趙信林，欒明寶，張誼寒

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明 650021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/南方經(jīng)濟(jì)作物研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410221)

煙草(Nicotianatabacum)是全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，而我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)[1－2]。煙草的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在葉片上，煙葉的高產(chǎn)和高質(zhì)是煙草種植的重要目標(biāo)。煙葉的產(chǎn)量與煙草品種、環(huán)境因素、栽培管理緊密相關(guān)[3－4]。在特定環(huán)境和管理水平下，煙草品種對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)起著決定性作用，因此，充分利用現(xiàn)代或傳統(tǒng)育種技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙草品種十分必要。

硃砂煙(Cherry red tobacco)是指烤煙中能將大部分煙堿(尼古丁)轉(zhuǎn)化為去甲基煙堿(降煙堿)的突變植株[5]。研究[6]表明，變異株中去甲基酶基因可以大量表達(dá)，從而將煙堿大量轉(zhuǎn)化為降煙堿。目前，硃砂煙因其特殊的“糯米香”風(fēng)味而受到卷煙工業(yè)的持續(xù)關(guān)注，并被業(yè)界稱作煙葉中的極品[7]。然而，以“硃砂煙”為主題詞，通過(guò)“中國(guó)知網(wǎng)”對(duì)關(guān)于硃砂煙的研究進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)硃砂煙的研究報(bào)告并不多，現(xiàn)有研究全部集中在2020年及以后，尤其缺乏對(duì)其特殊風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)制的分析。因此，亟須加強(qiáng)對(duì)硃砂煙的研究。

云煙87 是以云煙2 號(hào)為母本，K326 作父本進(jìn)行雜交，經(jīng)系譜選擇育成的烤煙品種[8]，在其綠色及衰老葉片中的主要生物堿是煙堿。然而，在生產(chǎn)云煙87 過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)了稀有的硃砂煙變異株后，相關(guān)人員進(jìn)一步通過(guò)分子技術(shù)選育成為硃砂煙新品系，即硃砂2 號(hào)。這兩個(gè)品種為探明硃砂煙風(fēng)味形成機(jī)制提供了優(yōu)異材料。但目前關(guān)于硃砂2 號(hào)的研究還鮮有報(bào)道，其煙葉與非變異株云煙87 煙葉在化學(xué)成分上的差異還有待深入了解。因此，本研究擬通過(guò)測(cè)定云煙87 和硃砂2 號(hào)不同葉位的煙葉中與煙葉質(zhì)量相關(guān)的主要成分指標(biāo)，對(duì)比兩個(gè)煙草品種煙葉在化學(xué)成分上的差異，以期為進(jìn)一步改良硃砂2 號(hào)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為云煙87 和硃砂2 號(hào)，其中，硃砂2 號(hào)于2019年在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和試驗(yàn)基地種植的云煙87 群體中發(fā)現(xiàn)，同年套袋自交獲得硃砂煙種子。云煙87CYP82E4基因不表達(dá)，硃砂2 號(hào)為云煙87CYP82E4 基因表達(dá)后植株。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)在云南省昆明市石林縣板橋鎮(zhèn)者烏龍村(103.28°E，24.70°N)進(jìn)行，海拔1680 m，土壤養(yǎng)分狀況如下:有機(jī)質(zhì)25.34 g/kg、速效氮106.9 mg/kg、速效磷26.42 mg/kg、速效鉀149.2 mg/kg，pH 7.91。土壤類型為紫色土，前作為小麥。2020年將前一年收獲的硃砂煙(CR)和云煙87(CK)再次種植在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和試驗(yàn)基地，在同一片農(nóng)田進(jìn)行煙葉品比試驗(yàn)。每個(gè)煙草品種種植3 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植100 株左右，行株距為120 cm×55 cm。整個(gè)煙草生育期間兩個(gè)品種的田間管理措施保持一致。

1.2.2 取樣與分析

按照煙葉成熟順序進(jìn)行先后收獲，烤煙完成后對(duì)煙葉的常規(guī)化學(xué)成分、致香成分、生物堿成分進(jìn)行測(cè)定和分析。

1.2.3 煙葉成分分析

總植物堿含量按照YC/T 468—2013?煙草及煙草制品總植物堿的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法?測(cè)定；總氮含量按照YC/T 161—2002?煙草及煙草制品總氮的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法?測(cè)定；總糖和還原糖含量按照YC/T 159—2002?煙草及煙草制品水溶性糖的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法?測(cè)定；鉀含量按照YC/T 217—2007?煙草及煙草制品鉀的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法?測(cè)定；氯含量按照YC/T 162—2002?煙草及煙草制品氯的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法?測(cè)定[9]。生物堿采用氣相色譜/質(zhì)譜(SIM)法按照標(biāo)準(zhǔn)?煙草及煙草制品煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測(cè)定氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法?YC/T 383－2010測(cè)定[10]。致香成分測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]中方法。本研究分析的主要致香成分見表1。

表1 本研究測(cè)定的煙葉主要致香成分Table 1 The main flavor compounds in tobacco leaf determined in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖1～2 中數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 處理，采用SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析，并用Duncan 法在P＝0.05 顯著水平上進(jìn)行多重比較，采用Origin 2021 進(jìn)行繪圖；圖3 數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 和R 語(yǔ)言軟件對(duì)云煙87 和硃砂2 號(hào)主要致香物質(zhì)進(jìn)行處理和t檢驗(yàn)，并借助“微生信”在線繪圖平臺(tái)(http:/ /www.bioinformatics.com.cn/)作火山圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉常規(guī)化學(xué)指標(biāo)

與云煙87 相比，硃砂2 號(hào)煙葉的代表性常規(guī)化學(xué)成分含量出現(xiàn)了顯著的增加或者下降(圖1)。硃砂2 號(hào)煙葉中的還原糖含量與云煙87 相比有顯著性下降，這一點(diǎn)在上、中、下3 個(gè)部位的煙葉出現(xiàn)的規(guī)律一致。與還原糖類似，硃砂2 號(hào)煙葉中的總植物堿和氯的含量與云煙87 相比也顯著下降。硃砂2 號(hào)3 個(gè)部位煙葉中的總氮和鉀含量則顯著高于云煙87。

2.2 煙葉生物堿分析

硃砂2 號(hào)和云煙87 煙葉中的煙堿、降煙堿、麥斯明、新煙堿、新煙草堿和可替寧含量如圖2所示。與云煙87 相比，硃砂2 號(hào)上、中、下3 個(gè)部位煙葉中的煙堿和降煙堿含量分別顯著降低和增加，這是硃砂煙自身特有的屬性。類似降煙堿，硃砂2 號(hào)不同部位煙葉中的麥斯明含量也顯著高于云煙87。硃砂2 號(hào)上部煙葉中的新煙堿含量顯著高于云煙87，但是兩個(gè)品種煙草的中、下部煙葉中的新煙堿含量并沒(méi)有顯著性差異。在上、中部煙葉中，硃砂2 號(hào)的新煙草堿含量顯著高于云煙87，但是在下部煙葉中的新煙草堿含量差異并不顯著。不論是煙草品種，還是煙葉部位，對(duì)可替寧的含量都沒(méi)有產(chǎn)生顯著性影響。

圖2 煙葉中的生物堿含量Fig.2 Alkaloid content in tobacco leaves

2.3 煙葉致香成分分析

對(duì)云煙87 和硃砂2 號(hào)煙草不同部位(上6 片、中6 片、下6 片)煙葉中的主要致香物質(zhì)含量進(jìn)行了差異分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，與云煙87 相比，硃砂2 號(hào)煙葉的致香成分含量發(fā)生了顯著的變化，一些成分含量顯著提高或者下降，但大部分成分含量差異不顯著，且該變化因葉片部位不同而產(chǎn)生很大差異。在上部葉中，硃砂2 號(hào)的2，4 庚二烯醛(FC3)、棕櫚酸(F58)和西柏三烯二醇－2(FC62)3 種致香成分與云煙87 相比顯著降低，而硃砂2 號(hào)的吲哚(FC14)、螺巖蘭草酮(FC47)、蒎烷(FC51)、二十二六烯酸甲酯(FC55)和亞油酸甲酯(FC64)則顯著提高。在中部葉中，硃砂2 號(hào)的2，4 庚二烯醛(FC3)和西柏三烯二醇－2(FC62)2 種致香成分與云煙87 相比顯著降低，而糠醛(FC2)、苯乙醛(FC6)、巨豆三烯酮A(FC32)、巨豆三烯酮B(FC34)、巨豆三烯酮C(FC36)、巨豆三烯酮D(FC38)、正十五醛(FC43)、二十二六烯酸甲酯(FC55)和棕櫚酸(FC58)9 種致香成分則顯著提高。在下部葉中，硃砂2 號(hào)煙葉中所有已測(cè)致香成分與云煙87 相比，均沒(méi)有顯著降低者，4－羥基－3－甲基苯乙酮(FC15)、4－羥基－β－二氫大馬酮(FC37)、2，4，6－三甲基－1，3－苯二胺(FC39)、正十五醛(FC43)、二十二六烯酸甲酯(FC55)和棕櫚酸(FC58)6 種成分則顯著提高。

圖3 煙葉中致香成分差異分析Fig.3 Difference analysis of flavor compounds in tobacco leaves

3 討論

硃砂煙主要是在栽培過(guò)程中由普通煙草自然突變形成，其成熟煙葉經(jīng)初烤后會(huì)出現(xiàn)硃砂斑紋且風(fēng)味獨(dú)特，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在卷煙和香料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。硃砂煙因顏色呈櫻桃紅，又被國(guó)外學(xué)者稱為“櫻桃紅煙”，國(guó)外關(guān)于硃砂煙最早的報(bào)道可以追溯到20世紀(jì)50年代[5]。然而，我國(guó)關(guān)于硃砂煙的研究才剛剛起步，亟須加強(qiáng)硃砂煙育種工作和風(fēng)味形成機(jī)制研究。

硃砂煙葉與普通煙葉相比，除烤煙后煙葉顏色的區(qū)別，在煙葉化學(xué)成分組成上也產(chǎn)生了顯著的改變。還原糖對(duì)煙氣的香吃味有重要作用，還可以減少煙氣的刺激性，對(duì)煙葉品質(zhì)影響較大[12]，優(yōu)質(zhì)烤煙的還原糖含量應(yīng)處于16.1%～22.1%[13]，本研究表明硃砂2 號(hào)和云煙87 煙葉還原糖含量大致在前述范圍以內(nèi)。一般煙葉總氮在1.53%～1.88%時(shí)，煙葉勁頭適中、刺激性小，香氣量充足，可用性高[14]，本研究中兩種煙草上部葉中的總氮含量高過(guò)此值，可能會(huì)對(duì)煙葉品質(zhì)有一定的影響，但中下部葉片在推薦范圍以內(nèi)。煙草總植物堿是影響煙草商品價(jià)值的主要因素，能使吸食者獲得一種生理上的滿足，但其含量過(guò)高易損害人體健康[15]，適量降低總植物堿對(duì)煙草品質(zhì)具有重要的意義。本研究中硃砂2 號(hào)的總植物堿含量顯著低于云煙87，可能對(duì)煙葉的品質(zhì)有一定的提升作用。鉀是能提高煙葉燃燒性的礦質(zhì)元素[16]，與煙葉香吃味也密切相關(guān)[17]，對(duì)煙葉品質(zhì)具有重要的提升作用。本研究表明，硃砂2 號(hào)煙葉中鉀的含量顯著高于云煙87，所以硃砂2 號(hào)的品性要優(yōu)于云煙87。煙葉中正常含氯量范圍應(yīng)為0.3%～0.8%，氯過(guò)高或過(guò)低對(duì)煙葉品質(zhì)均有不良影響[18]，在這方面硃砂2 號(hào)煙葉比云煙87 的品質(zhì)更優(yōu)。

一般認(rèn)為硃砂煙是由于烤煙中的煙堿向降煙堿大量轉(zhuǎn)化而形成，所以“低煙堿、高降煙堿”是硃砂煙最鮮明的特征之一[19]。本研究中云煙87 煙葉中的煙堿含量是硃砂2 號(hào)煙葉的4～6 倍，而硃砂2 號(hào)煙葉的降煙堿含量為云煙87 的11～14 倍，因此，硃砂2 號(hào)具有硃砂煙最鮮明的特點(diǎn)。已有研究證明，硃砂煙中去甲基酶基因可以大量表達(dá)，從而將煙堿大量轉(zhuǎn)化為降煙堿[6]。關(guān)于煙草基因組中煙堿去甲基酶基因家族，目前已有4 個(gè)功能基因被克隆，分別為CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[20－23]，但是進(jìn)一步的研究表明CYP82E4 才是導(dǎo)致“低煙堿、高降煙堿”的關(guān)鍵基因[6]。因此，本研究中CYP82E4 基因表達(dá)與否是導(dǎo)致云煙87 和硃砂2 號(hào)煙葉中煙堿與降煙堿差異的根本原因。麥斯明在兩種煙草中的變化趨勢(shì)與降煙堿一致，表明硃砂2 號(hào)煙葉中的煙堿可能有一部分轉(zhuǎn)化為了麥斯明，這一點(diǎn)與焦天雷等[10]的研究結(jié)論一致。此外，新煙堿、新煙草堿和可替寧在硃砂2 號(hào)中也有顯著或不顯著的增加，推測(cè)這與煙堿的轉(zhuǎn)化有一定的聯(lián)系。

煙葉尼古丁含量低使得硃砂煙口感醇厚，具有較高的香氣物質(zhì)和香氣量，刺激性小，與普通煙葉相比有更大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)[24]。云南硃砂煙具有典型的“糯米香”風(fēng)味，備受煙草行業(yè)關(guān)注，研究硃砂煙“糯米香”產(chǎn)生機(jī)制具有重要的意義。本研究對(duì)云煙87 和硃砂2 號(hào)煙葉中的致香物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定和分析，研究表明:與云煙87 相比，硃砂2 號(hào)煙葉有多種香氣成分發(fā)生了顯著變化，而且與煙葉的取樣部位緊密相關(guān)；硃砂2 號(hào)煙葉中部煙葉致香成分含量上調(diào)的種類最多，上部和下部葉成分含量變化種類相同，這說(shuō)明硃砂2 號(hào)與云煙87 相比，中部葉片的風(fēng)味差可能更大。同時(shí)，硃砂2號(hào)獨(dú)特風(fēng)味的形成主要與少部分酮類、醛類、酸類、酯類化合物的變化有關(guān)。

4 結(jié)論

通過(guò)分析硃砂2 號(hào)與云煙87 煙葉化學(xué)成分含量差異，可以得出以下結(jié)論:一是硃砂2 號(hào)在還原糖、總氮、鉀、氯、總植物堿等常規(guī)化學(xué)成分含量上與云煙87 相比，有了明顯的差異和改善，可使硃砂2 號(hào)煙葉可燃性更好、吃味更佳；二是硃砂2 號(hào)顯著降低了煙堿的含量，提高了降煙堿的含量；與云煙87 相比，硃砂2 號(hào)煙葉獨(dú)特風(fēng)味的形成主要與部分酮類、醛類、酸類、酯類化合物的變化有關(guān)，關(guān)鍵因子包括含量顯著下降的2，4 庚二烯醛、西柏三烯二醇－2 和含量顯著提高的吲哚、棕櫚酸、二十二六烯酸甲酯、2，4，6－三甲基－1，3－苯二胺、正十五醛等。