地奧心血康基于腸道菌群改善阿霉素致心臟毒性的作用研究

袁楚橋，王濤，鄒文俊

以阿霉素（Doxorubicin，DOX）為代表的蒽環(huán)類藥物產(chǎn)生的心臟毒性已成為威脅腫瘤患者生存的嚴(yán)峻問題。當(dāng)前有高達(dá)60%的癌癥患者接受蒽環(huán)類藥物治療[1]，隨著化療周期的增加，患者出現(xiàn)藥物劑量依賴性的不可逆心肌損傷，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）[2]，其病機(jī)與氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體損傷、鈣離子超載等多種損傷因素有關(guān)[3]。臨床通過對(duì)DOX進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，或與右丙亞胺（Dexrazoxane），β受體阻滯劑、輔酶Q10、維生素D等藥物聯(lián)用以治療阿霉素致心臟毒性[4-5]，但右丙亞胺存在明顯的骨髓抑制作用，其余心臟保護(hù)劑亦缺乏高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)確證其療效。因此，尋找療效穩(wěn)定，副作用小的藥物是目前臨床面臨的一個(gè)緊迫問題。

近年研究表明，心臟與腸道存在密切關(guān)聯(lián)，心肌受損后供血能力下降，可能導(dǎo)致腸粘膜毛細(xì)血管通透性增加，造成腸道內(nèi)環(huán)境改變，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物紊亂[6]，菌群變化產(chǎn)生的內(nèi)毒素通過腸粘膜進(jìn)入體循環(huán)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，加深心臟損傷[7]，形成心肌損傷與腸道損傷的“惡性循環(huán)”。而化療藥物DOX不僅特異性蓄積于心臟組織，且其通過糞便排泄，可破壞腸道黏膜蛋白的物理屏障引起腸道損傷[8-10]。因此，調(diào)控腸道菌群可能成為干預(yù)DOX心臟毒性的一個(gè)新思路。

地奧心血康（Di'aoxinxuekang, DKKX）是1 9 8 9 年獲批的原二類中藥，收載于2 0 2 0版《中國藥典》，由薯蕷科植物穿龍薯蕷（DioscoreanipponicaMaκino）根莖提取物組成，它具有多種生物功能和藥理活性，如抗炎，擴(kuò)張冠脈血管，改善心肌缺血等。DXXK含有豐富的皂苷類成分，具有顯著的心臟保護(hù)作用[11]，同時(shí)已有研究表明DXXK的原料藥物穿龍薯蕷可以調(diào)節(jié)腸道菌群，調(diào)控大腸桿菌、白色葡萄球菌等菌株的活性[12]，且薯蕷皂苷元作為DXXK的主要有效成分，可以提高大鼠腸道中乳酸菌轉(zhuǎn)化率，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[13]。綜上所述，DXXK作為可通過調(diào)控腸道菌群以終止心腸互損的惡性循環(huán)。本研究旨在通過DOX致大鼠心肌損傷模型，以腸道菌群為切入點(diǎn)，探究DXXK對(duì)DOX心臟毒性的改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

地奧心血康膠囊購自成都地奧集團(tuán)（成都，中國），批號(hào)190801。注射用多柔比星（批號(hào)：2112E3）購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司（深圳，中國）。肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶（LDH）（批號(hào)：142622001）的血清生化試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司（深圳，中國）；心肌肌鈣蛋白（cTnT）、腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購自武漢伊萊瑞特有限公司。

RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）、AE224型分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）、DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)、TGL-16高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、V4800高通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司）、多功能酶標(biāo)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性Sprague Dawley大鼠體質(zhì)量220～240 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(北京，中國，No.SCXK (京) 2019-0008)。所有動(dòng)物在特定的條件下飼養(yǎng)，溫度(20±5℃)，相對(duì)濕度(55%±5%)，交替光照(12 h光照/12 h黑暗周期)，自由飲食飲水。所有操作均按中國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物愛護(hù)和使用指導(dǎo)原則》進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)前，所有動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。大鼠隨機(jī)分為6組(n=6)：對(duì)照組、DOX組、Dexrazoxane陽性組、DXXK低、中、高組。其中對(duì)照組每周腹腔注射生理鹽水，其余每周腹腔注射阿霉素（生理鹽水配制）1次，按照2.5 mg·kg-1， 1 mL/100g劑量給藥，連續(xù)6周，總劑量 15 mg·kg-1；同時(shí)，DXXK組大鼠分別按50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1劑量每天灌胃，對(duì)照組及模型組給予等量蒸餾水，連續(xù)6周。末次灌胃結(jié)束后，禁食禁水12 h，以腹部按摩法收集大鼠糞便，放入凍存管中液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用異氟烷麻醉，采集每只大鼠的腹主?dòng)脈血并收集心臟及結(jié)腸內(nèi)容物。

1.4 蘇木精-伊紅染色

將心臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。切割石蠟切片(5 μm厚)，并將其安裝在玻璃片上進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。組織學(xué)圖像用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，東京，日本)以×400倍的倍率拍攝。

1.5 SD大鼠心功能檢測(cè)

在大鼠末次灌胃給藥后放入小動(dòng)物麻醉機(jī)，使用異氟烷麻醉大鼠。將其仰面固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用生物信號(hào)采集系統(tǒng)采集大鼠的心電圖信號(hào)，將正負(fù)電級(jí)分別插入大鼠右上肢和左下肢，將底線插入大鼠的右下肢，記錄各組大鼠15 min的Ⅱ?qū)?lián)的心電圖，記錄其P波、T波、R波、Q波、S波、ST波幅度和大鼠的心率情況。

1.6 心肌酶和炎癥因子檢測(cè)

取大鼠心臟組織，稱重后按照說明書加入生理鹽水，加入高通量組織研磨儀制備勻漿，按相應(yīng)試劑盒說明書要求，測(cè)定肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）水平。

1.7 16S rRNA擴(kuò)增序列測(cè)定

處死動(dòng)物前，取糞便放入無菌EP管中，保存于-80°C中進(jìn)行16S rRNA分析。獲得的最終序列用于操作分類單位(OTUS)分析。根據(jù)最大樣本量分析結(jié)果，采用樣本序列隨機(jī)抽樣的方法，計(jì)算了基于豐度的蓋度估計(jì)器和CHAO1等代表物種豐富度的alpha多樣性指數(shù)和以PCoA分析代表的β多樣性指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

本研究數(shù)據(jù)通過 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊，則兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；若其不滿足，則采用秩和檢驗(yàn)。若P＜0.05，則表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地奧心血康對(duì)阿霉素致心臟損傷大鼠心臟功能及形態(tài)的影響

與對(duì)照組相比，模型組P波及Q波幅度顯著降低（P＜0.01），R波、T波、S波、ST波幅度明顯升高（P＜0.01），提示模型組大鼠存在心肌缺血及心電電位異常，如圖1（A-F）；心肌組織出現(xiàn)纖維變性及壞死，且出現(xiàn)心肌纖維溶解或斷裂，部分區(qū)域心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)含空泡，如圖2 B；與模型組相比,陽性藥組和DXXK高劑量組的 P波及Q波幅度顯著升高（P＜0.01），R波、T波、S波、ST波幅度顯著降低（P＜0.01）；心臟組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯增生或炎性浸潤，心肌纖維形態(tài)正常如圖2 C、F；而DXXK低劑量組P波、Q波、R波、S波、ST波幅度均存在升高趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DXXK中劑量組P波、R波幅度存在升高趨勢(shì)，S波存在降低趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T波、Q波、ST波幅度顯著升高（P＜0.05），如圖1 （A-F）。DXXK低、中劑量組的能顯著改善心肌組織炎性細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生，但改善效果弱于高劑量組，如圖2D、E。

圖1 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠心電圖的影響（A-F）心電圖P波幅度、T波幅度、R波幅度、ST波幅度、S波幅度、Q波幅度。

圖2 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠心肌病理變化的影響（A-F）分別為對(duì)照組、模型組、陽性組、心血康低、中高、劑量組心臟組織病理情況。

2.2 地奧心血康對(duì)阿霉素致心臟損傷大鼠心肌酶及炎癥因子水平的影響

與對(duì)照組大鼠相比，模型組C K-M B、LDH、BNP、cTnT水平升高，差異具有顯著性（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組、DXXK中、高劑量組的CK-MB、LDH、BNP、cTnT水平顯著降低（P＜0.01）；心血康低劑量組CK-MB、LDH、cTnT水平具有降低趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BNP水平顯著降低（P＜0.01），如圖3。炎癥與心肌損傷密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠心臟組織的炎癥因子水平，。與對(duì)照組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組、DXXK低、中、高劑量組的炎癥因子水平均有不同程度降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖4。

圖3 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠心肌酶水平的影響A：CK-MB；B：LDH；C：cTnT；D：BNP水平。

圖4 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠炎癥因子水平的影響A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-6水平。

2.3 地奧心血康對(duì)阿霉素致心臟損傷大鼠腸道菌群多樣性的影響

根據(jù)前兩部分的結(jié)果，選取對(duì)照組、模型組、DXXK高劑量組進(jìn)行后續(xù)研究。通過雙端測(cè)序發(fā)現(xiàn)，18個(gè)樣本共獲得個(gè)OTUs，對(duì)照組、模型組、DXXK組OTU數(shù)目分別是2178、1480、1676，共有OTUs57個(gè)，如圖5 A。

圖5 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠腸道菌群Alpha多樣性的影響A：樣本組間OTUs韋恩圖；B：Chao1指數(shù)稀釋曲線；C：Simpson指數(shù)稀釋曲線；D：Shannon指數(shù)稀釋曲線；E：Chao1指數(shù)分析；F：Simpson指數(shù)分析；G：Shannon指數(shù)分析

Alpha多樣性檢測(cè)結(jié)果表明，隨著測(cè)序量增加，曲線趨近平滑，僅增加少量新物種，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量已經(jīng)合理。Chao1指數(shù)可以估計(jì)群落中包含的物種數(shù)目；Shannon指數(shù)通過信息熵計(jì)算，Shannon指數(shù)越大，群落的不確定性越高，則該群落中未知因素越多，即多樣性高；Simpson指數(shù)的數(shù)值范圍在0-1之間，當(dāng)群落中物種數(shù)僅為1時(shí)， Simpson值為0，直觀理解為多樣性最?。划?dāng)物種種類趨近無限多，且各物種數(shù)目一致時(shí)，該群落的物種豐富度最高，均勻度最高，Simpson值為1。本研究中，各組樣本的 Chao、Shannon、Simpson 等指數(shù)見圖5 B-D。與對(duì)照組相比，模型組Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，DXXK組的Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)顯著升高（P＜0.05），如圖5E-G。

本研究基于unweighted unifrac 距離算法，采用主坐標(biāo)分析法（Principal Coordinates Analysis，PCoA），評(píng)估大鼠腸道菌群 β 多樣性，見圖6。結(jié)果表明，橫坐標(biāo)PC1 為 17.46%，PC2 為 17.07%，；由PC1軸距離可見，3組組間差異明顯，模型組點(diǎn)群與對(duì)照組偏差較大，而心血康組與對(duì)照組距離較近，說明二者菌群結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖6 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠腸道菌群Beta多樣性的影響

2.4 地奧心血康對(duì)阿霉素致心臟損傷大鼠腸道菌群組成的影響

根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，本研究選取豐度TOP30物種分類，如圖7A。在門水平上，3組的優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)，變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門（Verrucomicrobia）。與對(duì)照組相比，模型組厚壁菌門、變形菌門占比上升，疣微菌門占比下降；與模型組相比，心血康組厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門占比下降，擬桿菌門占比上升，如表1。在屬水平上，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌屬為：未知的Muribaculaceae菌屬（Muribaculaceae_unclassified）、乳酸菌屬（Ligilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、HT002菌屬（HT002）、艾克曼菌屬（Akkermansia）；模型組的優(yōu)勢(shì)菌屬為：未知的Muribaculaceae菌屬、乳桿菌屬、乳酸菌屬、埃希氏桿菌屬（Escherichia-Shigella）、HT002菌屬；心血康組的優(yōu)勢(shì)菌屬為：未知的Muribaculaceae菌屬、乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、乳酸菌屬和HT002菌屬，如圖7B。在3組的共有優(yōu)勢(shì)菌屬中，與對(duì)照組相比，模型組未知的Muribaculaceae菌屬、乳酸菌屬的占比降低，乳桿菌屬和HT002菌屬占比升高；與模型組相比，心血康組乳桿菌屬、乳酸菌屬、HT002菌屬占比降低，未知的Muribaculaceae菌屬的占比上升，如表2。

表1 樣本組間腸道菌群厚壁菌門、擬桿菌門相對(duì)豐度及比值

表2 樣本組間腸道菌群共有優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度

圖7 心血康對(duì)阿霉素致心肌損傷大鼠腸道菌群物種豐度及組成的影響A：樣本組間門水平物種豐度堆疊圖；B：樣本組間屬水平物種豐度堆疊圖；C：樣本組間差異分析進(jìn)化分支圖；D：樣本組間差異分析分布柱狀圖

本研究采用LEfSe（LDA Effect Size）分析3組組間在豐度上有顯著性差異的物種，設(shè)置LDA閾值為4，篩選結(jié)果如圖7C、D。對(duì)照組的差異物種主要為擬桿菌門（p_Bacteroidota）、擬桿菌綱（c_Bacteroidia）、擬桿菌目（o_Bacteroidales）、普雷沃氏菌科（f_Prevotellaceae）、普雷沃氏菌屬（_Prevotella_unclassified；g_Prevotella）、類桿菌屬（_Bacteroides_sp_）；模型組的差異物種主要為丹毒絲菌科（f_Erysipelotrichaceae）、異桿菌屬（Allobaculum_unclassified；g_Allobaculum）；心血康組的差異物種主要包括疣微菌門（p_Verrucomicrobiota）、疣微菌綱（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、艾克曼菌屬（f_Akkermansiaceae；

g_Akkermansia； Akkermansia_unclassified）

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為“心與小腸相表里”，心氣可以推動(dòng)血液順暢運(yùn)行，促進(jìn)腸道泌別清濁的功能。同時(shí)“小腸主津”，可吸收水谷精微之津液以供心化血，兼養(yǎng)百脈[14]。而腸道菌群作為維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要角色，被稱為“微生物器官”，是心腸聯(lián)系的重要橋梁，而腸道菌群失調(diào)則可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激誘發(fā)多種心臟疾病[15]，前期研究表明，心血康可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激保護(hù)心肌損傷[16]，因此本研究基于16S rRNA測(cè)序技術(shù)探究地奧心血康通過調(diào)控腸道菌群抑制阿霉素心臟毒性的作用。

本研究結(jié)果表明，阿霉素在造成嚴(yán)重的心臟損傷的同時(shí)，還減少腸道細(xì)菌OTUs數(shù)目，抑制大鼠腸道菌群豐度及多樣性，并導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)異常偏移。而心血康不僅可以顯著恢復(fù)心肌細(xì)胞膜電位，改善心肌纖維化和炎性浸潤，降低心臟炎癥及心肌酶水平，還能夠調(diào)整心肌損傷大鼠的菌群豐度及多樣性，并恢復(fù)異常偏移的菌群結(jié)構(gòu)，使其貼近正常水平。

有研究表明，腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門和擬桿菌門的比值(Firmicutes/Bacteroidota，F(xiàn)/B)可以體現(xiàn)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)水平，F(xiàn)/B異常升高往往與炎癥反應(yīng)或肥胖相關(guān)[17]。通過物種堆疊圖分析，本實(shí)驗(yàn)3組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)均存在差異，與對(duì)照組相比，模型組厚壁菌門相對(duì)豐度升高，擬桿菌門相對(duì)豐度降低，F(xiàn)/B 值增大，說明阿霉素誘導(dǎo)大鼠腸道內(nèi)環(huán)境紊亂。給藥后，DXXK組厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門相對(duì)豐度升高，F(xiàn)/B 值減小，說明地奧心血康可以改善阿霉素誘導(dǎo)的菌群紊亂。在屬水平上，3組大鼠的腸道菌群存在結(jié)構(gòu)差異，心肌損傷大鼠志賀菌屬、乳桿菌屬及HT002菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯上升，給藥后豐度回調(diào)，說明心血康可能通過調(diào)控上述菌屬的數(shù)量以恢復(fù)菌群穩(wěn)態(tài)。另外，與對(duì)照組及模型組比較，心血康組中普雷沃菌屬豐度顯著升高，該菌屬作為腸道重要的基石菌屬，其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（SCFAs）對(duì)于腸道粘膜具有顯著的保護(hù)作用[18]，說明心血康在保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的同時(shí)，可能通過調(diào)控菌群穩(wěn)態(tài)，并間接參與修復(fù)腸道粘膜，對(duì)腸道產(chǎn)生保護(hù)作用。

LEfSe 結(jié)果表明，對(duì)照組特征細(xì)菌主要為擬桿菌、普雷沃氏菌和類桿菌等常見腸道菌種；模型組的特征細(xì)菌則為異桿菌，高豐度的異桿菌通常出現(xiàn)于肥胖大鼠異常的腸道環(huán)境中[19]，說明阿霉素的干預(yù)促進(jìn)了該致病菌的增殖；而心血康組的特征細(xì)菌為艾克曼菌屬，艾克曼菌可以分解腸道粘蛋白，利用分解糖苷鍵的糖苷酶，將寡聚糖分解成單糖為更多的益生菌所發(fā)酵利用[20]。該結(jié)果表明，心血康可以通過上調(diào)益生菌活性改善腸道內(nèi)環(huán)境。

綜上，地奧心血康可以調(diào)控阿霉素致心肌損傷大鼠的腸道微生物環(huán)境，可能通過恢復(fù)菌群結(jié)構(gòu)，參與修復(fù)腸道粘膜，提高益生菌活性并抑制致病菌生長(zhǎng)等途徑，改善因心肌損傷導(dǎo)致的大鼠腸道菌群紊亂。本研究以腸道菌群為切入點(diǎn)，探究地奧心血康的心臟保護(hù)作用，并為其作用機(jī)制提供新的視角。