現(xiàn)了相同的目的條帶，盡管不能特異性區(qū)分馬和驢，但無論是馬成分引物對驢的非特異性擴(kuò)增，還是驢成分引物對馬的非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的測序結(jié)果仍能正確鑒別出馬和驢，如馬-D和驢-H測序結(jié)果的種源分析。因此，若馬騾中線粒體靶基因序列完全遺傳自馬，則驢成分引物同樣能對其中的馬成分進(jìn)行擴(kuò)增并且測序結(jié)果將與馬同源。但實(shí)際結(jié)果顯示，使用驢成分引物對馬騾中線粒體靶基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物與馬的同源性分別為91.0%、89.9%和88.6%，不能歸于馬種，與驢的同源性分別為85.9%、91.1%和89.9%，也不能歸于驢種。

基于線粒體基因嚴(yán)格母系遺傳的理論，在對子代線粒體基因進(jìn)行檢測時，僅能檢測出母系物種成分[19]。然而，對線粒體基因進(jìn)行提純較因難，在實(shí)際應(yīng)用中，通常使用基因組DNA進(jìn)行檢測。已有研究表明，核基因中存在線粒體基因序列Numts[20]。自1994年，Lopez等[20]在家貓核基因組中發(fā)現(xiàn)了一段與線粒體基因組同源的序列，此后，已陸續(xù)在人類、真菌、植物、節(jié)肢動物、鳥類和其他哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了大量的Numts[20-25]。目前，核基因中的Numts片段已經(jīng)涵蓋了線粒體基因組的全部基因，物種不同，其重復(fù)數(shù)不同，可為10～500 次[20-21]，且Numts內(nèi)部常會發(fā)生堿基的插入、缺失[23-27]。因此，針對線粒體基因進(jìn)行檢測時，若核基因中存在靶序列，將對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，并可能從子代基因組DNA中檢測到父系線粒體基因片段。本研究針對馬騾肉樣品，應(yīng)用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013對樣品進(jìn)行馬、驢成分檢測，結(jié)果表明，兩種成分均能檢出，但Ct值差異明顯。造成該現(xiàn)象的原因可能是馬騾全基因組DNA中針對馬、驢的擴(kuò)增片段存在于兩個不同的位點(diǎn)，即分別位于線粒體基因和核基因，且兩個位點(diǎn)的拷貝數(shù)相差較大，分別對應(yīng)線粒體基因的拷貝數(shù)和核基因中Numts的重復(fù)數(shù)[28]，其中線粒體基因的拷貝數(shù)通常為102～104[29-30]。以確定的馬騾肉樣品基因組DNA為模板，進(jìn)一步使用SN/T 3730.4—2013的引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，其測序結(jié)果與SN/T 3730.5—2013的測序結(jié)果不同，可能為驢的該線粒體基因片段在核基因中發(fā)生了部分堿基的插入或缺失，進(jìn)一步使得馬成分引物不能識別核基因中的位點(diǎn)，而驢成分引物可以識別該位點(diǎn)，從而與對線粒體基因位點(diǎn)的識別一同擴(kuò)增，影響了測序的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致對擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果既不與馬同源，也不與驢同源。雖然本研究確定了樣品的種源情況，驗(yàn)證了SN/T 3730.4—2013應(yīng)用于騾肉檢測的能力。但由于SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中擴(kuò)增片段均較短，為130 bp，因此，其擴(kuò)增片段的測序結(jié)果在準(zhǔn)確鑒別物種上存在一定的局限。

4 結(jié)論

在日常檢測工作中，SN/T 3730.4—2013 和SN/T 3730.5—2013能夠?qū)崿F(xiàn)肉制品中馬、驢成分的特異性鑒別檢測。對已知來源于單一動物源性成分樣品的分析中，出現(xiàn)一種成分Ct值較低（一般≤20.00），同時另一種成分也出現(xiàn)擴(kuò)增且Ct值在25.00～35.00范圍內(nèi)，應(yīng)考慮騾源性的可能。