基于GC-MS技術(shù)的圓柏?fù)]發(fā)性成分分析及不同品種比較研究

陳玉蘭，趙程成，羅玉婷，范 剛

圓柏為藏醫(yī)常用藥材，始載于藏醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》[1]，具有清熱、消炎、干黃水等功效，常用于治療腎炎、關(guān)節(jié)炎等疾病。圓柏臨床應(yīng)用廣泛，可與多種藏藥配伍，在十味訶子丸、二十五味獐牙菜丸、茜草丸等復(fù)方中均有使用[2-3]。圓柏具有明顯且獨(dú)特的香味，現(xiàn)代研究表明，圓柏藥材的揮性油含量豐富，其中主要成分為萜類及其含氧衍生物，如欖香醇、柏木腦等，這些成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等良好的藥理活性[4-6]。

圓柏為典型的多基原藥材。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)[7]，目前市場(chǎng)流通及臨床使用較多的品種主要為香柏S.pingiivar.Wilsonii、滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、大果圓柏S.tibetica、祁連圓柏S.przewalskii。目前，關(guān)于圓柏藥材的揮發(fā)油分析均為單一品種研究。如劉喜梅[5]分析了不同地區(qū)、不同海拔祁連圓柏的揮發(fā)性成分。涂永勤[6]等和董艷芳[8]等發(fā)現(xiàn)香柏?fù)]發(fā)油中α-蒎烯等成分的含量較高。這些研究對(duì)于圓柏藥材的質(zhì)量控制具有一定的意義，但圓柏不同品種藥材之間的揮發(fā)性成分種類和含量是否存在差異尚不明確。本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同基原圓柏中揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，并利用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS-DA）和方差分析，尋找種間差異成分，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，研究結(jié)果可為圓柏藥材的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

美國(guó)安捷倫7890A-5975C氣相色譜儀質(zhì)譜儀，色譜柱：Agilent HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），Sartorius BP121s 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。本研究共收集47批不同品種的圓柏藥材樣品，經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云教授鑒定為滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、香柏S.pingiivar.wilsonii、大果圓柏S.tibetica和祁連圓柏S.przewalskii。詳細(xì)信息見(jiàn)表1

表1 圓柏樣品來(lái)源一覽表Table 1 Summary table of Sabinae Ramulus sample sources

XB-05 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心5.01 XB-06 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 4.29 XB-07 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏國(guó)際藏中藥材交易城 4.13 XB-08 香柏S. pingii var. wilsonii 青海省果洛州藏醫(yī)醫(yī)院4.26 XB-09 香柏S. pingii var. wilsonii青海省稱多縣藏醫(yī)院4.96 XB-10 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市康定機(jī)場(chǎng)3.95 XB-11 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市加呷臘2.53 XB-12 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏自治區(qū)昌都地區(qū)芒康縣加尼頂鄉(xiāng)3.33 DZ-01 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省德格縣柯洛洞鄉(xiāng)1.91 DZ-02 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州理塘縣兔兒山1.90 DZ-03 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏國(guó)際藏中藥材交易城 1.88 DZ-04 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區(qū)林芝市藏醫(yī)院（察隅）4.50 DZ-05 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區(qū)林芝縣林芝鎮(zhèn) 4.91 DZ-06 滇藏方枝柏S. wallichiana西藏自治區(qū)山南地區(qū)5.89 DZ-07 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州道孚縣孔色鄉(xiāng)9.90 DZ-08 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省得榮縣中藏醫(yī)院3.98 DZ-09 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省德欽縣白馬雪山4.32 DZ-10 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省迪慶州德欽縣升平鎮(zhèn)3.53 DZ-11 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏?？》忌锟萍及l(fā)展有限責(zé)任公司3.94 DZ-12 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治區(qū)林芝市林芝縣魯朗鎮(zhèn)4.67 GS-01高山柏S. squamata青海省海南州貴南縣1.91 GS-02高山柏S. squamata四川省甘孜州德格縣藏醫(yī)院1.90 GS-03高山柏S. squamata青海省海東市互助土族自治縣1.91 GS-04高山柏S. squamata青海省藏醫(yī)院1.94 GS-05高山柏S. squamata成都國(guó)際貿(mào)易城中藥材市場(chǎng) (6-1-1158)3.93 GS-06高山柏S. squamata青海省海南州藏醫(yī)院3.91 GS-07高山柏S. squamata青海省黃南州澤庫(kù)縣藏醫(yī)院3.93 GS-08高山柏S. squamata青海省藥材市場(chǎng)（三智） 3.88 GS-09高山柏S. squamata四川省康定市折多山4.16 GS-10高山柏S. squamata云南省德欽縣白馬雪山2.36 GS-11高山柏S. squamata四川省康定市高爾寺山3.70 DG-01大果圓柏S. tibetica西藏自治區(qū)那曲地區(qū)藏藥廠3.73

DG-02大果圓柏S. tibetica西藏自治區(qū)山南地區(qū)3.97 DG-03大果圓柏S. tibetica成都國(guó)際貿(mào)易城中藥材市場(chǎng)（6-1-0725）3.96 DG-04大果圓柏S. tibetica青海省稱多縣藏醫(yī)院4.17 DG-05大果圓柏S. tibetica西藏自治區(qū)山南地區(qū)5.91 DG-06大果圓柏S. tibetica西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司2.99

2 方法

2.1 圓柏?fù)]發(fā)油的提取

取藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）5 g，按《中國(guó)藥典》2020版第四部通則2204揮發(fā)油測(cè)定法甲法提取揮發(fā)油，連續(xù)回流5.0 h，至油量不再增加為止，停止加熱，冷卻，收集揮發(fā)油，加入少許無(wú)水硫酸鈉對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行干燥，并用正己烷稀釋至一定的濃度，用微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2 GC-MS測(cè)定條件

色譜條件：Agilent HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升溫至135 ℃保持0 min，最后以8 ℃/min升至250 ℃，維持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：15～350，離子源溫度200 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，采集模式為全掃描。

2.3 揮發(fā)性成分的鑒定和統(tǒng)計(jì)分析

利用質(zhì)譜庫(kù) NIST14分析圓柏中的揮發(fā)性化合物，通過(guò)查詢CAS號(hào)及相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行解析，對(duì)揮發(fā)性成分中檢測(cè)到的化合物定性，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA分析，并采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品種圓柏藥材的揮發(fā)油含量及揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果

47批圓柏藥材的揮發(fā)油含量在1.85%～9.90%（ml/g）之間，平均值為3.75%，詳見(jiàn)表1。采用GC-MS技術(shù)從圓柏?fù)]發(fā)性成分中共鑒定了66個(gè)化合物，祁連圓柏、香柏、滇藏方枝柏、高山柏、大果圓柏中鑒定化合物的數(shù)量分別為：53個(gè)、62個(gè)、61個(gè)、55個(gè)和54個(gè)，所鑒定的化合物主要為萜類、酯類、醇類、酮類。欖香醇為各品種均含有且平均含量最高的化合物，含量范圍為3.21%～36.1%，平均含量為17.43%。此外，柏木腦、γ桉葉醇、α-桉葉醇、淚杉醇、β-桉葉醇、十氫-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-畢橙茄醇、13-表淚杉醇、(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛為圓柏?fù)]發(fā)油中含量較高的成分，詳見(jiàn)表2。

表2 圓柏的揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 2 Results of volatile composition analysis of Sabinae Ramulus

Ybh-17月桂酸0.06 0.51 0.33 0.44 0.22 0.31 Ybh-18海松-8(14),15-二烯0.08 0.02 0.08 0.02 0.04 0.05 Ybh-19樅醇0.03 1.07 1.31 0.13 0.66 0.64 Ybh-20(+)-γ-Eudesmol0.22 0.16 0.27 0.05 0.29 0.20 Ybh-21palustral0.08 0.65 0.50 0.02 0.35 0.32 Ybh-22正二十一烷- 0.03 0.44 1.29 0.41 0.43 Ybh-23肉豆蔻酸0.11 0.27 0.09 0.15 0.11 0.15 Ybh-24羅漢柏烯1.12 0.82 0.34 0.28 0.98 0.71 Ybh-25(4aS,4bS,10aS)-1,1,4a-三甲基-7-丙-2-基-2,3,4,4b,5,9,10,10a-八氫菲- 0.14 0.22 - 0.05 0.08 Ybh-26(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛0.53 2.89 1.81 - 1.48 1.34 Ybh-27γ-欖香烯0.31 0.16 0.47 0.10 0.86 0.38 Ybh-28 (4aS,4bS,10aS)-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-十二氫-1,1,4a-三甲基-7-(1-甲基亞乙基)-菲0.02 0.11 0.25 - 0.08 0.09 Ybh-29正二十五烷0.18 0.33 0.09 0.41 0.04 0.21 Ybh-30a-桉葉醇3.56 3.85 - 7.18 8.91 4.70 Ybh-31(1E,6E,8S)-1-甲基-5-亞甲基-8-(1-甲基乙基)-1,6-環(huán)癸二烯0.47 0.08 0.08 - 0.40 0.21 Ybh-32二十烷0.25 0.10 0.10 0.26 0.34 0.21 Ybh-33 (1S，4S,4aR)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氫-4-甲基-7-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.08 0.12 0.28 0.02 0.10 Ybh-34依蘭油烯0.13 0.06 0.05 0.03 0.06 0.07 Ybh-35 (4aR,4bS,10aR)-1,2,3,4,4a,4b,5,9,10,10a-十氫-1,4a-二甲基-7-(1-甲基乙基)-1-菲甲醛0.06 0.30 0.30 - 0.12 0.15 Ybh-3613-表淚杉醇1.38 2.44 1.68 0.60 0.74 1.37 Ybh-37(1R，4aR，4bS，7R，10aR)-1,4a，7-三甲基-7-乙烯基-1,2,3,4,4a，4b,5,6,7,9,10,10a-十二烷基氫菲-1-甲醛0.05 0.18 0.30 - 0.09 0.12 Ybh-38α-石竹烯0.07 0.09 0.02 0.03 0.03 0.05 Ybh-392-十三烷酮0.31 - 0.02 0.44 - 0.15 Ybh-40阿爾法姜黃烯0.06 0.23 0.05 0.02 0.03 0.08 Ybh-41正二十六烷0.08 0.11 0.11 0.31 0.22 0.17 Ybh-42T-杜松醇0.88 0.84 1.01 0.62 - 0.67 Ybh-43十二甲基環(huán)六硅氧烷0.02 0.01 0.04 0.06 0.02 0.03 Ybh-44十八烷0.12 0.10 0.02 0.38 - 0.12 Ybh-45棕櫚酸0.02 0.05 0.42 0.17 - 0.13 Ybh-464,7-二甲基-1-丙烷-2-基-1,2,3,4,5,6-六氫萘- 0.02 2.89 0.11 0.02 0.61 Ybh-47十氫-2,7,3,6-二甲烷萘8.09 4.14 1.55 - - 2.76 Ybh-48α-畢橙茄醇2.48 2.69 0.06 0.64 1.60 1.49 Ybh-491,2,4a,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘0.11 0.21 0.10 0.07 0.75 0.25 Ybh-50((1S，4aR，4bR，10aR)-7-異丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10,10a-十氫菲蒽-1-基)甲醇- 0.08 0.08 - 0.05 0.04 Ybh-51十八甲基環(huán)九硅氧烷0.03 0.02 0.02 0.17 0.06 0.06 Ybh-52柳杉二醇- 0.09 4.72 - 0.02 0.97 Ybh-53β-桉葉醇- 4.64 0.01 2.58 - 1.45 Ybh-54植物醇- 0.02 0.10 0.09 - 0.04

Ybh-55十四甲基環(huán)七硅氧烷0.05 0.04 0.02 0.06 0.11 0.06 Ybh-56大根香葉烯D0.15 0.03 0.14 0.08 0.04 0.09 Ybh-57(1R,4aR,4bS,10aR)-1,4a-二甲基-7-丙-2-亞基-3,4,4b,5,6,9,10,10a-八氫-2H-菲-1-甲醛- 0.06 0.02 0.06 0.02 0.03 Ybh-58(-)-氧化石竹烯- 0.02 0.31 0.18 - 0.10 Ybh-59(1S,4S,4aS)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4a,,5-六氫萘- 0.06 - 0.08 - 0.03 Ybh-60(-)-異喇叭烯0.07 0.07 - 0.06 - 0.04 Ybh-611-表三苯酚- - 0.87 0.43 - 0.26 Ybh-62正二十八烷0.05 0.07 0.03 1.06 1.22 0.49 Ybh-631,2,3,4,4a,7-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.04 0.04 - 0.02 0.02 Ybh-64香茅醇0.05 - - 0.10 - 0.03 Ybh-65α-可可烯- - 0.06 0.02 0.05 0.02 Ybh-66γ-馬阿里烯- 0.26 - - 0.04 0.06

3.2 圓柏不同基原藥材的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

3.2.1 PCA和PLS-DA分析 采用SIMCA-P軟件對(duì)所有揮發(fā)性成分（47個(gè)樣品×66個(gè)變量）進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA分析，繪制得分散點(diǎn)圖（圖1）。結(jié)果顯示，圓柏5個(gè)品種的分離效果不佳，大部分樣品重疊。為了突出種間差異，進(jìn)一步進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析。從PLS-DA得分圖（圖2）可知，高山柏和香柏與其它3個(gè)品種有較好的分離，而大果圓柏、滇藏方枝柏與祁連圓柏三者大部分樣品重疊，無(wú)法區(qū)分。這些結(jié)果表明，高山柏和香柏與其它3個(gè)品種的揮發(fā)性成分可能存在差異。此外，根據(jù)變量重要性圖(VIP)找出對(duì)組間差異貢獻(xiàn)較大的變量，并以VIP ＞ 1篩選不同基原圓柏藥材的主要差異成分，結(jié)果共找到32個(gè)潛在的種間差異成分，見(jiàn)圖3。

圖1 圓柏藥材的PCA得分圖Fig. 1 Score plot of PCA of Sabine Ramulus

圖2 圓柏藥材的PLS-DA得分圖Fig. 2 Score plot of PLS-DA of Sabine Ramulus

圖3 圓柏?fù)]發(fā)性成分PLS-DA變量權(quán)重VIP圖Fig. 3 Variable importance plot of PLS-DA of Sabine Ramulus

3.2.2 方差分析 為驗(yàn)證PLS-DA所獲取的分析結(jié)果，采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)圓柏藥材的潛在種間差異成分、揮發(fā)油含量、種間差異成分的總含量進(jìn)行單因素方差分析和Tukey’s多重比較檢驗(yàn)，P＜ 0.05表示差異顯著。結(jié)果表明（圖4），圓柏不同品種間的揮發(fā)油含量不存在顯著性差異，但柳杉二醇、淚杉醇、2-十三烷酮等14個(gè)化合物在種間存在明顯的差異，為圓柏藥材的主要種間差異標(biāo)志物（makers）。此外，本研究進(jìn)一步以這14個(gè)makers的總含量為指標(biāo)進(jìn)行圓柏不同基原藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，高山柏藥材的總含量最低，說(shuō)明其藥材質(zhì)量可能低于其它四種藥材。

圖4 圓柏種間差異成分、揮發(fā)油含量及種間差異成分總含量的方差分析結(jié)果（*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001）Fig. 4 Variance analysis results of the content of the different components,volatile oil and the total contents of the different components among species

4 討論

本研究采用GC-MS技術(shù)從圓柏?fù)]發(fā)性成分中共鑒定出66個(gè)化合物，其中欖香醇、柏木腦、γ桉葉醇、α-桉葉醇、淚杉醇、β-桉葉醇、十氫-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-畢橙茄醇、13-表淚杉醇等為不同基原圓柏?fù)]發(fā)油中共有且含量較高的成分。圓柏?fù)]發(fā)性成分中富含萜類、倍半萜烯醇類化合物，提示其具有較強(qiáng)的抗菌作用[9]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，柏木腦[10-11]對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄桿菌、傷寒沙門氏菌、煙曲霉菌均有良好的抗菌活性。

此外，結(jié)合PCA、PLS-DA及方差分析，本研究首次揭示了圓柏不同品種之間揮發(fā)性成分的差異，最終確定淚杉醇、α-桉葉醇等14個(gè)化合物為圓柏藥材的種間差異成分。據(jù)研究報(bào)道，淚杉醇具有抗遺傳毒性、抗氧化等藥理作用[12-13]；β-欖香烯及其衍生物具有抗腫瘤活性[14]，提示β-欖香烯含氧衍生物欖香醇可能具有抗腫瘤作用；α-桉葉醇具有抗神經(jīng)源性炎癥、抗腫瘤等作用[15-16]，對(duì)腦缺血損傷也具有保護(hù)作用[17]。這些化合物的生物活性與圓柏的功能主治有一定的相關(guān)性。因此，本研究進(jìn)一步以這14個(gè)種間差異成分為指標(biāo)對(duì)圓柏不同基原藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果大果圓柏、香柏、滇藏方枝柏和祁連圓柏?zé)o明顯差異，但高山柏的質(zhì)量可能較差，今后在臨床使用中應(yīng)注意區(qū)分。本研究從揮發(fā)性成分的角度探討了圓柏不同基原藥材的質(zhì)量差異，今后應(yīng)結(jié)合藥理活性進(jìn)行多維評(píng)價(jià)，從而為圓柏藥材的質(zhì)量控制和臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。