袁晞釩付瓊怡苗明三

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046)

青光眼是一種視神經(jīng)頭改變、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion fine the cell,RGC)逐漸死亡、視野喪失的進(jìn)行性神經(jīng)病變。 眼壓升高是主要的危險(xiǎn)因素[1]。 青光眼是一種發(fā)病原因復(fù)雜的高致盲性眼病。 全球40 ~ 80 歲人群中青光眼患病率為3.5%,隨著老年人在人口中的數(shù)量和比例不斷增加,預(yù)計(jì)到2040 年將有1.118 億人患有青光眼[2]。目前,青光眼尚無(wú)根治方法,所有的治療方法都以降低眼壓(intraocular pressure, IOP)為目標(biāo)[3]。 降低眼壓是該病目前唯一可行的治療方法[4]。 西醫(yī)對(duì)青光眼的發(fā)病機(jī)制尚未明確,中醫(yī)將其歸屬為“五風(fēng)內(nèi)障”的范疇,認(rèn)為該病發(fā)病與情志等多因素相關(guān)[5]。 青光眼致盲給患者帶來(lái)了巨大的疾病負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 因此研究有效的治療方法和藥物至關(guān)重要,而理想的動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究青光眼的重要工具。 本文通過(guò)對(duì)青光眼動(dòng)物模型進(jìn)行歸納總結(jié)分析,為青光眼動(dòng)物模型的完善提供思路,以便能更好地應(yīng)用于后續(xù)的研究中。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

在中國(guó)知網(wǎng)、PubMed 中以“青光眼” “動(dòng)物模型”為主題詞進(jìn)行檢索,鎖定檢索年限2012 年11 月1日~2022 年11 月2 日的期刊文獻(xiàn)建立數(shù)據(jù)庫(kù),共檢索出1088 篇文獻(xiàn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

選擇“青光眼”動(dòng)物模型應(yīng)用研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)性文獻(xiàn),篩選造模方法完整及實(shí)驗(yàn)過(guò)程清晰的文章,最終篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的400 篇文獻(xiàn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

排除造模方法不全;會(huì)議、報(bào)紙、碩博士學(xué)位論文、綜述等文獻(xiàn)及青光眼相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物名稱(chēng)、種類(lèi)等均參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[6]進(jìn)行規(guī)范總結(jié)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

將納入標(biāo)準(zhǔn)的400 篇文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、性別、造模方法、檢測(cè)指標(biāo)等數(shù)據(jù)錄入Excel 表,建立青光眼動(dòng)物模型數(shù)據(jù)庫(kù)。 使用Excel 2019 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 青光眼模型動(dòng)物種系應(yīng)用情況

將涉及青光眼動(dòng)物模型的400 篇文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分類(lèi),總頻次為400。 總共24 類(lèi)動(dòng)物,最多的為C57BL/6J 小鼠(86 次;21.50%)、SD 大鼠(58 次;14.50%)、DBA/2J 小鼠(49 次;12.25%),具體見(jiàn)圖1。

圖1 青光眼動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)及頻次Figure 1 Species and frequency of experimental animals in animal model of glauco

本研究中,通過(guò)統(tǒng)計(jì)得到青光眼造模動(dòng)物主要為鼠類(lèi)。 主要原因是:嚙齒類(lèi)動(dòng)物的眼睛和人類(lèi)的眼睛有許多重要的生物學(xué)相似性[7]。 其中小鼠占比較高。 研究表明C57BL/6J 小鼠的視網(wǎng)膜更易損傷,視網(wǎng)膜厚度減少,血管損傷更嚴(yán)重[8]。 DBA/2J小鼠青光眼模型是一種近交系,隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸發(fā)展為青光眼樣異常。 在前房,小鼠出現(xiàn)一種色素分散綜合征,其主要作用是炎癥反應(yīng),導(dǎo)致眼壓升高。 DBA/2J 小鼠有兩種不同的表型:虹膜色素分散(可能與DBA/2J 眼睛的免疫功能障礙有關(guān))和虹膜色素轉(zhuǎn)移(可能與虹膜色素轉(zhuǎn)移有關(guān))[9]。

2.2 青光眼模型動(dòng)物性別分布情況

將400 篇文獻(xiàn)中所涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別進(jìn)行分類(lèi)規(guī)范,統(tǒng)計(jì)得出模型動(dòng)物性別分布,有38 例未對(duì)動(dòng)物性別做出標(biāo)記,明確標(biāo)明性別的雄性動(dòng)物150 例、占37.50%;雌雄各半動(dòng)物90 例、占22.50%;雌性動(dòng)物67 例、占16.75%;雌雄不限動(dòng)物55 例、占13.75%。 上述結(jié)果顯示,動(dòng)物性別以雄性居多,Ha 等[10]研究發(fā)現(xiàn)雄激素睪酮可能與青光眼的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

2.3 青光眼模型造模方法

統(tǒng)計(jì)400 篇文獻(xiàn)中使用的青光眼模型造模方法,共有12 種造模方法。 前房注射物質(zhì)誘導(dǎo)型(127次;31.75%),轉(zhuǎn)基因型(104 次;26.00%)、激光光凝誘導(dǎo)型(56 次;14.00%)最多。 前房注射物質(zhì)誘導(dǎo)型以微球注射前房(90 次;22.50%)、水凝膠注射(25 次;6.25%)較多;激光光凝誘導(dǎo)型以氬激光光凝小梁網(wǎng)(30 次;7.50%)、二極管激光光凝角鞏膜緣和上鞏膜靜脈(18 次;4.50%)較多。 詳細(xì)造模情況見(jiàn)表1。

表1 青光眼動(dòng)物模型造模方法及頻次Table 1 Method and frequency of animal model of glaucoma

從造模方法選擇方面,前房注射物質(zhì)誘導(dǎo)型為使用最多的方法,其中以微球注射前房最多,其次為轉(zhuǎn)基因型、激光光凝誘導(dǎo)型。 眼壓升高是青光眼的主要危險(xiǎn)因素,因此開(kāi)發(fā)和使用眼壓升高的動(dòng)物模型進(jìn)行青光眼研究是有意義的。 在前房注入聚苯乙烯微珠(微球),是導(dǎo)致眼壓升高、房水流出的主要物理阻塞[28]。 DBA/2J 小鼠和其他轉(zhuǎn)基因模型與人類(lèi)青光眼有許多相似之處,不同個(gè)體眼壓升高、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷的反應(yīng)較為一致,個(gè)體差異較小。 而且轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有助于識(shí)別各基因之間的相互作用[29]。 激光光凝誘導(dǎo)型以與氬激光光凝小梁網(wǎng)、二極管激光光凝角鞏膜緣和上鞏膜靜脈較多。 相比氬激光,二極管激光產(chǎn)生更深更大的斑尺寸病變,導(dǎo)致小梁網(wǎng)損傷更大,眼壓升高明顯[30]。鞏膜上靜脈高滲鹽水是以硬化小梁網(wǎng),增加房水流出阻力,從而達(dá)到升高眼壓的作用,但是此方法操作難度大,眼壓升高不穩(wěn)定,需要重復(fù)注射[31]。 鞏膜上靜脈烙閉誘導(dǎo)型比激光光凝法侵入性更小,且不會(huì)引起前房并發(fā)癥。 由于具有的其有效性和可及性,實(shí)驗(yàn)性青光眼的大多數(shù)結(jié)構(gòu)和功能研究都使用了這種方法。 該模型中的眼壓升高被認(rèn)為涉及到流出阻力增加[32]。 環(huán)角鞏膜緣縫合是一種簡(jiǎn)單、微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)有效的造模方法,可誘導(dǎo)大鼠和小鼠的眼壓升高,損傷神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[33]。 前房穿刺法與植管法均能成功建立大鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)動(dòng)物模型,且植管法更有利于觀察濾過(guò)泡形態(tài)及瘢痕形成情況,也可用于青光眼術(shù)后抗瘢痕相關(guān)研究[34]。 視神經(jīng)損傷模型是引起RGCs 凋亡的青光眼研究常用的動(dòng)物模型。 它可以在模擬視神經(jīng)損傷的病理變化的同時(shí),不影響視網(wǎng)膜動(dòng)脈、靜脈功能和血液供應(yīng)[35]。類(lèi)固醇誘導(dǎo)的高眼壓青光眼動(dòng)物模型價(jià)格低廉且無(wú)創(chuàng),但是與人類(lèi)解剖學(xué)有差異[36]。 各種自發(fā)性青光眼模型前后已經(jīng)在不同的動(dòng)物物種中被描述過(guò)。這些動(dòng)物物種包括兔子、狗、猴子、小鼠、大鼠和貓。被研究的這些模型為青光眼的病理生理學(xué)提供了有價(jià)值的信息[37]。

2.4 青光眼動(dòng)物模型檢測(cè)指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)納入標(biāo)準(zhǔn)的400 篇文獻(xiàn)中青光眼動(dòng)物模型的檢測(cè)指標(biāo),若檢測(cè)指標(biāo)為同一個(gè)組織的多個(gè)同類(lèi)型指標(biāo),則歸為一類(lèi),不再分開(kāi)統(tǒng)計(jì),如血清中同時(shí)檢測(cè)CRP、PCT、IL-1 和IL-6 水平等,則把這些指標(biāo)統(tǒng)稱(chēng)為血清指標(biāo),同一實(shí)驗(yàn)只計(jì)入一次。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,400 篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)涵蓋種不同的指標(biāo)類(lèi)型,累計(jì)頻數(shù)818 次。 其中檢測(cè)較多的指標(biāo)為眼壓測(cè)量、組織病理(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、眼球、房角)、蛋白質(zhì)印跡分析(視網(wǎng)膜、眼睛、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)、β-肌動(dòng)蛋白、免疫球蛋白G、RhoA、ROCK、Caspase-3)、免疫組化(視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)、視神經(jīng)、眼睛、腦、纖連蛋白、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白)、RGCs 計(jì)數(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量、視網(wǎng)膜電圖、光學(xué)相干斷層掃描CT(眼睛、視網(wǎng)膜)等。 檢測(cè)指標(biāo)分類(lèi)使用頻率(每種頻率通過(guò)四舍五入,保留小數(shù)點(diǎn)后兩位),見(jiàn)表2。

表2 模型檢測(cè)指標(biāo)及使用頻率Table 2 Model detection indicators and usage frequency

高頻的青光眼動(dòng)物模型檢測(cè)指標(biāo)為眼壓測(cè)量占22.49%,組織病理檢查占12.59%,蛋白免疫印跡法檢查占12.22%,免疫組化檢查占11.98%,RGCs 計(jì)數(shù)占9.41%、實(shí)時(shí)熒光定量占7.70%、視網(wǎng)膜電圖占4.77%,是評(píng)價(jià)青光眼動(dòng)物模型成功的重要指標(biāo)。 在臨床治療中,眼壓測(cè)量和視網(wǎng)膜形態(tài)是患者疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要參考依據(jù),因此在未來(lái)的動(dòng)物模型應(yīng)用中,建議將眼壓測(cè)量和視網(wǎng)膜形態(tài)改變作為重要指標(biāo)考察,并參照臨床檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)制定符合青光眼動(dòng)物模型的檢測(cè)指標(biāo)。

3 模型成功標(biāo)準(zhǔn)

目前,西醫(yī)對(duì)于青光眼動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)以病理指標(biāo)、表觀指標(biāo)為主,經(jīng)過(guò)對(duì)近10 年青光眼動(dòng)物實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析擬定青光眼動(dòng)物模型制備成功判斷標(biāo)準(zhǔn)。 具體見(jiàn)表3。

表3 青光眼動(dòng)物模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for successful judgment of animal models of glaucoma

4 討論

青光眼是一種視神經(jīng)病變,包括一系列神經(jīng)退行性疾病,最終由于RGC 功能障礙和退行性病變導(dǎo)致不可逆失明。 青光眼屬于中醫(yī)“五風(fēng)內(nèi)障”的范疇,其代表不同的青光類(lèi)型,綠風(fēng)內(nèi)障相當(dāng)于原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG),而青風(fēng)內(nèi)障類(lèi)似于原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open-angle glaucoma, POAG)[38]。 本病的發(fā)生與臟腑、氣、血、津液紊亂密切相關(guān)[39]。 目前青光眼的臨床護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)藥物或手術(shù)方法降低IOP 治療;然而,即使IOP 得到充分控制,眼壓降低也不足以阻止患者的進(jìn)行性視野喪失[40]。 因此,迫切需要開(kāi)發(fā)更安全有效的青光眼治療方法[41]。 青光眼的新治療策略需要開(kāi)發(fā)功能性的、可重復(fù)的、易于使用的、低成本的動(dòng)物模型用于臨床前研究。此外,這些模型應(yīng)該模擬人類(lèi)青光眼過(guò)程中出現(xiàn)的情況[42]。 因此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究,為治療藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

綜上所述,根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,目前研究者們較多選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6J 小鼠,性別多為雄性,造模方法以前房注射物質(zhì)誘導(dǎo)型、轉(zhuǎn)基因型、激光光凝誘導(dǎo)型最多。 相關(guān)模型指標(biāo):檢測(cè)眼壓測(cè)量、組織病理、蛋白免疫印跡、免疫組化最多。 青光眼動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前研究結(jié)果表明青光眼發(fā)病過(guò)程中涉及3 個(gè)功能類(lèi):線(xiàn)粒體、應(yīng)激和核蛋白,表明在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性過(guò)程中能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)和基因表達(dá)改變的損傷[43]。 因此可以考慮從以上方面進(jìn)行青光眼動(dòng)物模型研究。 理想的青光眼動(dòng)物模型應(yīng)能模擬人類(lèi)青光眼的形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)及生化指標(biāo),具有類(lèi)似的生物學(xué)機(jī)制,對(duì)其治療藥物有類(lèi)似的藥效反應(yīng),而以上模型尚不能達(dá)到此要求。 但從解剖結(jié)構(gòu)、生理功能及病理特點(diǎn)考慮,與西醫(yī)青光眼定義與診斷存在較好的吻合度。目前中醫(yī)病證結(jié)合的青光眼動(dòng)物模型尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),建議未來(lái)增加相關(guān)方面研究,更加有利于建立符合青光眼臨床研究特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),將會(huì)有力推進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合治療青光眼的發(fā)展趨勢(shì)[44]。