龔 燁, 王 胄, 蘇鵬程

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺科, 烏魯木齊 830001)

甲狀腺癌(Thyroid cancer, TC)是一種分泌癌,占所有內(nèi)分泌惡性腫瘤的90%,且發(fā)病率呈上升趨勢[1]。據(jù)報道,2020年在全球所有癌癥的發(fā)病率中TC排名第9位,確診病例超過58.6萬例,TC在女性中的發(fā)病率是男性的3倍[2]。TC中最常見的是乳頭狀甲狀腺癌(PTC),多數(shù)PTC患者預后情況較好,10年生存率較為理想[3],但有5%～20%的PTC患者預后有甲狀腺外侵犯、血管侵犯或遠處轉(zhuǎn)移,預后情況相對較差,5年生存率為25%,10年生存率為10%,是PTC患者主要的死亡原因[4]。鐵死亡是一種細胞死亡方式,通常由鐵依賴性的氧化應激和脂質(zhì)過氧化所引發(fā),在鐵死亡過程中,細胞內(nèi)的鐵離子被過量動員和利用,使得活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的生成增加,這些活性分子會攻擊細胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA,導致細胞死亡[5-6]。有研究報道,鐵死亡與PTC的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系,抑制鐵死亡可以促進PTC的進程和轉(zhuǎn)移[7-8]。研究表明miRNA是調(diào)控鐵死亡的關鍵介質(zhì),參與調(diào)節(jié)鐵死亡的多個關鍵步驟,包括谷胱甘肽-GPX4途徑、谷氨酸/胱氨酸運輸、鐵代謝和脂質(zhì)代謝,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[9-11]。微小核糖核酸-146a(miR-146a)是一種微小RNA,位于人體染色體19上,是一個內(nèi)源性非編碼RNA,在多種細胞生物學過程中發(fā)揮關鍵作用,在多種惡性腫瘤中調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、耐藥和脂肪代謝等生物學功能[12-13]。但關于miR-146a與鐵死亡之間的調(diào)控關系有待進一步探索。本研究探究miR-146a通過影響鐵死亡過程對人甲狀腺癌細胞(TPC-1)細胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞TPC-1細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 試藥miR-146a激活劑(上海吉瑪制藥有限公司,批號:312379);miR-146a抑制劑(上海吉瑪制藥有限公司,批號:291742);Erastin(美國MCE公司,批號HY-15763);胎牛血清(美國Gibco公司,批號:10099-141C);胰蛋白酶-EDTA溶液(美國GIBCO公司,批號:25200072); CCK-8試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司);結(jié)晶紫(上海碧云天生物技術有限公司);ROS試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Erastin(美國Med Chem Express生物科技公司);谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司提供);Cell Ferrous Iron CoLorimetric Assay Kit(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.3 儀器Nunc細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司);DMIL LED倒置顯微鏡(Leica公司);StepOne PLus實時熒光定量PCR儀(AppLied Biosystems公司);ChemiDoc MP蛋白質(zhì)印跡儀(Bio-Rad公司);CytoFLEX流式細胞儀(Beckman CouLter公司);MuLtiskan EX酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司); HG220-CC6低速醫(yī)用離心機(北京百萬電子科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 TPC-1細胞孵育及傳代 將TPC-1細胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL(RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS+1% PeniciLLin-Streptom ycin SoLution)培養(yǎng)基的離心管中,1 000 r/min離心5 min,收集并懸浮細胞,將細胞接種到培養(yǎng)皿中,于培養(yǎng)箱內(nèi)孵化培育,溫度為37℃,孵化24 h。間隔2 d更換1次培養(yǎng)液,當細胞融合80%時,使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集細胞,按1∶3傳代,37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.4.2 TPC-1細胞轉(zhuǎn)染 取“1.4.1”項下培養(yǎng)的TPC-1單細胞懸液20 μL,按3.5×105個/孔接種到96孔板中,在37℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染:分別取200 μL jetPRIME buffer,加入終濃度為30 nmoL/L mimics和60 nmoL/L inhibitor;再加入4 μL jetPRIME reagent,孵育10 min。取上述混合物200 μL分別加入細胞培養(yǎng)液中,6 h后換新鮮培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h;inhibitor轉(zhuǎn)染組換液后,實驗組加入鐵死亡激動劑,空白組加入等體積的PBS。轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)檢測。分組方法:Control組(未進行任何處理)、miR-146a mimics NC組(進行非特異性對照miR-146a模擬物處理)、miR-146a mimics組(miR-146a模擬物處理)、inhibitor NC組(非特異性對照的miR-146a抑制劑處理)、miR-146a inhibitor組(miR-146a抑制劑處理)、miR-146a inhibitor+Erastin(10 μmoL/L)組(miR-146a抑制劑和Erastin處理),共6組。

1.4.3 CCK8檢測細胞增殖活性 將“1.4.2”項下各組細胞于37℃培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,酶標儀測定各孔450 nm處OD值。

1.4.4 Transwell實驗 將“1.4.2”項下各組細胞消化、收集、離心、重懸,細胞計數(shù)板計數(shù)備用。將Matrigel用緩沖液或溶劑稀釋至1 mg/mL,將稀釋后的Matrigel加入到Transwell小室上,使用移液管或滴管將Matrigel滴加到小室中進行凝膠處理,將小室放置在培養(yǎng)箱中,讓Matrigel在小室中干燥,保持適宜溫度和濕度,以確保細胞生長。凝膠處理完成后,加入200 μL懸液到每個小室中,將小室放置在恒溫搖床或培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h,用戊二醛對細胞進行固定、蘇木精染色,在顯微鏡(×400倍)下觀察。

1.4.5 細胞劃痕實驗 使用marker筆在6孔板背后均勻的劃橫線,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線;取經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞,0.25%胰酶分別消化計數(shù)約為5×105個,接種于6孔板,37℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)24 h;待細胞密度達到80%左右,鋪滿6孔板底部,用槍頭劃痕,加入無血清培養(yǎng)基,同時拍取0 h照片;放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,拍照。

1.4.6 各組細胞中亞鐵離子、谷胱甘肽(Glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)的表達 取“1.4.2”項下各組細胞,按照檢測試劑盒說明書測定亞鐵離子、GSH、GPX4水平。

1.4.7 ROS表達水平的測定 用無血清培養(yǎng)基按照1∶1 000稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μmoL/L;收集TPC-1細胞,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,細胞沉淀重懸于適量的DCFH-DA中,在細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育5 min,混勻,使探針和細胞充分接觸,孵育結(jié)束,用無血清的培養(yǎng)基洗滌細胞3次,加入500 μL緩沖液,檢測ROS表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析,對計量資料進行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a對TPC-1細胞增殖活性的影響miR-146a mimics組TPC-1細胞增殖活性為(84.77±3.71)%,細胞增殖活性最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);miR-146a inhibitor組TPC-1細胞增殖活性為(119.20±5.81)%,細胞增殖活性最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 miR-146a對TPC-1細胞增殖活性的影響

2.2 miR-146a對TPC-1細胞遷移和侵襲能力的影響miR-146a mimics組TPC-1細胞遷移距離為(18.33±3.79)%,細胞侵襲能力為(41.61±4.34)%,細胞遷移和侵襲能力最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-146a inhibitor組TPC-1細胞遷移距離為(61.67±1.53)%,細胞侵襲能力為(172.26±9.98)%,細胞遷移和侵襲能力最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2,圖1、2。

圖1 miR-146a調(diào)控TPC-1細胞的遷移圖

圖2 miR-146a調(diào)控TPC-1 細胞的侵襲圖

表2 miR-146a對TPC-1細胞遷移和侵襲的影響

2.3 miR-146a對TPC-1細胞發(fā)生鐵死亡的影響miR-146a mimics組Fe2+和ROS水平最高,GPX4和GSH的水平最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-146a inhibitor組Fe2+和ROS水平均最低,GPX4和GSH水平最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3、圖3。

表3 miR-146a對TPC-1細胞發(fā)生鐵死亡的影響

2.4 Erastin對TPC-1細胞增殖活性的影響與Control組比較,miR-146a inhibitor組和miR-146a inhibitor+Erastin組TPC-1細胞增殖活性均增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-146a inhibitor組比較,miR-146a inhibitor+Erastin組TPC-1細胞增殖活性減小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

表4 Erastin對TPC-1細胞增殖活性的影響

2.5 Erastin對TPC-1細胞細胞遷移和侵襲能力的影響與Control組比較,miR-146a inhibitor組和miR-146a inhibitor+Erastin組TPC-1細胞遷移距離和侵襲能力均增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-146a inhibitor組比較,miR-146a inhibitor+Erastin組TPC-1細胞遷移距離和侵襲能力均減小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5,圖4、5。

圖4 Erastin調(diào)控TPC-1細胞的遷移圖

圖5 Erastin調(diào)控TPC-1細胞的侵襲圖

表5 Erastin對TPC-1細胞遷移和侵襲的影響

2.6 Erastin對TPC-1細胞鐵死亡指標的影響與Control組比較,miR-146a inhibitor組和miR-146a inhibitor+Erastin組Fe2+和ROS的表達降低,GSH和GPX4的表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-146a inhibitor組比較,miR-146a inhibitor+Erastin組Fe2+和ROS的表達升高,GSH和GPX4的表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表6、圖6。

圖6 Erastin調(diào)控TPC-1 細胞的ROS流式原始圖

表6 Erastin對TPC-1細胞鐵死亡指標的影響

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征,主要包括以下步驟:(1)原位癌變大,侵入局部血管、淋巴管,或直接擴散。(2)癌細胞隨淋巴液或血液移動,在繼發(fā)部位合適的轉(zhuǎn)移位聚集、黏附、增殖,導致繼發(fā)部位血管或淋巴管結(jié)構發(fā)生改變,通透性增加,使癌細胞能夠滲透出循環(huán)系統(tǒng)侵入并增殖[14]。miR-146a可在多種腫瘤細胞中發(fā)生異常表達[15]。有研究報道,高表達miR-146a促進口腔癌、乳腺癌、濾泡性甲狀腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[16-18]。而高表達miR-146a-5p可抑制胃癌細胞的侵襲和增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn),高表達miR-146a可抑制TPC-1細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力,表明miR-146a具有調(diào)控PTC進展的效能。

鐵死亡對惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用,主要包括對腫瘤細胞、腫瘤干細胞、免疫細胞、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成等的調(diào)節(jié)[20]。miRNA最近被證明可通過鐵死亡途徑調(diào)節(jié)癌細胞的生長和發(fā)展[21-22]。miRNA的作用包括調(diào)控谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運,調(diào)節(jié)谷胱甘肽合成、鐵代謝、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)活性氧(ROS)生成等氧化應激途徑[23-25]。有研究報道,miR-545-3p可調(diào)控SLC7A11促進甲狀腺癌中的鐵死亡過程,miR-1231可調(diào)控GPX4誘導甲狀腺乳頭狀癌的鐵死亡過程[26]。本研究結(jié)果表明,在miR-146a inhibitor中加入鐵死亡激動劑Erastin, TPC-1細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。ROS水平升高,這表明Erastin能夠觸發(fā)氧化應激反應,進一步促進鐵死亡的發(fā)生。同時GSH和GPX4的表達水平降低,表明Erastin處理后,細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的功能被激活,以應對氧化應激壓力。

綜上所述, miR-146a通過影響調(diào)控鐵死亡相關指標(亞鐵離子、ROS、GSH和GPX4)的表達水平,達到調(diào)控TPC-1細胞的增殖和轉(zhuǎn)移進程。