鐘文雨，黃虹蓉，楊安然，孔怡然，林鐘石

(深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心，廣東 深圳 518000)

0 引言

醫(yī)療器械是指單獨(dú)或者組合使用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品，也包括所需要的軟件[1]，其安全性與人民健康和社會(huì)安全都具有緊密聯(lián)系[2]。一次性醫(yī)療用品大多數(shù)由高分子聚合物即合成樹脂類制作而成[3]，合成樹脂具有許多優(yōu)異的性能，可以制造成塑料假肢、合成樹脂牙等[4]，被廣泛用于醫(yī)療的各個(gè)領(lǐng)域。市面上合成樹脂類一次性醫(yī)療用品種類越來(lái)越豐富，但也大大增加了其與人體暴露的風(fēng)險(xiǎn)。因此，合成樹脂類材料的醫(yī)療器械的臨床前安全性評(píng)價(jià)就尤為重要，選擇適宜的檢測(cè)方法可以有效地縮短醫(yī)療器械的臨床前評(píng)價(jià)研究時(shí)限以及節(jié)省研究成本。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為目前醫(yī)療器械進(jìn)行臨床前安全性評(píng)價(jià)的首選和必選試驗(yàn)項(xiàng)目[5]，其具有研究周期短、敏感性高、節(jié)省經(jīng)費(fèi)的優(yōu)勢(shì)[6]。其中的浸提液實(shí)驗(yàn)是目前較為廣泛的用于檢測(cè)醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性的方法，其定量評(píng)價(jià)方法相對(duì)于定性評(píng)價(jià)方法更具有客觀性。

在GB/T 16886.5—2017 中體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的定量評(píng)價(jià)方法包含中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法[7]。這四種試驗(yàn)方法的機(jī)理存在不同之處，如何按照標(biāo)準(zhǔn)要求來(lái)選擇適宜的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，是目前醫(yī)療器械注冊(cè)前的一大難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GB/T 16886.5—2017 附錄中提供的中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法四種定量試驗(yàn)方法，選擇醫(yī)療領(lǐng)域中使用率較高的PE、PP、PS 和PVC 四種合成樹脂類材料作為代表，評(píng)價(jià)分析合成樹脂類材料在四種不同試驗(yàn)方法下的細(xì)胞毒性結(jié)果的差異性，以此為選擇適宜的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

樣品前處理參照GB/T 16886.12—2017，PE 材料、PP 材料、PS 材料和PVC 材料按照0.2 g/mL 的浸提比例制備樣品浸提液。

1.1 中性紅攝取法

1.1.1 材料

BALB/c 3T3 細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))；DMEM 培養(yǎng)基、新生小牛血清(GIBCO)；乙醇、乙酸(廣州化學(xué)試劑廠)；中性紅染料(SIGMA)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將BALB/c 3T3 細(xì)胞按照1×104個(gè)細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對(duì)照溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液、樣品浸提液。在培養(yǎng)24 h 后，小心棄去原培養(yǎng)液，用100 μL 預(yù)熱的PBS 沖洗后，每孔加入100 μL 的中性紅培養(yǎng)基再孵育3 h。然后棄去中性紅培養(yǎng)基，150 μL PBS沖洗后，每孔再加入150 μL 中性紅洗脫液，在酶標(biāo)儀540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

1.2 集落形成法

1.2.1 材料

V79 細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))；MEM 培養(yǎng)基、胎小牛血清(GIBCO)；吉姆薩染液(珠海貝索)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將V79 細(xì)胞按照100個(gè)細(xì)胞/13 mL 接種在6 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入2 mL 的空白對(duì)照溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液、樣品浸提液。培養(yǎng)6 d 后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗后，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆薩染液染色后，計(jì)算每一孔的集落數(shù)目，并計(jì)算每個(gè)組別的PE 值。

1.3 MTT 比色法

1.3.1 材料

L-929 細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì) 細(xì) 胞庫(kù))；MEM 培 養(yǎng) 基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；

MTT(SIGMA)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將L929 細(xì)胞按照1×104個(gè)細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對(duì)照溶液、陰性對(duì)照浸提液、陽(yáng)性對(duì)照、樣品浸提液，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無(wú)異常后，小心棄去原培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 的MTT 溶液再孵育2 h。然后棄去MTT 溶液，每孔加入100 μL 異丙醇，在酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)(參比波長(zhǎng)650 nm)下測(cè)定光密度并計(jì)算存活率。

1.4 XTT 比色法

1.4.1 材料

L-929 細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì) 胞庫(kù))；MEM 培 養(yǎng)基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；XTT、PMS(SIGMA)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將L929 細(xì)胞按照1×104個(gè)細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對(duì)照溶液、陰性對(duì)照浸提液、陽(yáng)性對(duì)照以及樣品浸提液，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無(wú)異常后，每孔加入50 μL的XTT/PMS 溶液再孵育4 h。振蕩混勻后從每孔取出100 μL 等份液體至新的孔板對(duì)應(yīng)孔中，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)(參比波長(zhǎng)630 nm)下測(cè)定吸光度并計(jì)算存活率。

2 結(jié)果判定條件

以上四種不同定量試驗(yàn)方法，均采用結(jié)果數(shù)值70%為界限判定樣品的細(xì)胞毒性。每種方法對(duì)應(yīng)的測(cè)定條件以及判定條件如表1 所示。

表1 不同方法的細(xì)胞毒性測(cè)定條件及判定

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 種不同的試驗(yàn)樣品分別在四種定量試驗(yàn)方法下測(cè)定細(xì)胞毒性，中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法的細(xì)胞毒性詳細(xì)結(jié)果如表2 所示。

表2 受試樣品在不同實(shí)驗(yàn)方法下的細(xì)胞毒性結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成樹脂類材料在這四種不同實(shí)驗(yàn)方法下，表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性結(jié)果無(wú)顯著性差異，結(jié)果具有一致性。

4 討論

PE 是一種通過(guò)乙烯聚合制備得到的高性能樹脂，由于其優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性以及無(wú)味、無(wú)毒、植入體內(nèi)無(wú)不良影響等優(yōu)勢(shì)，低密度PE 可用于制造薄膜和包裝袋等；高密度PE 則用于制造人工臟器、人工關(guān)節(jié)、矯形外科修補(bǔ)材料等；超高分子量PE 在骨科和心血管植入領(lǐng)域得到普及[8]。PP 是丙烯聚合制備得到的材料，主要用于制造醫(yī)用導(dǎo)管、輸液容器等，也可經(jīng)表面活性劑處理后制成人工肺等[9]。PS 是苯乙烯單體自由基加聚合成而得到的透明、熱塑性合成樹脂[10]，主要用于制造醫(yī)療用瓶、注射器托盤和包裝材料等。PVC 是由氯乙烯在引發(fā)劑作用下聚合而成的熱塑性合成樹脂，具有良好的力學(xué)性能且耐寒、柔軟、透明[11]，主要用于輸血袋、輸液袋、體外循環(huán)裝置導(dǎo)管、鼓泡式氧合袋、尿袋等與人體短期接觸的制品。由此可見，合成樹脂在醫(yī)用耗材、治療性器械、植入性器械等多個(gè)方向都具有不可忽視的地位，因此其臨床前生物安全性評(píng)價(jià)是必不可少的。

通過(guò)細(xì)胞毒性定量檢測(cè)方法，可以客觀地測(cè)量細(xì)胞數(shù)量、蛋白質(zhì)總量、酶釋放、活體染料釋放以及還原等參數(shù)，其靈敏度和判定限都比定性評(píng)價(jià)更高，而且受到試驗(yàn)者個(gè)人主觀因素的影響也更小。然而，定量的試驗(yàn)方法中也各有優(yōu)勢(shì)和不足。中性紅攝取法是檢測(cè)溶酶體完整性，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、高通量的優(yōu)點(diǎn)[6]，但誘發(fā)溶酶體腫脹的物質(zhì)會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果而出現(xiàn)假陰性[12]；集落形成法通過(guò)細(xì)胞增殖能力表現(xiàn)細(xì)胞毒性，這種增殖能力在死細(xì)胞或不再具備分裂能力的細(xì)胞上是喪失的[13-14]，但受實(shí)驗(yàn)操作人員的主觀因素影響較大且耗時(shí)長(zhǎng)；MTT 和XTT 比色法實(shí)驗(yàn)原理相同，都是通過(guò)降解活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶來(lái)反映細(xì)胞毒性[15]，但生成的有色物質(zhì)不同，MTT 比色法產(chǎn)生的甲臜需要通過(guò)裂解細(xì)胞以溶解測(cè)定，XTT比色法減少了人為操作誤差[16]，但XTT 試劑相較于MTT 成本較高，大大增加了試驗(yàn)成本。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)PE、PP、PS、PVC 這四種材料進(jìn)行中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法測(cè)定細(xì)胞毒性，均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，因此這四種樹脂材料選擇任一定量測(cè)定方法均可測(cè)定。但在生產(chǎn)工藝過(guò)程中，原材料需要經(jīng)過(guò)一系列的切割、黏合等操作后才能成為最終產(chǎn)品，這些過(guò)程中也許會(huì)產(chǎn)生新的致使細(xì)胞毒性的物質(zhì)仍未可知。因而，在選擇細(xì)胞毒性的定量試驗(yàn)方法時(shí)，仍然需要根據(jù)產(chǎn)品本身的特性選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。原材料的?xì)胞毒性雖然不能代表生產(chǎn)的最終產(chǎn)品的細(xì)胞毒性，但可以作為優(yōu)化產(chǎn)品的思路，節(jié)省產(chǎn)品研發(fā)成本。