余 越, 王思月, 郭文通, 姚改芳, 張 華, 胡康棣

(合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,食品生物技術(shù)系植物采后貯藏生理研究所, 合肥 230009)

番茄是我國(guó)廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物,它的果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,色澤誘人,因此,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。又因其遺傳背景清晰,生命周期短和獨(dú)特的成熟表型,是研究植物生長(zhǎng)和果實(shí)成熟衰老的模式生物。番茄果實(shí)的成熟是復(fù)雜有序的生理生化過(guò)程,伴隨著果實(shí)軟化、風(fēng)味和氣味的變化、葉綠素分解和類胡蘿卜素積累等過(guò)程[2],也是果實(shí)品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期[3]。番茄果實(shí)的成熟也是一個(gè)受基因調(diào)控的程序化過(guò)程,因此,關(guān)于番茄成熟的機(jī)制研究離不開(kāi)對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究[4-5]。

含有高度保守的色氨酸(tryptophan, W)精氨酸(arginine, R)賴氨酸(lysine, K)酪氨酸(tyrosine, Y)甘氨酸(glycine, G)谷氨酸胺(glutamine, Q)賴氨酸(lysine, K)(WRKYGQK)序列的轉(zhuǎn)錄因子被命名為WRKY,它是廣泛分布在植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,并且在許多生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用,包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]、果實(shí)發(fā)育[7]、葉片衰老[8]以及生物和非生物脅迫[9]等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子均含有1個(gè)高度保守的約60個(gè)氨基酸的WRKY結(jié)構(gòu)域,N-端包含WRKYGQK保守序列,在C-端具有鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域[10]。研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子中的W-BOX順式作用元件精確結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用[11]。W-BOX的DNA序列為(C/T)TGAC(T/C),其中TGAC為核心序列,任何一個(gè)堿基發(fā)生突變都會(huì)影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子和其下游靶基因的結(jié)合效應(yīng)[12]。除此之外,WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以通過(guò)直接結(jié)合自身或者其它WRKY的啟動(dòng)子序列來(lái)實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)和相互調(diào)節(jié)。

大量研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在種子休眠與發(fā)芽,胚胎后形態(tài)發(fā)生,葉片衰老以及果實(shí)成熟等植物特異性生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。康乃馨中DcWRKY33通過(guò)激活參與乙烯和脫落酸生物合成的相關(guān)基因,以及康乃馨中ROS的積累從而促進(jìn)花瓣衰老[13]。香蕉中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子MaWRKY49,通過(guò)調(diào)節(jié)水果軟化相關(guān)基因的表達(dá)在乙烯誘導(dǎo)的水果成熟中發(fā)揮作用,在香蕉果實(shí)中的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MaWRKY49可以加速果實(shí)成熟進(jìn)程[14]。研究表明,SlWRKY37作為茉莉酸信號(hào)通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SlMYC2的下游靶基因,通過(guò)調(diào)控SlWRKY53和SlSGR1的表達(dá),從而調(diào)控番茄植株葉片衰老[15]。在擬南芥中,AtWRKY53可以通過(guò)結(jié)合W-box而激活衰老相關(guān)基因SAG12和ORE9的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)葉片的衰老[16],AtWRKY71通過(guò)直接激活A(yù)CS2和EIN2等基因的表達(dá),正調(diào)控乙烯合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而促進(jìn)葉片的衰老[17]。另一項(xiàng)研究表明,在番茄基因組中包含的81個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員,有25個(gè)可能與果實(shí)成熟衰老進(jìn)程相關(guān),例如WRKY17、WRKY31、WRKY35和WRKY53等[18]。這導(dǎo)致發(fā)掘與解析參與番茄果實(shí)成熟衰老進(jìn)程的WRKY家族成員及其功能的研究愈發(fā)受到關(guān)注。

本文對(duì)于SlWRKY53b基因在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中的功能展開(kāi)研究,期望對(duì)番茄果實(shí)成熟的調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 WRKY家族進(jìn)化樹(shù)分析及氨基酸序列對(duì)比

為研究SlWRKY53b的功能,利用Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網(wǎng)站下載得到26條WRKY蛋白質(zhì)序列。并利用MEGA 7.0進(jìn)化樹(shù)分析工具構(gòu)建這些基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),從中挑選出和SlWRKY53b親緣較為接近的基因:ZmWRKY41、AtWRKY41、AtWRKY53以及SlWRKY30等,利用Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),對(duì)它們的保守域序列進(jìn)行分析。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)

稱取不同番茄(Solanumlycopersicum)新鮮組織各0.5 g,于冷凍條件下均勻研磨成粉末,利用RNA提取試劑盒提取組織RNA后立即經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。將適宜濃度的番茄RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并保存于-20 ℃。PCR擴(kuò)增的程序按照預(yù)變性溫度:95 ℃,變性溫度:94 ℃ 15 s,退火溫度:60 ℃ 15 s,延伸溫度:72 ℃ 20 s,共計(jì)45個(gè)循環(huán)。基因表達(dá)水平用2-ΔΔCT算法進(jìn)行計(jì)算,并對(duì)SlTubulin(Solyc08g006890)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 SlWRKY53b-TRV2基因沉默果實(shí)的構(gòu)建

參照Fu等[19]方法,構(gòu)建SlWRKY53b-TRV2載體,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。同時(shí),將實(shí)驗(yàn)室原有TRV1和TRV2農(nóng)桿菌活化,培養(yǎng)至A600=0.6-0.8。離心去上清,用含10 mmol/L MES和20 μmol/L AS的侵染緩沖液重懸稀釋至合適的A范圍,并于室溫條件下孵育4 h。將TRV1和SlWRKY53b-TRV2的侵染液按照1∶1(V/V)的比例混勻,并利用果柄注射法進(jìn)行侵染。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的空白對(duì)照組為TRV1和TRV2空載共同侵染。將侵染后的番茄植株于16 ℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h后,移至16 h光照/8 h黑暗光周期下繼續(xù)培養(yǎng),觀察對(duì)照組和SlWRKY53b-TRV2實(shí)驗(yàn)組成熟進(jìn)程的差異。

1.4 番茄果實(shí)中葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定

將不含種子的番茄果實(shí)樣品于冷凍條件下均勻研磨成粉末,用92%乙醇提取樣品中的色素,利用酶標(biāo)儀對(duì)樣品中的葉綠素和類胡蘿卜素的含量進(jìn)行測(cè)定[20]。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn),各實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。利用SPSS statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P<0.01代表極顯著差異,P<0.05表示顯著差異,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel軟件制圖分析。

2 結(jié)果

2.1 WRKY家族進(jìn)化樹(shù)分析及氨基酸序列對(duì)比

通過(guò)Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網(wǎng)站BLAST得到26條WRKY蛋白質(zhì)序列并使用MEGA 7.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),結(jié)果正如Fig.1A所示?？梢钥闯?SlWRKY53b和SlWRKY30、ZmWRKY69、AtWRKY30等轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化關(guān)系上表現(xiàn)出較高的同源性。同時(shí),本文將這些親緣關(guān)系比較接近的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì),結(jié)果表明,這8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均具有1個(gè)C2H2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。由于它們進(jìn)化關(guān)系的相似性,推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子具有類似的生物學(xué)功能。

Fig.1 Bioinformatics analysis of SlWRKY53b (A) Phylogenetic evolutionary tree of WRKY genes from different species and SlWRKY53b is boxed in red. (B) Analysis of amino acid sequences and peptide derivative sequences of WRKY genes

2.2 SlWRKY53b基因的表達(dá)模式分析

由Fig.2結(jié)果顯示,在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中,SlWRKY53b的表達(dá)水平整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在未成熟的青果中SlWRKY53b的表達(dá)量處于一個(gè)較低的水平,而在破色期和紅熟期的果實(shí)中表達(dá)量大幅上升,推測(cè)SlWRKY53b可能參與番茄果實(shí)成熟的過(guò)程。

Fig.2 The transcript level of SlWRKY53b in different tissues Total RNA was isolated from immature green fruit (IMG), fruit mature green (MG), breaker fruit (BR) and fruit red ripe (RR). The relative expression of SlWRKY53b in different tissues were determined using real-time quantitative reverse transcription PCR. The data are expressed as the means of three biological replicates ± SD. Statistical analysis was carried out with one-way ANOVA, and significance was marked with different letters (P<0.05)

2.3 基因沉默SlWRKY53b抑制番茄果實(shí)成熟

為研究SlWRKY53b在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中行使的具體功能,本文構(gòu)建了SlWRKY53b基因沉默番茄果實(shí),在侵染后的第20 d以及第25 d,觀測(cè)到明顯表型,結(jié)果正如Fig.3A所示。

Fig.3A顯示,SlWRKY53b的沉默導(dǎo)致番茄果實(shí)較空載侵染的果實(shí)相比成熟延緩。在農(nóng)桿菌侵染番茄果實(shí)20 d時(shí),對(duì)照組番茄果實(shí)已變?yōu)辄S色,而實(shí)驗(yàn)組番茄果實(shí)仍處于白熟期。在侵染后的第25 d,對(duì)照組番茄果實(shí)進(jìn)入紅熟期,而實(shí)驗(yàn)組番茄果實(shí)仍呈黃色。為了證明VIGS成功沉默了SlWRKY53b,通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組番茄果實(shí)中SlWRKY53b的表達(dá)含量,結(jié)果正如Fig.3B所示,侵染后的第20 d和第25 d,SlWRKY53b在對(duì)照組中的表達(dá)量分別為:1.0021和1.0356,在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量分別為:0.7211和0.2656,說(shuō)明SlWRKY53b的表達(dá)量在兩個(gè)階段均下調(diào),且在侵染后的第25 d沉默效果更加顯著(P<0.01)。這些結(jié)果表明,沉默SlWRKY53b可延緩番茄果實(shí)成熟,SlWRKY53b可能在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

2.4 基因沉默SlWRKY53b延緩番茄果實(shí)類胡蘿卜素的積累并抑制葉綠素的降解

番茄果實(shí)的成熟過(guò)程中,果實(shí)中的葉綠素和類胡蘿卜素的含量也會(huì)隨之變化。本文測(cè)定了對(duì)照組果實(shí)及SlWRKY53b基因沉默番茄果實(shí)中葉綠素和類胡蘿卜素的含量,同時(shí)用比色計(jì)對(duì)番茄果皮的顏色差異進(jìn)行了分析,結(jié)果正如Fig.4所示。

Fig.4 Effects of transient silencing of SlWRKY53b on pigment contents in the tomato fruit and color difference of fruit peel (A-D) Contents of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C), carotenoids (D) in the control and SlWRKY53b-silenced fruits at 20 and 25 days post inoculation. (E-H) Analysis results of color difference meters for the control (TRV2) and SlWRKY53b-silenced fruits (L* represents the change of lightness and darkness; a* represents the change of red and green; b* represents the change of yellow and blue). The data are expressed as the means of three biological replicates ± SD. The symbols ** and * indicate P< 0.01 and P< 0.05, respectively

由Fig.4A,B,C,D可以看出,整體而言,隨著侵染時(shí)間的推移,葉綠素的含量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),而類胡蘿卜素的含量則呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)中的葉綠素a含量高于對(duì)照組,其含量在侵染后的第20 d幾乎為對(duì)照組的2倍(P<0.01),葉綠素b以及總?cè)~綠素的含量也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。侵染后的第20 d和第25 d,SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的含量(0.1308和0.2438)均低于對(duì)照組番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的含量(0.2603和0.2992)。這些結(jié)果表明,瞬時(shí)沉默SlWRKY53b可以減緩番茄果實(shí)中葉綠素的降解,減少果實(shí)中類胡蘿卜素的積累,從而達(dá)到延緩番茄果實(shí)成熟的效果。

SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)以及對(duì)照組果實(shí)的色差分析結(jié)果正如Fig.4E,F,H所示,結(jié)果表明,L*值在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的變化趨勢(shì)并不明顯,但對(duì)照組的a*值明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.01),b*值在侵染后25 d明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.01),這表明L*,a*,b*的變化趨勢(shì)和表型結(jié)果基本一致。

2.5 瞬時(shí)沉默SlWRKY53b使番茄成熟相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SlWRKY53b在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中發(fā)揮的作用,本文測(cè)定了SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)中葉綠素降解,類胡蘿卜素合成、乙烯合成以及細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的表達(dá)量,結(jié)果正如Fig.5所示。

Fig.5 SlWRKY53b gene silences the expression of ripening senescence-associated genes in tomato fruits Gene expression of PSY1(A), PDS (B), ZDS (C), NYC1 (D), PAO (E), PPH (F), SGR1 (G), ACO1(H), ACS2(I), NOR (J), ACO3 (K), E4(L), RIN (M), PG(N),EXP(O), and CEL2 (P) in the control(TRV2) and SlWRKY53b-silenced fruits at 20 and 25 days post infestation. The data are expressed as the means of three biological replicates ± SD. The symbols** and* indicate P< 0.01 and P< 0.05, respectively

Fig.5 A,B,C分別表示番茄果實(shí)中影響類胡蘿卜素合成的相關(guān)基因:PSY1、PDS、ZDS表達(dá)量的變化。在侵染后的兩個(gè)時(shí)期,SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)中這3個(gè)基因的表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。其中,在侵染后的第20 d,PSY1在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的4%。這表明,基因沉默SlWRKY53b會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)中類胡蘿卜素相關(guān)基因的表達(dá)量減少,進(jìn)而減緩番茄果實(shí)成熟過(guò)程中類胡蘿卜素的積累。Fig.5 D,E,F,G分別表示葉綠素降解相關(guān)基因:NYC1、PAO、PPH和SGR1的表達(dá)量在SlWRKY53b瞬時(shí)沉默番茄果實(shí)以及對(duì)照組番茄果實(shí)中的變化。結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中這些基因的表達(dá)量均下調(diào),且在侵染的第20 d時(shí)SGR1的下調(diào)效果最為顯著,其在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量?jī)H是對(duì)照組的8%左右。這說(shuō)明SlWRKY53b基因沉默可能通過(guò)下調(diào)葉綠素降解相關(guān)基因的表達(dá)量來(lái)減慢番茄果實(shí)中葉綠素的降解,從而抑制番茄果實(shí)的成熟。乙烯是參與番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中的重要植物激素。Fig.5 H,I,J,K,L,M分別表示番茄果實(shí)中乙烯合成通路的關(guān)鍵基因:ACO1、ACS2、NOR、ACO3、E4以及RIN的表達(dá)量變化,表現(xiàn)出與葉綠素降解和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因相同的趨勢(shì),在侵染后的第20 d以及第25 d均顯著下調(diào)(P<0.01),其中對(duì)ACS2的調(diào)節(jié)作用較其他幾個(gè)基因更為顯著,在侵染后的20 d時(shí)ACS2在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量?jī)H是對(duì)照組的4%。由此說(shuō)明,瞬時(shí)沉默SlWRKY53b可能會(huì)減少番茄果實(shí)中乙烯的含量,從乙烯合成通路相關(guān)基因方面調(diào)控番茄果實(shí)的成熟。番茄果實(shí)的成熟通常伴隨著果皮的軟化,這個(gè)過(guò)程離不開(kāi)細(xì)胞壁降解相關(guān)酶的作用。為了明確SlWRKY53b影響番茄果實(shí)細(xì)胞壁代謝的相關(guān)機(jī)制,檢測(cè)了影響細(xì)胞壁降解相關(guān)通路基因的表達(dá)量。Fig.5N,O,P分別表示了細(xì)胞壁降解相關(guān)基因:PG、EXP、CEL2表達(dá)量的變化。這些基因同樣表現(xiàn)出顯著下調(diào)的趨勢(shì)(P<0.01),說(shuō)明SlWRKY53b基因沉默可以減緩番茄果實(shí)細(xì)胞壁的降解,使果實(shí)軟化的速度減慢,從而抑制番茄果實(shí)的成熟。綜上所述,瞬時(shí)沉默SlWRKY53b使這些成熟衰老相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào),這可能是SlWRKY53b基因沉默抑制番茄果實(shí)成熟的分子機(jī)制之一。

2.6 生理指標(biāo)及成熟相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

本文將以上測(cè)得的葉綠素a,葉綠素b,總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量以及葉綠素降解,類胡蘿卜素合成、乙烯合成以及細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果正如Fig.6所示。

Fig.6 Correlation analysis of tomato pigment contents and expression of mature-related genes Correlation analysis of the parameters of chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll, carotenoid, gene expressions of WRKY53b, PSY1, PDS, ZDS, NYC1, PAO, PPH, SGR1, ACO1, ACS2, NOR, ACO3, E4, RIN, PG, EXP and CEL2 based on the data in the control (TRV2) and SlWRKY53b-silenced fruits at 20 and 25 days post inoculation

SlWRKY53b的表達(dá)量和葉綠素含量呈負(fù)相關(guān),和類胡蘿卜素的含量以及所測(cè)的成熟衰老相關(guān)基因的表達(dá)量呈明顯正相關(guān)。同時(shí)可以看出,葉綠素的含量和葉綠素降解相關(guān)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān),類胡蘿卜素的含量和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。

3 討論

在植物中,WRKY是一個(gè)極具代表性的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與調(diào)節(jié)植物組織中的一系列的生理生化活動(dòng),行使著各種各樣的生物學(xué)功能其中包括:調(diào)控細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,對(duì)生物以及非生物脅迫的抵御等[21-22]。WRKY也參與調(diào)控植物中復(fù)雜的激素網(wǎng)絡(luò),可以在激素的上游和下游分別發(fā)揮作用。過(guò)表達(dá)GhWRKY70的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,在感染大麗弧菌后表現(xiàn)出比野生型植株更好的生長(zhǎng)性能和更高的木質(zhì)素含量、抗氧化酶活性和茉莉酸(Jasmonate, JA)水平[22]。在病原菌侵?jǐn)_后,水楊酸(Salicylic acid, SA)在植物體內(nèi)的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng),誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá),從而提高植物對(duì)疾病的抵抗力。研究發(fā)現(xiàn),CmWRKY8-1-VP64融合蛋白的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)菊花體內(nèi)SA途徑,從而影響對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性[23]。除此之外,有研究報(bào)道,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。番茄中的SlWRKY71通過(guò)和CAS1的啟動(dòng)子結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而達(dá)到抑制番茄果實(shí)成熟的效果[24]。草莓中的FvWRKY48通過(guò)結(jié)合FvPLA的啟動(dòng)子,進(jìn)而控制果實(shí)軟化與成熟[25]。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,SlWRKY53b和SlWRKY30、ZmWRKY69、AtWRKY30等轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性。研究表明,AtWRKY30參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的早期過(guò)程,涉及ROS的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo),AtWRKY30的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)擬南芥生長(zhǎng)階段早期對(duì)非生物脅迫耐受性[26]。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,SlWRKY53b的表達(dá)量隨著番茄果實(shí)的成熟呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì),并利用VIGS技術(shù)構(gòu)建了SlWRKY53b基因沉默番茄果實(shí),從而驗(yàn)證SlWRKY53b在番茄果實(shí)中行使的具體功能。結(jié)果表明,瞬時(shí)沉默SlWRKY53b可以延緩番茄果實(shí)的成熟,導(dǎo)致果實(shí)中的葉綠素含量增加,類胡蘿卜含量減少。進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行分析,基因沉默SlWRKY53b可以下調(diào)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因(PSY1、PDS、ZDS),葉綠素降解相關(guān)基因(NYC1、PAO、PPH、SGR1),乙烯合成相關(guān)基因(ACO1、ACO3、ACS2、NOR、E4、RIN)以及細(xì)胞壁降解相關(guān)基因(EXP、PG、CEL2)的表達(dá)量。為了揭示SlWRKY53b和番茄果實(shí)成熟之間的潛在聯(lián)系,對(duì)SlWRKY53b基因的表達(dá)量,葉綠素和類胡蘿卜素的含量以及番茄成熟衰老相關(guān)基因的表達(dá)量之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,SlWRKY53b的表達(dá)與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān),與類胡蘿卜素含量以及成熟衰老相關(guān)基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。以上研究表明,通過(guò)VIGS沉默SlWRKY53b會(huì)延緩番茄果實(shí)的成熟,SlWRKY53b在番茄果實(shí)成熟過(guò)程發(fā)揮促進(jìn)因子的作用,期望對(duì)番茄果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。但SlWRKY53b在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中的具體調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步解析。