付海平, 王 飛, 郇顏強(qiáng), 阿拉木蘇

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院/內(nèi)蒙古大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

目前,結(jié)核病仍然是我國的常見病,每年有近1000萬新發(fā)病例,其中約2%涉及脊柱[1]。中晚期脊柱結(jié)核常伴有嚴(yán)重的后凸畸形,并可能因脊髓受壓而導(dǎo)致癱瘓。如果脊柱結(jié)核能夠在早期得到診斷,并及時(shí)給予定期和足夠的抗結(jié)核藥物治療,則可以阻止這種疾病的進(jìn)展。目前,醫(yī)生對(duì)脊柱結(jié)核的診斷仍主要通過影像學(xué)檢查和對(duì)臨床表現(xiàn)的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)知來實(shí)現(xiàn)。由于脊柱結(jié)核在臨床和影像學(xué)表現(xiàn)上與其他脊柱感染性疾病非常相似,因此準(zhǔn)確診斷脊柱結(jié)核具有挑戰(zhàn)性。近年來,診斷生物標(biāo)志物的研究取得了重大進(jìn)展。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是小的非編碼RNA,根據(jù)與信使RNA(mRNA)的堿基配對(duì),介導(dǎo)mRNA切割、翻譯抑制或mRNA去穩(wěn)定化。miRNAs表達(dá)的改變和隨后其靶基因的失調(diào)已被證明參與結(jié)核的病理生理學(xué)。miRNAs除了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),還以穩(wěn)定的形式存在于體液中,不受內(nèi)源性RNA酶活性的影響。因此,細(xì)胞外miRNAs可能是一種多功能的通訊工具,它們?cè)隗w液中的可及性或在組織中的表達(dá)特征使它們成為潛在的臨床生物標(biāo)志物[2]。本研究的目的是確定與健康對(duì)照相比,脊柱結(jié)核患者外周血中差異表達(dá)的miRNA,并確定這些miRNA在脊柱結(jié)核臨床診斷中的潛在意義。

1 材料與方法

1.1一般資料:自2020年5月至2023年5月,納入本院脊柱骨科收治的50例脊柱結(jié)核患者(實(shí)驗(yàn)組)和30例健康體檢者(對(duì)照組)為研究對(duì)象。其中實(shí)驗(yàn)組男性25例,女性25例,年齡18～77歲,平均年齡(50.47±16.33歲),對(duì)照組男性13例,女性17例,年齡40～72歲,平均年齡(52.39±9.67)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(編號(hào):201913H6Z)。脊柱結(jié)核患者的納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床癥狀(如:盜汗、背痛、乏力等)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查綜合診斷為脊柱結(jié)核患者;②納入研究前未進(jìn)行抗結(jié)核治療;③近期未服用激素或免疫抑制藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):①糖尿病、惡性腫瘤及其他感染性疾病患者;②近期用藥可能引起血常規(guī)值變化的患者;③處于月經(jīng)周期的婦女;④布魯氏菌病等化膿性感染和腰椎病變患者;⑤資料不全或拒絕參與調(diào)查研究的參與者。健康人群納入標(biāo)準(zhǔn):①既往健康,無高血壓等慢性疾病,無糖尿病、惡性腫瘤、結(jié)核病病史,近1個(gè)月內(nèi)未服用免疫激活或抑制藥物;②近兩周內(nèi)無病毒和細(xì)菌感染史;③體檢無異常表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①有活動(dòng)性肺結(jié)核、糖尿病、惡性腫瘤、感染性疾病;②近期服用可能導(dǎo)致血常規(guī)值變化的藥物;③處于月經(jīng)周期的女性;④免疫缺陷疾病或其他免疫系統(tǒng)疾病;⑤參與者信息不完整或拒絕參與調(diào)查。

1.2RNA分離和miRNAs圖譜:在入院后的第2天早晨,從所有受試者的肘靜脈抽取10mL血液,并置于EDTA試管中。在冰箱中于4℃靜置30min后,靜脈血以2500rpm離心5min。使用移液管輕輕提取澄清的上清液(即血漿),然后放入2mL不含酶的冷凍保存管中。立即分離血漿中的miRNAs。使用TRIzol-LS(美國Invitrogen公司)收獲總RNA。在使用NanoDrop 1000通過RNA數(shù)量測量后,使用miRCURY Hy3/Hy5 Power labeling kit(美國Exiqon公司)標(biāo)記樣品,并在miRCURY LNA陣列(v.18.0)(美國Exiqon公司)上雜交。在清洗步驟之后,使用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀(美國Axon Instruments公司)收集數(shù)據(jù)。然后將掃描的圖像導(dǎo)入GenePix Pro6.0軟件(美國Axon Instruments公司)進(jìn)行網(wǎng)格對(duì)齊和數(shù)據(jù)提取。對(duì)復(fù)制的miRNAs進(jìn)行平均,并選擇所有樣品中強(qiáng)度≥ 30的miRNAs用于計(jì)算歸一化因子。標(biāo)準(zhǔn)化后,通過Benjamin Hochberg (BH)將校正P值(q值)設(shè)為q<0.1,將log2倍數(shù)變化(FC)的絕對(duì)值設(shè)為>2,鑒定出兩組間顯著差異表達(dá)的miRNAs。最后,進(jìn)行系統(tǒng)聚類以顯示樣品中可區(qū)分的miRNA表達(dá)譜。

1.3反轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證血清中選定的miRNAs:使用TRIzol-LS從250μL血清中分離總RNA。在RNA分離過程中加入秀麗隱桿線蟲合成miRNA-39-5p(cel-miR-39-5p),用作內(nèi)部對(duì)照。使用miScript Ⅱ RT試劑盒(美國Qiagen公司)將100ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI 7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)上使用All-in-One qPCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司)對(duì)選擇的差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行相對(duì)定量。使用2-△CT方法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)水平,該方法將每個(gè)miRNA相對(duì)于cel-miR-39-5p水平的miRNA表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化。然后從cel-miR-39-5p的Ct值中減去每個(gè)miRNA的重復(fù)分析的Ct值,得到用于進(jìn)一步分析的△Ct值。引物購自美國GeneCopoeia公司。

1.4統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS24.0和GraphPad Prism 9.0進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。采用D'Agostino-Pearson算法進(jìn)行數(shù)據(jù)分布正態(tài)性檢驗(yàn)。使用卡方檢驗(yàn)比較分類變量數(shù)據(jù)組,和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)比較連續(xù)數(shù)據(jù)組。多變量logistic回歸方法建立診斷模型計(jì)算預(yù)測值,Youden's J指數(shù)確定最佳分類閾值。相關(guān)性通過Spearman相關(guān)分析進(jìn)行評(píng)估。雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1脊柱結(jié)核患者和健康人群血清中的MicroRNA微陣列分析:使用miRCURYTM LNA陣列(v.18.0)在10例實(shí)驗(yàn)組患者和10例對(duì)照組健康人群中篩選miRNAs表達(dá)譜。與健康人群相比,在脊柱結(jié)核患者血清中發(fā)現(xiàn)288種miRNAs差異表達(dá)(123種上調(diào),165種下調(diào))(倍數(shù)變化>2,P<0.05)。圖1顯示了健康人群和脊柱結(jié)核患者的差異表達(dá)miRNAs中前20個(gè)上調(diào)和下調(diào)miRNAs。

圖1 健康人群和脊柱結(jié)核患者的差異表達(dá)miRNAs中前20個(gè)上調(diào)和下調(diào)miRNAs。

2.2脊柱結(jié)核患者和健康人群血清樣本中差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證:我們通過RT-qPCR在研究隊(duì)列中驗(yàn)證了10個(gè)選擇的miRNAs的表達(dá)水平,包括5個(gè)上調(diào)的miRNAs(hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-3960、hsa-miR-4722-3p、hsa-miR-5701)和5個(gè)下調(diào)的miRNAs(hsa-miR-493-3p、hsa-miR-4503、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-4796-5p、hsa-miR-323b-3p)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組血清樣本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平顯著上調(diào)(P<0.05),hsa-miR-493-3p水平顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

圖2 脊柱結(jié)核患者和健康人群血清樣本中差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證

2.3在研究隊(duì)列中選擇的候選性miRNAs對(duì)脊柱結(jié)核的診斷性能:隨后,研究選擇hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-493-3p用于構(gòu)建基于miRNAs的脊柱結(jié)核診斷模型(STB模型)。基于3個(gè)選擇的miRNAs的表達(dá)水平作為變量,建立的多元logistic回歸模型如下:0.582+1.055×(hsa-miR-4708-3p)+0.811×(hsa-miR-5100)-0.970×(hsa-miR-493-3p)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組STB模型評(píng)分顯著升高(0.32±0.04vs0.65±0.08,t=6.09,P<0.001)(圖3A)。為了解釋和評(píng)估生物標(biāo)志物,通過Youden的J指數(shù)場確定最佳閾值。當(dāng)臨界值設(shè)置為0.46時(shí),STB模型鑒別脊柱結(jié)核的ROC曲線下面積(AUC)為0.911,靈敏度為88.9%,特異度為77.0%(圖3B)。

圖3 基于miRNAs的脊柱結(jié)核診斷模型(STB模型)的診斷性能分析

2.4實(shí)驗(yàn)室測試的結(jié)果:在實(shí)驗(yàn)檢查指標(biāo)中,比較了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組患者的實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩組在年齡、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而,實(shí)驗(yàn)組患者的紅細(xì)胞沉降率和CRP測定值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見表1。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果比較

2.5STB模型的臨床診斷分析:在實(shí)驗(yàn)組中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果異常和正常劃分,比較STB模型的分布差異。結(jié)果顯示,CRP和紅細(xì)胞沉降率異常的脊柱結(jié)核患者的STB模型評(píng)分顯著高于CRP和紅細(xì)胞沉降率正常的脊柱結(jié)核患者(P<0.05),見表2。相關(guān)性分析顯示,STB模型評(píng)分與CRP、紅細(xì)胞沉降率呈顯著正相關(guān)(r=0.633、0.499,均P<0.001)(圖4)。

表2 STB模型在實(shí)驗(yàn)組臨床表型中的分布

圖4 STB模型評(píng)分與CRP(A)、紅細(xì)胞沉降率(B)的相關(guān)性分析

3 討 論

脊柱結(jié)核是肺外結(jié)核病的一種常見形式,由結(jié)核分枝桿菌引起,通過循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散并局限于骨的血管,導(dǎo)致破壞性骨和關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生[3]。早期癥狀、臨床表現(xiàn)不典型以及病程隱匿是脊柱結(jié)核治療不及時(shí)和嚴(yán)重并發(fā)癥的主要原因。因此早期診斷對(duì)脊柱結(jié)核的治療和預(yù)后具有重要意義。由于缺乏特異、敏感的診斷指標(biāo),導(dǎo)致脊柱結(jié)核患者診治延誤。先前大量研究已經(jīng)證明了血清、血漿或尿液中存在大量miRNA,并且這些miRNA水平可以用作各種疾病的生物標(biāo)志物。在本研究中,我們通過MicroRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)在脊柱結(jié)核患者與健康對(duì)照中存在許多血清差異表達(dá)miRNAs。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組血清樣本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平顯著上調(diào),和hsa-miR-493-3p水平顯著下調(diào)。此外,基于這3個(gè)選擇的miRNAs的表達(dá)水平建立的STB模型具有較好的脊柱結(jié)核診斷性能。這些結(jié)果表明,血清hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p可能是脊柱結(jié)核的潛在生物標(biāo)志物。

近年來,隨著高通量檢測技術(shù)的進(jìn)步,學(xué)者們研究了各種感染性疾病患者的miRNA表達(dá),并取得了許多可喜的成果[4]。Wang等[5]在結(jié)核病患者血清中發(fā)現(xiàn)92個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,其中59個(gè)上調(diào),23個(gè)下調(diào)。Alipoor等[6]發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者血清外泌體中miR-484、miR-425和miR-96的表達(dá)水平顯著增加。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-223、miR-197、let-7和miR-320不僅可以指示感染患者,還可以識(shí)別耐藥患者[7]。然而,目前較少關(guān)于脊柱結(jié)核患者循環(huán)miRNAs的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的研究。Yang等證實(shí)了血漿miRNA-155的表達(dá)及其在脊柱結(jié)核導(dǎo)致椎間盤破壞的發(fā)病機(jī)制中的作用[8]。在目前的研究中,我們使用高通量陣列平臺(tái)在脊柱結(jié)核患者和正常健康人群的血漿樣品中發(fā)現(xiàn)了候選miRNAs。通過qRT-PCR在大樣本隊(duì)列中驗(yàn)證候選miRNAs,并確定了hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p存在差異表達(dá),這與以前研究中的miRNAs不同。我們認(rèn)為脊柱結(jié)核的發(fā)病部位不同于肺結(jié)核;在發(fā)病過程中,參與骨感染、骨形成和骨破壞的病理生理過程的miRNAs會(huì)在血管中滲入血液,引起血漿中循環(huán)miRNAs表達(dá)的變化。此外,這還可能與不同的樣本來源和大小有關(guān)。

先前的研究表明,hsa-miR-4708-3p調(diào)節(jié)人間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成脂分化[9]。miR-5100過表達(dá)已顯示通過靶向PODXL降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲性表型。miR-5100可以靶向并調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號(hào)通路的必需蛋白Dickkopf 1和Smad 7,進(jìn)而增加胃癌細(xì)胞的侵襲性表型[10]。Kisan等[11]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-493-3p可以通過介導(dǎo)YTHDF調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。然而,這些miRNAs在脊柱結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用尚未見報(bào)道。在目前的研究中,我們基于這三個(gè)選定的生物標(biāo)志物開發(fā)了一個(gè)STB特異性診斷模型。性能分析表明,包含三個(gè)miRNA生物特征的診斷模型表現(xiàn)出診斷脊柱結(jié)核的高準(zhǔn)確性。此外,我們進(jìn)一步分析了診斷模型與患者臨床特征的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)模型評(píng)分與紅細(xì)胞沉降率和CRP水平呈正相關(guān)。眾所周知,紅細(xì)胞沉降率和CRP是評(píng)估脊柱結(jié)核患者的重要檢測指標(biāo)。因此,本研究建立的脊柱結(jié)核診斷模型滿足作為診斷標(biāo)記的要求。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p在脊柱結(jié)核患者外周血中有穩(wěn)定的差異表達(dá),包含這三種miRNAs的診斷模型具有較好的脊柱結(jié)核診斷性能。然而,目前關(guān)于這3種miRNAs在脊柱結(jié)核發(fā)病相關(guān)機(jī)制中的作用尚不清楚,需要進(jìn)一步開展機(jī)制研究。此外,由于這項(xiàng)研究收集的樣本量相對(duì)較小,本研究開發(fā)的STB模型需要通過擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。