張瑜 王彥宏 劉美

肺癌是癌癥致死的主要原因之一[1]，盡管肺癌的早期診斷與治療等方面已取得了許多進(jìn)展，但仍缺乏有效的早期檢測(cè)和預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，患者5年生存率低，僅為21%[2,3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、遷移、代謝等方面[4]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修飾是真核細(xì)胞中最常見(jiàn)的內(nèi)部RNA修飾機(jī)制，參與調(diào)節(jié)RNA剪接、穩(wěn)定、降解、翻譯等機(jī)制，是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，此過(guò)程發(fā)生異?？蓪?dǎo)致下游基因表達(dá)失調(diào)，影響細(xì)胞功能[5,6]。m6A修飾受“寫(xiě)入”“讀取”“擦除”3個(gè)同源因子的控制，“寫(xiě)入”因子是將甲基添加到m6A修飾位點(diǎn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣（methyltransferase-like,METTL）3、METTL14、METTL16和Wilms腫瘤相關(guān)蛋白等[7,8]，近年來(lái)多項(xiàng)研究[9-11]顯示，m6A甲基化修飾異常在血液系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病以及癌癥等多種疾病中發(fā)揮重要作用。LncRNA THAP7-AS1是一個(gè)天然的反義lncRNA，位于染色體22q11.21，其表達(dá)在胃癌中顯著上調(diào)[12]，目前關(guān)于lncRNA THAP7-AS1在肺癌中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析與體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1影響肺癌進(jìn)展的作用機(jī)制，為肺癌發(fā)展的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2021年1月至2023年1月經(jīng)手術(shù)切除的120例肺癌組織及相應(yīng)癌旁樣本，術(shù)后病理診斷確診為肺癌[13]。其中男性68例，女性52例，年齡44-76（59.74±11.53）歲。研究已獲得甘肅省白銀市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并自愿提供組織樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只SPF級(jí)4周齡健康雄性BALB/c裸鼠，體重（30±5）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（豫）2022-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作均符合3R原則，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：GSCM-20210112。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 SPC-A-1（貨號(hào)：FS-X1751）、NCI-H1299（貨號(hào)：FS-X1698）、LTEP-a-2（貨號(hào)：FS-X1679）、H460（貨號(hào)：A01X890），購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；人肺癌細(xì)胞A549（貨號(hào)：BNCC337696），購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；人正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（貨號(hào)：SNL-203），購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；人腎上皮細(xì)胞293T（貨號(hào)：HEK293T），購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：11965092）、胎牛血清（貨號(hào)：16140063）、鏈霉素/青霉素（貨號(hào)：15070063）、TR Izol試劑（貨號(hào)：15596018）、High-Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：4368813）、鏈霉素親和偶聯(lián)磁珠（貨號(hào)：88817），購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定、包裝與滴度測(cè)定由上海美軒生物科技有限公司負(fù)責(zé)完成；SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（貨號(hào)：RR820A），購(gòu)自大連寶生生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物與內(nèi)參購(gòu)自武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司；熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）試劑盒（貨號(hào)：Bes1001），購(gòu)自廣州伯信生物科技有限公司；MTS試劑盒（貨號(hào)：15711），購(gòu)自西安百螢生物科技有限公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：A003-A008），購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；Matrigel基質(zhì)膠（貨號(hào)：354234），購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；IgG（貨號(hào)：ab172730）、m6A（貨號(hào)：ab286164）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）（1:1000，貨號(hào)：ab68153）、Cullin蛋白4B（CUL4B，1:500，貨號(hào)：ab227724）、大核糖體蛋白P0（ribosomal protein large P0,RPLP0）（1:1000，貨號(hào)：ab192866）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA）（1:1000，貨號(hào)：ab40776）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphoinositide-3 kinase catalytic subunit delta,PI3KCD）（1:1000，貨號(hào)：ab109006）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phospho-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K）（1:200，貨號(hào)：ab182651），購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B,p-AKT）（1:2000，貨號(hào)：4060）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphomammalian target of rapamycin,p-mTOR）（1:1000，貨號(hào)：5536），購(gòu)自美國(guó)CST公司。其他試劑均為市售分析純。

羅氏LightCycler480 II PCR儀購(gòu)自源場(chǎng)芯科技設(shè)備（上海）有限公司；Leica DM4B光學(xué)顯微鏡、徠卡DM1000生物熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；LF-Mini4型小型垂直電泳槽購(gòu)自北京龍方科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇SPC-A-1、LTEP-a-2、A549、NCI-H1299、H460和BEAS-2B細(xì)胞，使用含10%胎牛血清與100 mg/mL鏈霉素/青霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 °C、5% CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞分為NC組（轉(zhuǎn)染NC）、sh-NC組（轉(zhuǎn)染sh-NC）、METTL3組（轉(zhuǎn)染METTL3）、sh-METTL3組（轉(zhuǎn)染sh-METTL3）、THAP7-AS1組（轉(zhuǎn)染THAP7-AS1）、sh-THAP7-AS1組（轉(zhuǎn)染sh-THAP7-AS1）、Vector組（轉(zhuǎn)染NC+sh-NC）和THAP7-AS1+sh-CUL4B組（轉(zhuǎn)染THAP7-AS1+sh-CUL4B），按照分組名稱進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR）檢測(cè)lncRNA THAP7-AS1相對(duì)表達(dá)情況使用TRIzol試劑提取各組組織、細(xì)胞總RNA后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒配制20 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件：95 °C預(yù)變性2 min，95 °C 15 s，60 °C 60 s，循環(huán)40次。表1為引物序列，應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算THAP7-AS1的相對(duì)水平。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.5.3 FISH實(shí)驗(yàn) SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞常規(guī)接種于24孔板內(nèi)的載玻片上，培養(yǎng)24 h后加入4%多聚甲醛固定10 min。加入0.5% Triton X-100通透處理5 min。預(yù)雜交液、雜交液37 °C預(yù)熱30 min后加至載玻片上，置于37 °C環(huán)境中反應(yīng)20 min。雜交液1:50稀釋THAP7-AS1探針，加至載玻片上，37 °C避光過(guò)夜。洗脫未結(jié)合的探針，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）避光反應(yīng)8 min，于熒光顯微鏡下拍照。

1.5.4 甲基化RNA免疫共沉淀（methyl at ed RN Aimmunoprecipitation,meR IP）實(shí)驗(yàn) 取SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞總RNA，以IgG抗體為對(duì)照，目的抗體為m6A，4 °C孵育過(guò)夜。加入蛋白G瓊脂糖珠，4 °C孵育2 h，加入20 mmol/L N6-甲基腺苷5'-單磷酸酯鈉鹽，4 °C洗脫2次，1 h后經(jīng)RNA純化試劑盒純化，qRT-PCR分析m6A富集情況。

1.5.5 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞接種至96孔板上，接種密度2000個(gè)/孔，于培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行MTS檢測(cè)，每孔加入40 μL MTS試劑，避光培養(yǎng)4 h，于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度。

1.5.6 EdU檢測(cè)DNA復(fù)制活性 SPC-A-1、NCI-H1299 NC組、THAP7-AS1組、sh-NC組、sh-THAP7-AS1組細(xì)胞以4000個(gè)/孔的接種密度接種于24孔板中，37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入含EdU工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，4%多聚甲醛固定后加入Triton X-100通透細(xì)胞，加入Click反應(yīng)液，37 °C避光反應(yīng)30 min，加入DAPI染核，37 °C避光反應(yīng)10 min，于熒光顯微鏡下拍照，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.5.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 SPC-A-1、NCI-H1299 NC組、THAP7-AS1組、sh-NC組、sh-THAP7-AS1組細(xì)胞接種至6孔板中，接種密度2000個(gè)/孔，培養(yǎng)10 d。棄去培養(yǎng)基，加入甲醇固定30 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)量。

1.5.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞接種至6孔板中，接種密度1×106個(gè)/孔，觀察細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%，用移液器槍頭作劃痕，清除脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于劃痕后（0 h）和培養(yǎng)24 h時(shí)拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率=（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.5.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠按1:3的比例稀釋，混勻后均勻涂抹于小室上室膜底部，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日置于紫外線燈下照射30 min。各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定進(jìn)入下室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，于光鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞侵襲率=各組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.10 體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn) 20只裸鼠根據(jù)不同腫瘤細(xì)胞平均分為兩部分，每部分根據(jù)細(xì)胞分組名稱分為NC組、THAP7-AS1組，每組5只。于左側(cè)腹部皮下接種各組細(xì)胞，細(xì)胞懸液密度為2×106個(gè)/mL。從接種后1 d起，每4 d測(cè)量一次腫瘤體積，計(jì)算公式：體積=1/2（長(zhǎng)×寬2）。21 d后觀察到接種位置出現(xiàn)明顯腫塊，完整取出腫瘤并稱重。

1.5.11 RNA pull-down實(shí)驗(yàn) SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞加入適量預(yù)冷細(xì)胞裂解液，充分裂解后于4 °C、10,000 rpm條件下離心10 min，上清液即為總蛋白。體外轉(zhuǎn)錄生物素標(biāo)記的THAP7-AS1和反義鏈RNA，經(jīng)純化后分別加入SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞總蛋白與鏈霉親和素磁珠，4 °C孵育過(guò)夜后離心收集磁珠。RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物經(jīng)洗脫、變性、SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行銀染，切取THAP7-AS1與反義鏈RNA之間的差異條帶，經(jīng)消化后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5.12 RIP實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞裂解液裂解SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞，分別加入IgG與CUL4B抗體偶聯(lián)的磁珠，于4 °C環(huán)境下孵育過(guò)夜，加入0.1%十二烷基硫酸鈉和0.5 mg/mL蛋白酶K，于55 °C環(huán)境中孵育30 min去除蛋白質(zhì)。測(cè)定RNA濃度與純度后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)THAP7-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.13 Western blot檢測(cè)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 收集SPC-A-1、NCI-H1299 Vector組、THAP7-AS1組、THAP7-AS1+sh-CUL4B組細(xì)胞，加入適量裂解液裂解后4 °C、10,000 rpm離心10 min，保留上清液，BCA定量后制樣。經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后截取目的條帶，加入封閉液室溫封閉1 h。加入稀釋后的對(duì)應(yīng)一抗孵育液：STAT3（1:1000）、CUL4B（1:500）、RPLP0（1:1000）、PI3KCA（1:1000）、PI3 KCD（1:1000）、p-PI3 K（1:200）、p-AKT（1:2000）、p-mTOR（1:1000），4 °C孵育過(guò)夜。洗膜，加入1:5000稀釋的對(duì)應(yīng)二抗孵育液，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑，避光反應(yīng)5 min后收集熒光成像結(jié)果。

1.5.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0軟件完成，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，分類(lèi)變量比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析THAP7-AS1對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，計(jì)算ROC曲線下面積（area under the curve,AUC）及其95%CI。使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）分析不同THAP7-AS1表達(dá)水平的肺癌患者的生存情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THAP7-AS1在肺癌中表達(dá)上調(diào) 從本研究收集到的組織中隨機(jī)選擇了10例肺癌與2例癌旁組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA微陣列分析，結(jié)果顯示，肺癌組織中有425個(gè)lncRNA顯著下調(diào)，989個(gè)lncRNA顯著上調(diào)（折疊變化＞2.0、P＜0.05）。根據(jù)折疊變化≥5、P＜0.05、與癌旁組織相比表達(dá)水平明顯上調(diào)3個(gè)條件進(jìn)一步篩選出LOC100133669與THAP7-AS1兩個(gè)候選lncRNA。qRT-PCR檢測(cè)全部120對(duì)肺癌與癌旁組織，結(jié)果顯示肺癌組織中THAP7-AS1水平較癌旁組織顯著上調(diào)（P＜0.05），因此本研究著重探索THAP7-AS1在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。與正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、LTEP-a-2、A549、NCI-H1299、H460細(xì)胞THAP7-AS1表達(dá)量均上調(diào)（P＜0.05），SPC-A-1與NCI-H1299細(xì)胞中THAP7-AS1 mRNA水平最高，因此選擇SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THAP7-AS1位于SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。見(jiàn)圖1、2。

2.2 THAP7-AS1與肺癌診斷、預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)120對(duì)肺癌與癌旁組織THAP7-AS1表達(dá)水平評(píng)價(jià)THAP7-AS1對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，繪制ROC曲線，其AUC值為0.737（95%CI: 0.608-0.847,P＜0.05），提示THAP7-AS1對(duì)肺癌具有一定的診斷價(jià)值。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析結(jié)果顯示，THAP7-AS1高表達(dá)的肺癌患者總生存率較低（P＜0.05）。以THAP7-AS1表達(dá)的平均值將肺癌患者分為低表達(dá)組與高表達(dá)組，年齡、性別、吸煙、組織學(xué)類(lèi)型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度與肺癌組織THAP7-AS1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），腫瘤大小、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺癌組織THAP7-AS1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 THAP7-AS1與肺癌診斷、預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系。A：ROC曲線評(píng)價(jià)THAP7-AS1對(duì)肺癌的診斷價(jià)值；B：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)不同THAP7-AS1水平患者生存分析結(jié)果。Fig 3 Relationship between THAP7-AS1 and diagnosis,prognosis and clinicopathological features of lung cancer.A: The diagnostic value of THAP7-AS1 in lung cancer evaluated by ROC curve;B: Results of survival analysis of patients with different THAP7-AS1 levels in Kaplan-Meier Plotter database.ROC: receiver operating characteristic;AUC: area under the curve.

表2 THAP7-AS1表達(dá)水平與肺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系Tab 2 Relationship between THAP7-AS1 expression level and clinicopathological features in patients with lung cancer

2.3 METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強(qiáng)THAP7-AS1表達(dá) 使用SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)THAP7-AS1序列中的m6A修飾位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)位點(diǎn)。meRIP、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，THAP7-AS1中存在m6A修飾，過(guò)表達(dá)或下調(diào)METTL3可顯著提高或抑制SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞中THAP7-AS1的表達(dá)水平，肺癌組織中METTL3水平較癌旁組織顯著上調(diào)（P＜0.05），THAP7-AS1表達(dá)水平與MEL3表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.4639,P＜0.0001）。見(jiàn)圖4。

圖4 METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強(qiáng)THAP7-AS1表達(dá)。A：m6A修飾的THAP7-AS1位點(diǎn)3、5在SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞中富集；B：qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)METTL3對(duì)SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞THAP7-AS1表達(dá)水平變化；C：qRT-PCR檢測(cè)120對(duì)肺癌與癌旁組織THAP7-AS1表達(dá)情況；D：肺癌組織THAP7-AS1與METTL3表達(dá)水平的相關(guān)性分析。*P＜0.05。Fig 4 METTL3-mediated m6A modification enhances THAP7-AS1 expression.A: THAP7-AS1 sites 3 and 5 modified by m6A were enriched in SPC-A-1 and NCI-H1299 cells;B: qRT-PCR detection of overexpression or down-regulation of METTL3 on the expression of THAP7-AS1 in SPC-A-1 and NCI-H1299 cells;C: The expression of THAP7-AS1 in 120 pairs of lung cancer and normal tissues was detected by qRT-PCR;D: Analysis of correlation between THAP7-AS1 and METTL3 expression in lung cancer.METTL3: methyltransferase-like 3.*P＜0.05.

2.4 THAP7-AS1在體內(nèi)外促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 MTS、EDU、克隆形成、劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞NC組、sh-NC組相比，THAP7-AS1組增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力提高（P＜0.05），sh-THAP7-AS1組增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力下降（P＜0.05）。體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞NC組相比，THAP7-AS1組腫瘤生長(zhǎng)速度提升，體積、質(zhì)量增大（P＜0.05）。見(jiàn)圖5-7。

圖5 THAP7-AS1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖。A：構(gòu)建SPC-A-1、NCI-H1299 THAP7-AS1過(guò)表達(dá)與沉默穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖率；B：EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性（×200）；C：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。*：與NC組相比，P＜0.05；#：與sh-NC組相比，P＜0.05。Fig 5 THAP7-AS1 promotes the proliferation of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and to detect the cell proliferation rate by MTS;B: Detection of DNA replication activity of cells by EdU assay (×200);C:Colony formation assay to detect the ability of cell clone formation.OD: optical delnsity.*: Compared with NC group,P＜0.05;#: Compared with sh-NC group,P＜0.05.

圖6 THAP7-AS1促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲。A：構(gòu)建SPC-A-1、NCI-H1299 THAP7-AS1過(guò)表達(dá)與沉默穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力（×100）；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力（×200）。*：與NC組相比，P＜0.05；#：與sh-NC組相比，P＜0.05。Fig 6 THAP7-AS1 promotes migration and invasion of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and detection of cell migration ability by wound scratch assay (×100);B: Transwell assay to detect the invasive ability of cells (×200).*: Compared with NC group,P＜0.05;#: Compared with sh-NC group,P＜0.05.

圖7 THAP7-AS1增強(qiáng)肺癌細(xì)胞成瘤能力。A：構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)THAP7-AS1的SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞株，體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤圖片；B：移植瘤體積檢測(cè)結(jié)果；C：移植瘤質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果。*P＜0.05。Fig 7 THAP7-AS1 enhances the tumorigenicity of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and tumor pictures of xenotransplantation in vivo;B: Results of volume measurement of transplanted tumor;C: Results of quality measurement of transplanted tumor.*P＜0.05.

2.5 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B啟動(dòng)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲 通過(guò)RNA下拉實(shí)驗(yàn)與質(zhì)譜分析鑒定THAP7-AS1的蛋白質(zhì)復(fù)合體，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量約為100 kDa、肽評(píng)分＞100、相關(guān)研究顯示參與腫瘤進(jìn)展三個(gè)條件篩選出2個(gè)潛在的結(jié)合蛋白：CUL4B和STAT3。蛋白質(zhì)組學(xué)分析、RIP檢測(cè)結(jié)果顯示，CUL4B與THAP7-AS1存在特異結(jié)合。MTS、劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞Vector組相比，THAP7-AS1組增殖、遷移、侵襲能力升高（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞Vector組相比，THAP7-AS1組PI3KCA、PI3KCD、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖8-10。

圖8 THAP7-AS1特異性結(jié)合蛋白篩選驗(yàn)證。A：THAP7-AS1蛋白質(zhì)復(fù)合體銀染實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：蛋白質(zhì)組學(xué)Western blot驗(yàn)證結(jié)果；C：RIP檢測(cè)CUL4B與THAP7-AS1結(jié)合情況。Fig 8 Screening and verification of THAP7-AS1 specific binding protein.A: Silver staining of the THAP7-AS1-protein complex;B: Results of proteomic Western blot verification;C: Detection of the combination of CUL4B and THAP7-AS1 by RIP assay.CUL4B: Cullin 4B; STAT3: signal transducers and activators of transcription 3;RPLP0: ribosomal protein large P0;RIP: RNA-immunoprecipitation.

圖10 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B啟動(dòng)PI3K/AKT信號(hào)通路。SPC-A-1（A）、NCI-H1299（B）THAP7-AS1過(guò)表達(dá)與沉默CUL4B穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，Western blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。*P＜0.05。Fig 10 THAP7-AS1 combined with CUL4B to initiate PI3K/AKT signal pathway.Overexpression of SPC-A-1 (A) and NCI-H1299 (B) THAP7-AS1 and silencing of CUL4B stably expressed cell lines,Western blot detected the expression of proteins related to PI3K/AKT signal pathway.PI3KCA:phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha;PI3KCD: phosphoinositide-3 kinase catalytic subunit delta;p-PI3K:phospho-phosphatidylinositol 3-kinase;p-AKT: phospho-protein kinase B;p-mTOR: phospho-mammalian target of rapamycin.*P＜0.05.

2.6 METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肺癌發(fā)生的具體作用機(jī)制 綜合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA THAP7-AS1在肺癌組織與細(xì)胞系中表達(dá)升高，對(duì)肺癌具有一定的診斷價(jià)值，其表達(dá)水平與患者總生存率、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。THAP7-AS1被SP1轉(zhuǎn)錄激活，經(jīng)METTL3介導(dǎo)m6A修飾后穩(wěn)定表達(dá)，通過(guò)與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，其可能的作用機(jī)制見(jiàn)圖11。

圖11 METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肺癌發(fā)生的具體作用機(jī)制Fig 11 Specific mechanism of METTL3-mediated upregulation of m6A modified lncRNA THAP7-AS1 expression in promoting lung carcinogenesis.

3 討論

研究[14]表明，多種lncRNA參與調(diào)節(jié)肺癌病理生理過(guò)程。LncRNA PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1軸通過(guò)抑制β-TrCP1介導(dǎo)的β-catenin蛋白的泛素化降解，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌中腫瘤干細(xì)胞的維持，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15]。LncRNA ABHD11-AS1存在m6A修飾位點(diǎn)，METTL3介導(dǎo)m6A修飾誘導(dǎo)lncRNA ABHD11-AS1增強(qiáng)NCI-H1299、NCI-H1650細(xì)胞增殖能力與瓦博格效應(yīng)[16]。Liu等[12]的研究表明，lncRNA THAP7-AS1由特異性蛋白1激活表達(dá)，并由METTL3通過(guò)“閱讀器”蛋白胰島素樣生長(zhǎng)因子II mRNA結(jié)合蛋白1依賴的途徑介導(dǎo)m6A修飾實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定，激活下游PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)胃癌發(fā)展。本研究通過(guò)lncRNA微陣列分析篩選肺癌組織與正常肺組織中差異表達(dá)的lncRNA，結(jié)果顯示，lncRNA THAP7-AS1在肺癌組織中呈高表達(dá)。ROC曲線提示lncRNA THAP7-AS1對(duì)肺癌具有一定的診斷價(jià)值，其表達(dá)水平與患者總生存率、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測(cè)lncRNA THAP7-AS1的異常表達(dá)能夠影響肺癌發(fā)展。METTL3在催化m6A修飾過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)地位，其水平變化可影響m6A修飾RNA甲基化進(jìn)程[17]。結(jié)合SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析結(jié)果、meRIP、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THAP7-AS1存在m6A修飾，過(guò)表達(dá)或下調(diào)METTL3可影響SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞THAP7-AS1表達(dá)，且METTL3在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其水平與THAP7-AS1表達(dá)水平呈正相關(guān)，推測(cè)METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強(qiáng)THAP7-AS1表達(dá)。

為了進(jìn)一步探究THAP7-AS1在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)與沉默THAP7-AS1的SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞株。各項(xiàng)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)THAP7-AS1增強(qiáng)了SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，而降低THAP7-AS1表達(dá)后，SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞惡性生物學(xué)行為明顯受到抑制；體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)THAP7-AS1增強(qiáng)了SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞的成瘤能力，推測(cè)THAP7-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞SPC-A-1、NCI-H1299生長(zhǎng)、遷移具有促進(jìn)作用。LncRNA通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用參與分子調(diào)控，推測(cè)THAP7-AS1可能與某些蛋白存在相互作用，調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的惡性表型。經(jīng)RNA下拉實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析與RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，THAP7-AS1與CUL4B存在特異結(jié)合。CUL4B是Cullin 4B-RING E3連接酶復(fù)合體中的一種支架蛋白，通過(guò)功能性核定位信號(hào)及其與核輸入受體蛋白的相互作用在細(xì)胞核內(nèi)積聚，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮致癌作用[18,19]。MTS、劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)THAP7-AS1的同時(shí)抑制CUL4B表達(dá)可降低THAP7-AS1對(duì)SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的促進(jìn)效果。PI3K/AKT信號(hào)通路參與多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面，其相關(guān)分子在肺癌中異常表達(dá)[20,21]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞THAP7-AS1組PI3KCA、PI3KCD、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平較Vector組升高，而THAP7-AS1+sh-CUL4B組蛋白表達(dá)水平與Vector組無(wú)明顯差異，推測(cè)THAP7-AS1與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)SPC-A-1、NCI-H1299細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移。

綜上所述，lncRNA THAP7-AS1在肺癌中高表達(dá)，對(duì)肺癌具有一定的診斷價(jià)值，其表達(dá)水平與患者總生存率、不良臨床病理特征有關(guān)，通過(guò)METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定表達(dá)，與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展，具有成為肺癌新的生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)的價(jià)值。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Zhang Y and Wang YH conceived and designed the study.Zhang Y,Wang YH and Liu M performed the experiments.Wang YH and Liu M analyzed the data.Liu M contributed analysis tools.Zhang Y,Wang YH and Liu M provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.