余振芳，李云飛，羅 兵，羅心怡，耿東晛

（1.四川省分析測(cè)試服務(wù)中心，四川 成都 610015；2.四川省科學(xué)器材公司，四川 成都 610015）

引言

寄生蟲病每年會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬人患病或死亡，對(duì)人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重影響，這類疾病主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization, WHO） 的數(shù)據(jù)，2021 年僅瘧疾就造成約61.9 萬人死亡[2]，被忽視的熱帶疾?。╪eglected tropical diseases, NTD）包括血吸蟲病、土壤傳播蠕蟲病、非洲錐蟲病、囊蟲病、淋巴絲蟲病等也影響著全球數(shù)百萬人[3]。準(zhǔn)確、快速地診斷寄生蟲感染對(duì)有效防治寄生蟲病至關(guān)重要。然而，由于中低收入國(guó)家缺乏操作熟練的專業(yè)技術(shù)人員和專門的顯微鏡診斷設(shè)備，寄生蟲病的診斷因此受到嚴(yán)重影響[4-6]，導(dǎo)致寄生蟲病難以得到有效管理。

智能手機(jī)給現(xiàn)代社會(huì)帶來了巨大的便利和影響。它是一種先進(jìn)的移動(dòng)電話，具有一些突出的特點(diǎn)，如互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary metal-oxide semiconductor，CMOS）緊湊型數(shù)碼相機(jī)，快速處理器、長(zhǎng)效電池，可全球定位系統(tǒng)導(dǎo)航，互聯(lián)網(wǎng)接入等[5-7]。因?yàn)橹悄苁謾C(jī)具有多個(gè)內(nèi)置傳感器，如成像相機(jī)等，所以研究人員對(duì)開發(fā)不同類型的智能手機(jī)診斷設(shè)備表現(xiàn)出極大的興趣，并取得了一定的研究成果?；谥悄苁謾C(jī)的診斷設(shè)備在資源有限的地區(qū)尤其受到關(guān)注，有望成為用于各種診斷目的的昂貴實(shí)驗(yàn)室儀器的替代品[5,7-8]。但基于智能手機(jī)的診斷設(shè)備在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用仍存在一定問題。本文綜述了智能手機(jī)顯微鏡的硬件開發(fā)及其在診斷寄生蟲病應(yīng)用方面的研究進(jìn)展，討論了它們?cè)谠\斷寄生蟲病中所具有的優(yōu)勢(shì)及面臨的挑戰(zhàn)。

1 基于智能手機(jī)的顯微鏡設(shè)備進(jìn)行寄生蟲病診斷

近年來，有大量研究集中在用于寄生蟲病診斷的各種基于智能手機(jī)的診斷方法和設(shè)備的設(shè)計(jì)及應(yīng)用。借助全球手機(jī)網(wǎng)絡(luò)覆蓋范圍的擴(kuò)大，手機(jī)成像能力和計(jì)算能力的進(jìn)步，可用于診斷寄生蟲病的簡(jiǎn)單、高分辨率的診斷儀器正在快速出現(xiàn)。基于光學(xué)設(shè)置，用于實(shí)現(xiàn)手機(jī)顯微鏡的技術(shù)可分為外部光學(xué)附件技術(shù)、透鏡設(shè)計(jì)分析技術(shù)和片上光學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)3 種，圖1 所示為不同技術(shù)的光學(xué)設(shè)置。

圖1 不同類型移動(dòng)手機(jī)顯微鏡的光學(xué)設(shè)置Fig. 1 Optical set-up for different cell-phone microscopes

1.1 基于外部光學(xué)附件技術(shù)的手機(jī)顯微鏡

目前，大多數(shù)已報(bào)道的手機(jī)顯微鏡設(shè)計(jì)是基于外部光學(xué)附件技術(shù)，通常需要使用額外的硬件。硬件附件通常包括一個(gè)夾子式附件，用于將商用物鏡或低成本透鏡等硬件安裝到手機(jī)上。2009 年，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校研究人員[9]最早采用外部光學(xué)附件技術(shù)將便攜式顯微鏡安裝在手機(jī)上，制成亮視野手機(jī)顯微鏡。光學(xué)附件包含1 個(gè)數(shù)值孔徑（numerical aperture，NA）為0.85、60×消色差物鏡，1 個(gè)廉價(jià)的20×目鏡和白色LED 光源。該手持式顯微鏡系統(tǒng)使用標(biāo)準(zhǔn)物鏡和目鏡來實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)放大，使用手機(jī)攝像頭來代替?zhèn)鹘y(tǒng)顯微鏡系統(tǒng)中的人眼，其在無任何數(shù)字圖像處理技術(shù)下實(shí)現(xiàn)了1.2 μm 的空間分辨率，可用于（瘧疾和鐮狀細(xì)胞樣本的成像（見圖2（a）～（d））。盡管此設(shè)備展示了在瘧疾感染的血涂片的成像和分析中的應(yīng)用，但受系統(tǒng)分辨率的限制，它無法識(shí)別薄涂片中寄生蟲的形態(tài)和物種，并且目鏡的NA 限制了非相干500 nm 波長(zhǎng)光（綠色）的分辨率，因此它必須與標(biāo)準(zhǔn)物鏡結(jié)合使用。雖然可通過使用NA 更高的物鏡來提高圖像質(zhì)量，以實(shí)現(xiàn)薄涂片中瘧原蟲形態(tài)和種類的辨別，但是由于此裝置需要將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡連接在手機(jī)上，導(dǎo)致該裝置很笨重[10-12]。并且由于手機(jī)內(nèi)置鏡頭的直徑小于人眼瞳孔的平均直徑，從而減小了系統(tǒng)的數(shù)值孔徑和可實(shí)現(xiàn)的分辨率。2011 年，Zhu 等[13]開發(fā)了一種基于智能手機(jī)的大視場(chǎng)熒光成像系統(tǒng)，用于分析藍(lán)氏賈第鞭毛蟲囊腫。該系統(tǒng)采用電池驅(qū)動(dòng)的發(fā)光二極管作為光源，用于激發(fā)位于外置透鏡焦點(diǎn)處的樣本，外置透鏡充當(dāng)準(zhǔn)直鏡。相機(jī)聚焦在無限遠(yuǎn)處，將樣本重新成像在傳感器上?；趬嚎s采樣理論對(duì)捕獲的圖像進(jìn)行數(shù)字信號(hào)處理來提高分辨率。該裝置可對(duì)體積超過0.1 mL 的樣本進(jìn)行成像，適用于檢測(cè)和定量血液或其他樣本中的低濃度病原體或稀有細(xì)胞。利用含有標(biāo)記的藍(lán)氏賈第蟲囊腫作為病原體的樣本來探索其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的潛在應(yīng)用。該顯微鏡能夠以高特異性和靈敏度來對(duì)大樣本量快速成像，從而有望成為用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的一種很有前途的工具。2015 年，D’ambrosio 等[14]設(shè)計(jì)了一種智能手機(jī)的視頻顯微鏡，使智能手機(jī)顯微鏡并不局限于靜態(tài)成像。該顯微鏡使用單個(gè)微絲蚴運(yùn)動(dòng)而不是通過分子標(biāo)記或染色形態(tài)學(xué)來計(jì)數(shù)全血樣本中的Loa loa 微絲蚴。統(tǒng)計(jì)分析表明，該方法的假陰性率為千萬分之一，可以忽略不計(jì)[5]。該設(shè)備被稱為Cellscope Loa，它使用一個(gè)反轉(zhuǎn)的iPhone 5s 相機(jī)鏡頭與一個(gè)iPhone 5s 手機(jī)相機(jī)用于成像。在該系統(tǒng)中，反轉(zhuǎn)的相機(jī)鏡頭充當(dāng)物鏡，而相機(jī)鏡頭充當(dāng)筒鏡。樣品放置在物鏡前焦點(diǎn)處，成像于位于筒鏡后焦距處的傳感器上。該設(shè)備使用智能手機(jī)對(duì)未經(jīng)處理的血液樣本進(jìn)行視頻成像，并使用微絲蚴自動(dòng)定量算法對(duì)樣本進(jìn)行分析，最終結(jié)果在2 min 內(nèi)通過應(yīng)用程序顯示出來。與手工計(jì)數(shù)相比，該設(shè)備在33 名潛在Loa loa 感染患者的厚血涂片中顯示出高靈敏度和特異性，表明其具有現(xiàn)場(chǎng)篩查寄生蟲感染的潛在應(yīng)用價(jià)值。雖然該系統(tǒng)具有成本低，視場(chǎng)大，像質(zhì)高的優(yōu)點(diǎn)，但也存在分辨率低等問題。這種智能手機(jī)視頻顯微鏡有可能用于寄生蟲的快速現(xiàn)場(chǎng)診斷，同時(shí)因?yàn)樗鼔虮碚骷纳x的運(yùn)動(dòng)模式，也可用于寄生蟲和寄生蟲幼蟲階段的辨別。2017 年，Bogoch 等[15]介紹了一種基于手機(jī)的血吸蟲感染顯微鏡，并在加納一所農(nóng)村學(xué)校進(jìn)行了測(cè)試。該設(shè)計(jì)采用了一個(gè)3D 打印的光機(jī)附件，并與智能手機(jī)結(jié)合。該附件包括用于樣本均勻照明的2 個(gè)擴(kuò)散片、1 個(gè)定制設(shè)計(jì)的顯微鏡載玻片托盤、1 個(gè)外置透鏡、2 個(gè)作為照射光源的白光發(fā)光二極管以及2 節(jié)用于驅(qū)動(dòng)光源的電池。在該系統(tǒng)中，外置透鏡安裝在距樣本1 倍焦距處，用作準(zhǔn)直鏡。相機(jī)聚焦在無限遠(yuǎn)處，將樣本重新成像到傳感器上。他們還將該設(shè)備與奧林巴斯CX21FS1-5 顯微鏡（10×和20×物鏡）進(jìn)行了性能比較。研究結(jié)果顯示，手機(jī)顯微鏡靈敏度適中。盡管該裝置的靈敏度僅為72.1%，但其特異性和陽性預(yù)測(cè)值為100%，研究中沒有出現(xiàn)假陽性[5,16]。2015 年，Pirnstill 等[17]將手機(jī)制成了高質(zhì)量、低成本的移動(dòng)光學(xué)偏振成像設(shè)備（見圖3（a））。該設(shè)計(jì)是基于暗場(chǎng)顯微鏡和交叉偏振顯微鏡的傳統(tǒng)瘧疾的診斷方法，利用具有雙折射效應(yīng)的瘧色素對(duì)比度增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)瘧疾診斷。瘧色素作為瘧疾生物標(biāo)志物，是瘧原蟲消耗血紅蛋白的結(jié)晶產(chǎn)物，可在受感染的血液樣本中檢測(cè)到不同的數(shù)量。在檢測(cè)瘧疾時(shí)，偏振顯微鏡的檢測(cè)靈敏度大約是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的2 倍。該系統(tǒng)由2 個(gè)偏振片（用于偏振成像）、LED 光源和廉價(jià)的塑料透鏡構(gòu)成的附件組成，通過將塑料透鏡放置在iPhone 背面相機(jī)的焦點(diǎn)處，可實(shí)現(xiàn)40×到100×的放大率。這種配置類似于經(jīng)典的無限共軛顯微鏡設(shè)計(jì)。在該系統(tǒng)中，廉價(jià)的塑料透鏡組件充當(dāng)物鏡，而相機(jī)鏡頭充當(dāng)筒鏡。樣品放置在物鏡前焦點(diǎn)處，則在筒鏡后焦距處重新成像到傳感器上（圖3（b））。然而，由于廉價(jià)塑料透鏡的使用，該設(shè)備的分辨率低于參考臺(tái)式顯微鏡，存在場(chǎng)曲和其他附加像差。該團(tuán)隊(duì)利用這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了瘧疾的亮場(chǎng)和偏振成像（圖3（c）～（d）），研究結(jié)果表明，使用非偏振圖像，在紅細(xì)胞重疊區(qū)幾乎不可能區(qū)分感染的紅細(xì)胞和單個(gè)紅細(xì)胞。而交叉偏振光方法卻能突破這一限制，其圖像可清楚地顯示樣品中瘧色素的存在，其分辨率與參考偏振顯微鏡的圖像相似。但是該系統(tǒng)無法對(duì)早期環(huán)狀滋養(yǎng)體進(jìn)行成像，這是由于瘧色素是在瘧原蟲環(huán)狀體的后期形成[5,12,18]。2019 年，Snow等[19]采用外部光學(xué)附件技術(shù)研制了一種便攜式、經(jīng)濟(jì)高效的熒光顯微鏡，用于現(xiàn)場(chǎng)樣品檢測(cè)。其光學(xué)附件包括1 個(gè)焦距為5 mm 外透鏡、長(zhǎng)通濾波片、LED 光源和用于驅(qū)動(dòng)光源的電池。在該系統(tǒng)中，外透鏡充當(dāng)物鏡用于放大，手機(jī)后置攝像頭充當(dāng)筒鏡將放大的樣本圖像重新成像到傳感器上。他們還開發(fā)了一個(gè)Android 應(yīng)用程序，其將捕獲的圖像發(fā)送到分析服務(wù)器上，以便使用定制圖像處理算法自動(dòng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)圖像上的孢子數(shù)。該程序可在2 min 內(nèi)完成圖像處理，并將孢子計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)送回手機(jī)屏幕上。研究結(jié)果表明，該設(shè)備的檢測(cè)極限計(jì)算為每只蜜蜂0.5×106個(gè)孢子，而陽性感染的孢子濃度極限趨于1×106個(gè)。這種簡(jiǎn)單的寄生蟲計(jì)數(shù)方法可使蜂群免受抗生素過度使用及其相關(guān)負(fù)面影響。但是，它也存在一些局限性，如不能區(qū)分檢測(cè)Nosema 孢子的種類，或無法在其生命周期的任意階段看到寄生蟲的所有形態(tài)以便進(jìn)行更深入的研究。2019 年，Priya 等[20]提出一種新方法，通過一種低成本的離心機(jī)，以125 000 r/min 的速度在1.5 min 內(nèi)分離血液成分，然后用智能手機(jī)顯微鏡對(duì)血樣進(jìn)行顯微成像，從而實(shí)現(xiàn)低成本的瘧疾診斷?；谕獠抗鈱W(xué)附件技術(shù)，將1 個(gè)1 mm 的球透鏡安裝到智能手機(jī)上。在該系統(tǒng)中，球透鏡作為物鏡用于放大，相機(jī)作為筒鏡將樣本重新成像到傳感器上。由于球透鏡的使用，系統(tǒng)捕獲的圖像存在失真、散焦，具有高噪聲比和強(qiáng)度變化。為了提高圖像的質(zhì)量，他們采用OpenCV庫來獲得均勻的背景并采用背景減法運(yùn)算來降低噪聲。但是當(dāng)顏色在特定范圍內(nèi)時(shí)，該軟件會(huì)過濾掉致病細(xì)胞，并在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)不考慮細(xì)胞的大小和形狀。2020 年，Hasselbeck等[21]采用倒置的智能手機(jī)相機(jī)鏡頭和聚焦機(jī)械結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一種基于智能手機(jī)的低成本顯微鏡，用于診斷如瘧疾等疾病。在該系統(tǒng)中，倒置的智能手機(jī)相機(jī)鏡頭安裝在距樣本1 倍焦距處，充當(dāng)準(zhǔn)直鏡，而相機(jī)聚焦在無限遠(yuǎn)處，將樣本重新成像到傳感器上（圖3（b））?；谠撛碓O(shè)計(jì)的手機(jī)顯微鏡的放大倍數(shù)由物鏡的焦距與相機(jī)透鏡焦距之比決定。相比于傳統(tǒng)顯微鏡，由于該系統(tǒng)中使用的2 個(gè)透鏡的焦距在相同的數(shù)量級(jí)，使得其分辨率受到限制，從而可能導(dǎo)致其在特異性和敏感性方面的診斷不太可靠?；诠鈱W(xué)附件技術(shù)設(shè)計(jì)的智能手機(jī)顯微鏡需要在手機(jī)上安裝額外的硬件附件來實(shí)現(xiàn)顯微鏡成像。這種方法的局限性在于此類設(shè)備體形龐大，并且不同手機(jī)型號(hào)需要不同附件[5,10,16]。2021 年，四川省分析測(cè)試服務(wù)中心Yu 等[22]采用外部光學(xué)附件技術(shù)，將手機(jī)制作成一個(gè)大視野明場(chǎng)顯微鏡，用于瘧疾和缺鐵性貧血細(xì)胞樣本的成像（圖4（a）～（c））。該光學(xué)附件包含1 個(gè)微型平場(chǎng)消色差透鏡和1 個(gè)iPhone手機(jī)白屏作為光源。在該成像系統(tǒng)中，外置透鏡作為物鏡用于放大，相機(jī)內(nèi)置透鏡聚作為筒鏡將樣本的像重新成像到傳感器上（圖4（d））。盡管該系統(tǒng)具有對(duì)缺鐵性貧血樣本和瘧疾感染的血涂片樣本進(jìn)行成像和分析的能力，但采用iPhone白屏作為照明光源增加了儀器的成本和重量，并且系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)的分辨率無法識(shí)別瘧原蟲的形態(tài)和種類。因此，需要進(jìn)一步降低成本，提高系統(tǒng)的分辨率以滿足在發(fā)展中國(guó)家現(xiàn)場(chǎng)診斷寄生蟲疾病的需求。

圖2 手機(jī)顯微鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)圖、示意圖和樣本圖Fig. 2 Mobile phone microscope optical structure and sample images

圖3 移動(dòng)手機(jī)偏光顯微鏡的原型、示意圖及樣本圖Fig. 3 Mobile-optical-polarization imaging device prototype and sample images

圖4 手機(jī)顯微成像裝置結(jié)構(gòu)圖、示意圖和樣本圖像Fig. 4 The designed cell-phone based microscope structural diagram and sample images

1.2 基于透鏡設(shè)計(jì)技術(shù)的手機(jī)顯微鏡

基于外部光學(xué)附件技術(shù)設(shè)計(jì)的智能手機(jī)顯微鏡需要一個(gè)定制設(shè)計(jì)的附件，用于將包括標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡或低成本單透鏡等硬件連接到手機(jī)上。當(dāng)需要成像功能和其他高級(jí)功能時(shí)，通常需要將智能手機(jī)連接到具有多個(gè)光學(xué)元件的指定系統(tǒng)，甚至連接到標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡[9]。雖然這種類型的設(shè)計(jì)基本具備了傳統(tǒng)臺(tái)式顯微鏡的全部功能，但往往會(huì)導(dǎo)致成本高，設(shè)計(jì)復(fù)雜。為了避免以上缺點(diǎn)，透鏡光學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)提供了一種相對(duì)簡(jiǎn)單且低成本的替代方案，可產(chǎn)生與其他報(bào)道的基于智能手機(jī)顯微鏡系統(tǒng)相當(dāng)?shù)姆直媛?，即采用將折射元件如球透鏡直接安裝在智能手機(jī)攝像頭上，可獲得一個(gè)強(qiáng)大的手持式顯微鏡，用以識(shí)別寄生蟲（圖1（c））。該光學(xué)系統(tǒng)的空間分辨率和視場(chǎng)（field-of-view，F(xiàn)OV）依賴于透鏡尺寸，較小的透鏡具有較大的空間分辨率，但提供的FOV 較小，反之亦然[6]。2013 年，Bogoch 等[23]通過在智能手機(jī)攝像頭上安裝1 個(gè)3 mm 的球透鏡，構(gòu)建了1 個(gè)手持式顯微鏡，并用它來識(shí)別學(xué)齡兒童尿液和糞便樣本中的土壤傳播蠕蟲和血吸蟲卵（圖5）。他們采用雙面膠將球透鏡臨時(shí)安裝在手機(jī)攝像頭上，并用雙面膠將顯微樣本粘在膠帶上，膠帶上有一個(gè)孔來放置球透鏡。樣本與球透鏡之間的距離大約為1 mm。與傳統(tǒng)顯微鏡相比，該系統(tǒng)取得了中低等的結(jié)果，且產(chǎn)生的圖像質(zhì)量較差，這是由于使用的球透鏡導(dǎo)致了圖像畸形失真。盡管該設(shè)備顯示出中低等的靈敏度和特異性，且FOV 較小，但它確實(shí)是一種廉價(jià)的便攜式顯微鏡。隨著靈敏度的提高，此設(shè)備可滿足發(fā)展中國(guó)家現(xiàn)場(chǎng)診斷土壤傳播蠕蟲疾病的需求[24]。為了進(jìn)一步提高基于透鏡設(shè)計(jì)技術(shù)的智能手機(jī)顯微鏡的分辨率，Switz 等[25]通過在智能手機(jī)的攝像頭上安裝一個(gè)倒置的手機(jī)相機(jī)鏡頭模塊，在大約10 mm2的大視場(chǎng)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分辨率≤5 μm，從而獲得了糞便樣本中土壤傳播蠕蟲卵的高質(zhì)量圖像。寄生蟲卵成圖像的一個(gè)主要問題是它們?cè)谌S平面中的不同焦深處的散射。 Sowerby 等[26]通過在智能手機(jī)攝像頭上安裝一個(gè)12 mm 的雙凸透鏡對(duì)蛔蟲卵進(jìn)行成像，并利用ImageJ 軟件將不同焦深的圖像組合成了擴(kuò)展的復(fù)合景深圖像來解決這個(gè)問題。通過顏色、形狀和大小將蛔蟲卵與其他漂浮物體區(qū)分開來。盡管該系統(tǒng)比傳統(tǒng)顯微鏡揭示的內(nèi)部細(xì)節(jié)更少，但該系統(tǒng)為線蟲卵的單視場(chǎng)復(fù)合景深圖像和早期診斷提供了足夠的分辨率。2018 年，Agbana 等[12]開發(fā)了一種低成本、高分辨率的基于智能手機(jī)的光學(xué)成像設(shè)備，并用它來檢測(cè)Giemsa 染色的細(xì)胞。他們?cè)? 片箔片中安裝一個(gè)球透鏡，并用透明膠帶將其固定在手機(jī)攝像頭上，使用LED 燈作為照明光源。研究表明，采用直徑為0.5 mm 的球透鏡可實(shí)現(xiàn)8.5×放大倍數(shù)，有利于瘧疾寄生蟲的形態(tài)鑒別。雖然該系統(tǒng)具有成本低、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在視場(chǎng)小，圖像質(zhì)量差等問題。Shrestha 等[27]開發(fā)了一種基于智能手機(jī)的顯微鏡，該顯微鏡由一個(gè)直徑為1 mm 藍(lán)寶石球透鏡、球透鏡和手機(jī)攝像頭之間的鋁制安裝板以及白色發(fā)光二極管作為光源組成。該智能手機(jī)顯微鏡可同時(shí)對(duì)蔬菜和水樣本中的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲囊腫進(jìn)行成像和量化。但是該系統(tǒng)存在FOV 和放大率依賴于球透鏡的尺寸，圖像中心區(qū)域比外圍區(qū)域更清晰等問題，這是由于使用藍(lán)寶石球透鏡作為主要成像元件造成的。但基于智能手機(jī)的顯微鏡可作為預(yù)篩查水和蔬菜中的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的一種廉價(jià)的替代工具來替代價(jià)格昂貴，體積龐大的傳統(tǒng)顯微鏡，但其對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲檢測(cè)的特異性需進(jìn)一步提高。綜上，基于外置透鏡技術(shù)的智能手機(jī)顯微鏡具有設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)單、便攜、成本低而且無需持續(xù)供電等特點(diǎn)，這有助于其成為世界上資源受限地區(qū)寄生蟲現(xiàn)場(chǎng)診斷的診斷工具。然而，設(shè)備的成像性能（如分辨率、放大倍數(shù)等）受到透鏡質(zhì)量（如像差）的限制，并且在光路中也很難加入實(shí)現(xiàn)如熒光顯微鏡等功能所需的其他組件[4,10]。

圖5 3 mm 球形透鏡的智能手機(jī)顯微鏡的原理圖與實(shí)物圖[24]Fig. 5 Schematic diagram and prototype of mobile phone microscope using a 3 mm ball lens[24]

1.3 基于片上光學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)的智能手機(jī)顯微鏡

使用傳統(tǒng)物鏡和目鏡的手機(jī)顯微鏡體積龐大且笨重。為了研制一種基于手機(jī)的手持式微型顯微鏡，提出了一種省去諸如傳統(tǒng)透鏡之類的龐大而笨重的光學(xué)元件的全息方法，為手機(jī)顯微鏡提供了一種緊湊而輕便的附件。2010 年，Tseng等[28]采用片上光學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)研制了一種全息顯微鏡用于識(shí)別藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（圖6 所示）。他們使用電池供電的LED 燈垂直照射樣品，對(duì)樣品進(jìn)行部分非相干照明，其中樣品是從側(cè)面機(jī)械加載的。樣品散射和折射的光與未散射的光干涉產(chǎn)生了樣本中每個(gè)細(xì)胞的在線全息圖，然后由嵌入手機(jī)中的傳感器進(jìn)行記錄。再通過迭代全息重建算法獲得樣本的振幅和相位圖像。照相手機(jī)上的傳感器芯片在每個(gè)像素都有濾色器，這種濾色器被稱為拜耳模式，能夠捕捉全息圖的顏色信息。全息顯微鏡出現(xiàn)的問題之一是，并非所有像素在準(zhǔn)單色照明下都能接收到足夠的光，因此會(huì)導(dǎo)致全息圖像的失真。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全息重建之前，他們通過將拜耳圖像轉(zhuǎn)換為單色等效圖像來克服這一問題，實(shí)現(xiàn)了1.5～2.0 μm 的空間分辨率。為了將智能手機(jī)轉(zhuǎn)換成全息顯微鏡，需要對(duì)硬件進(jìn)行重大修改，如定制一個(gè)全息成像平臺(tái)來代替嵌入手機(jī)中的透鏡[6,12,16]?；谄瞎鈱W(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)更緊湊的設(shè)計(jì)，并消除光學(xué)校準(zhǔn)的需求[16,29]。此外，與傳統(tǒng)顯微鏡技術(shù)相比，這種技術(shù)允許FOV 和分辨率之間的關(guān)系解耦，這是由于沒有鏡頭來限制數(shù)值孔徑，從而可在不犧牲系統(tǒng)分辨率的情況下顯著改善成像的視場(chǎng)[6,11,16]。 他們使用該系統(tǒng)對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行成像并檢測(cè)血涂片上是否存在寄生蟲[30]。但所獲圖像無法實(shí)時(shí)查看，通常需要功能強(qiáng)大的臺(tái)式電腦或云端對(duì)獲得的全息圖進(jìn)行計(jì)算，從而將原始全息圖進(jìn)行重建合成轉(zhuǎn)換為顯微圖像[11-12,16,26,31]，并且圖像的空間分辨率受到CMOS傳感器像素大小的限制[32]。更重要的是，此全息顯微鏡需要將樣本直接放置在傳感器上，這需要拆除相機(jī)模塊以移除內(nèi)置鏡頭[6,11-12,16]，使得其在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上制備的樣品和生物組織在成像中的應(yīng)用存在困難，且使用后需要對(duì)傳感器進(jìn)行清潔。這些弊端阻礙了基于片上光學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)的智能手機(jī)顯微鏡在寄生蟲診斷應(yīng)用中的發(fā)展。

圖6 基于手機(jī)的無透鏡全息顯微鏡設(shè)備原理圖及原型[28]Fig. 6 Lens-free on-chip holographic microscope optical setup and prototype [28]

2 討論和展望

調(diào)查了基于智能手機(jī)的顯微鏡在寄生蟲診斷領(lǐng)域的最新發(fā)展和應(yīng)用，探討了它們的優(yōu)勢(shì)、局限性及未來發(fā)展的需求?；谥悄苁謾C(jī)的顯微鏡有可能取代傳統(tǒng)昂貴的實(shí)驗(yàn)室顯微鏡，尤其是在資源有限的地區(qū)或需要快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)各種樣本的地方。基于智能手機(jī)的顯微鏡設(shè)備的主要優(yōu)勢(shì)是成本低，廣泛可用和現(xiàn)場(chǎng)診斷潛力，這非常適用于資源有限地區(qū)的寄生蟲病的有效管理。由于具有足夠的靈敏度且成本低，基于智能手機(jī)的顯微鏡設(shè)備在寄生蟲的初步檢測(cè)中顯示出巨大的潛力。智能手機(jī)顯微鏡設(shè)備成功應(yīng)用的案例包括檢測(cè)瘧疾、血吸蟲和土壤傳播蠕蟲等寄生蟲病，這些疾病對(duì)生活在傳統(tǒng)診斷手段有限的環(huán)境中的人們?cè)斐闪藰O大的危害。盡管智能手機(jī)在光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)展，但在成為實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的商業(yè)替代品之前，它仍然存在一些困難需要去克服，如驗(yàn)證這些設(shè)備的診斷操作特性、耐用性等。盡管存在這些挑戰(zhàn)，智能手機(jī)顯微鏡設(shè)備仍有潛力來滿足寄生蟲病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家的巨大診斷需求。未來的研究有必要探索這些設(shè)備的可用性，尤其是在野外環(huán)境中，它不僅適用于寄生蟲病，也適用于其他微生物疾病的診斷。預(yù)計(jì)在不久的將來，基于智能手機(jī)的顯微鏡診斷設(shè)備將被廣泛采用，用于寄生蟲病的快速診斷。在智能手機(jī)上實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡功能的根本難題之一是在大視場(chǎng)上實(shí)現(xiàn)高分辨率。使用透鏡的智能手機(jī)顯微鏡可以配備常規(guī)顯微鏡中使用的物鏡/目鏡、球透鏡以及倒置手機(jī)相機(jī)透鏡。配備傳統(tǒng)物鏡/目鏡組合的手機(jī)顯微鏡可獲得高分辨率的圖像，但設(shè)備體積龐大，F(xiàn)OV 有限，相比配備球透鏡、倒置手機(jī)相機(jī)透鏡的成本更高。相比之下，配備球透鏡的手機(jī)顯微鏡更便宜、更緊湊，但它們產(chǎn)生的圖像具有顯著的像差，導(dǎo)致圖像質(zhì)量降低。球透鏡和傳統(tǒng)顯微鏡物鏡無法有效地將光線耦合到手機(jī)攝像頭設(shè)計(jì)可接受的廣角視場(chǎng)中。并且采用低成本球透鏡的顯微鏡系統(tǒng)的FOV 有限，這是由于球透鏡產(chǎn)生嚴(yán)重的場(chǎng)曲和球面像差所導(dǎo)致的。另一方面，當(dāng)傳統(tǒng)顯微鏡的目鏡被設(shè)計(jì)用于廣角視場(chǎng)[25]，這種目鏡的NA 限制了非相干綠光的分辨率，因此不能單獨(dú)應(yīng)用，而必須與標(biāo)準(zhǔn)物鏡結(jié)合使用，這導(dǎo)致該組件比球透鏡顯微鏡更為笨重。此外，這些目鏡比球透鏡更貴，最便宜的目鏡可提供的全角視場(chǎng)遠(yuǎn)低于手機(jī)攝像頭可接受的視場(chǎng)。因此，使用物鏡結(jié)合目鏡設(shè)計(jì)的智能手機(jī)顯微鏡獲取的圖像不能覆蓋整個(gè)圖像傳感器，從而降低了FOV。相比之下，倒置的手機(jī)相機(jī)鏡頭與相機(jī)鏡頭本身更匹配，能夠覆蓋整個(gè)圖像傳感器，并能有效地增加FOV。與傳統(tǒng)顯微鏡目鏡相比，手機(jī)相機(jī)鏡頭模塊生產(chǎn)成本更低，像差校正效果更好[11,25]?；谕哥R設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)的智能手機(jī)顯微鏡面臨著分辨率和FOV 之間的權(quán)衡，而無透鏡全息方法可以在較大視場(chǎng)上實(shí)現(xiàn)高分辨率圖像，盡管這需要對(duì)手機(jī)成像硬件進(jìn)行侵入性修改并對(duì)原始全息圖進(jìn)行全息重建獲得樣本圖像，但和只能對(duì)樣本的強(qiáng)度進(jìn)行成像的非相干顯微鏡系統(tǒng)相比，全息成像方法可顯示樣本的振幅和相位信息。但全息方法需要受檢樣本相對(duì)接近圖像傳感器，導(dǎo)致全息方法無法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)載玻片上制備的樣本進(jìn)行成像。雖然研究人員已經(jīng)開發(fā)了一些技術(shù)來增加FOV 和提高分辨率，但進(jìn)一步增加FOV 需要減少限制分辨率的人為因素，如像差等。

智能手機(jī)顯微鏡已成功應(yīng)用于檢測(cè)瘧疾、血吸蟲病和土壤傳播蠕蟲等寄生蟲病。然而，在使用和擴(kuò)大智能手機(jī)顯微鏡技術(shù)之前，仍有幾個(gè)問題需要解決：（1）在實(shí)際應(yīng)用條件下，缺乏對(duì)這些設(shè)備的準(zhǔn)確性及其性能的有限臨床驗(yàn)證，這是智能手機(jī)顯微鏡的主要問題[8]。在過去十幾年里，有許多智能手機(jī)顯微鏡的相關(guān)報(bào)道，但大多數(shù)報(bào)道側(cè)重于顯微鏡的光學(xué)性能和制造方法，而不是評(píng)估這些設(shè)備在現(xiàn)場(chǎng)條件下對(duì)真實(shí)的臨床樣本進(jìn)行測(cè)試的性能。這是由于大多數(shù)的研究都是在控制良好的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的，而不是由在日常公共衛(wèi)生實(shí)踐中使用這些設(shè)備的人在實(shí)際應(yīng)用條件下對(duì)這些設(shè)備進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。如果這些設(shè)備應(yīng)用于少資源地區(qū)，研究人員應(yīng)該充分評(píng)估它們由非技術(shù)人員操作時(shí)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果不在真實(shí)環(huán)境中測(cè)試其應(yīng)用，則無法確定可能存在的缺陷。因此，如果研究目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)用的系統(tǒng)，未來的研究則需要進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用來檢查和驗(yàn)證所開發(fā)系統(tǒng)的功能。（2）與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡非常相似的智能手機(jī)顯微鏡應(yīng)該能夠進(jìn)行廣泛的診斷，而不是僅適用于單一疾病診斷，如瘧疾診斷[12,16]。（3）盡管智能手機(jī)顯微鏡可以成為臺(tái)式顯微鏡的經(jīng)濟(jì)高效且便于使用的替代品，但在資源有限的地區(qū)和現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，樣本的手動(dòng)處理和顯微鏡載波片的制備等問題仍有待解決。（4）智能手機(jī)電池容量有限是其在醫(yī)療設(shè)施中現(xiàn)場(chǎng)布署的一個(gè)主要瓶頸，但這可以通過汽車電池或太陽能的移動(dòng)充電設(shè)備來解決[11]。（5）在大多數(shù)情況下，每種手機(jī)顯微鏡設(shè)計(jì)具有獨(dú)特性，僅針對(duì)特定品牌和型號(hào)的智能手機(jī)，這會(huì)導(dǎo)致定制的附件或平臺(tái)與其他品牌不兼容。這個(gè)問題可能會(huì)限制智能手機(jī)顯微技術(shù)在資源有限地區(qū)的使用及商業(yè)化。因此，需要開發(fā)一種適用于各類智能手機(jī)的附件，附件里放置智能手機(jī)相機(jī)前面的透鏡的位置可以改變。（6）盡管智能手機(jī)顯微鏡可以成為取代臺(tái)式顯微鏡的經(jīng)濟(jì)高效且友好的替代品，但其圖像質(zhì)量使檢測(cè)更加困難。在某些情況下，需要專家來分析詮釋顯微鏡圖像以幫助提高和保證手機(jī)顯微鏡技術(shù)的可用性和質(zhì)量。人們利用手機(jī)互聯(lián)網(wǎng)向寄生蟲學(xué)家和實(shí)驗(yàn)室發(fā)送圖像，然后將這些原始圖像與成像質(zhì)量更好、更清楚的參考圖像進(jìn)行比較，以便能夠快速評(píng)估和反饋。或者使用專門的算法和軟件來自動(dòng)分析圖像，從而提高圖像質(zhì)量和檢測(cè)速度。在某些情況下可使用更簡(jiǎn)單的軟件，如ImageJ 和Photoshop，但在可能的情況下可使用更先進(jìn)的技術(shù)，如MATLAB 或Python 等匯編語言，甚至使用人工智能（artifcial intelligence，AI）[33-35]。開發(fā)自動(dòng)檢測(cè)算法應(yīng)用于診斷寄生蟲，不僅能布署更多經(jīng)驗(yàn)不足的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員來緩解資源有限地區(qū)熟練勞動(dòng)力的短缺，也可以提高寄生蟲檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及提高檢測(cè)速度。近年來，圖像處理技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)已開始被用于于寄生蟲診斷，如瘧疾等?？偠灾?，在資源有限地區(qū)，盡管基本醫(yī)療設(shè)施不足，但利用人工智能開發(fā)寄生蟲自動(dòng)檢測(cè)的專門算法，為智能手機(jī)顯微鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于準(zhǔn)確快速地診斷寄生蟲病提供了可能。

3 結(jié)論

本文主要介紹了基于外部光學(xué)附件、透鏡設(shè)計(jì)和片上光學(xué)設(shè)計(jì)這3 種方法設(shè)計(jì)的智能手機(jī)顯微鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)以及其在寄生蟲診斷領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展，討論了它們的優(yōu)點(diǎn)、局限性及未來發(fā)展的需求。盡管智能手機(jī)顯微鏡已被成功應(yīng)用于檢測(cè)瘧疾、血吸蟲和土壤傳播蠕蟲等寄生蟲病，但在使用和擴(kuò)大智能手機(jī)顯微鏡技術(shù)之前，仍存在一些困難需要克服?；谥悄苁謾C(jī)的顯微鏡診斷設(shè)備的主要優(yōu)勢(shì)是低成本、廣泛可用性和現(xiàn)場(chǎng)診斷潛力，在資源有限的地區(qū)，該設(shè)備非常適用于寄生蟲病的有效管理。作為一項(xiàng)新興技術(shù)，基于智能手機(jī)的顯微鏡設(shè)備面臨著缺乏實(shí)際應(yīng)用條件下的驗(yàn)證、持久性等挑戰(zhàn)。盡管存在這些挑戰(zhàn)，這些設(shè)備仍有滿足寄生蟲病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家的巨大診斷需求的潛力。未來的研究有必要探索這些裝置的有用性，尤其是在野外條件和臨床環(huán)境中驗(yàn)證其檢測(cè)準(zhǔn)確性，使其不僅適用于寄生蟲病，也適用于其他微生物疾病的診斷。預(yù)計(jì)在不久的將來，基于智能手機(jī)的顯微鏡設(shè)備將被廣泛應(yīng)用于寄生蟲病的快速診斷。