高效液相色譜法測定慕薩萊思中山梨酸鉀的含量

周 環(huán)，王 凱，陳盼盼，楊凱龍，李 璐

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

0 引言

慕薩萊思（Musalais），是南疆阿瓦提地區(qū)少數民族以鮮食葡萄為主要原料發(fā)酵釀制而成的一種酒類飲品，加入枸杞、肉蓯蓉、鴿子、雪雞等輔料，甚至作為烤羊肉等調味料，形成不同風味，不但酒精度較高，且營養(yǎng)價值豐富，其中含有大量的黃酮類物質，18 種氨基酸及十幾種微量元素和維生素；此外，還含較多的有機酸（如沒食子酸、肉桂酸等）。對于提升睡眠質量、清除瘀血、緩解失眠癥狀等癥狀具有一定的功效[1]。如今，慕薩萊思規(guī)?；a步入發(fā)展階段，逐步從家庭作坊式生產向現代化工廠化生產轉變，并于2019 年4 月正式加入《新疆維吾爾自治區(qū)葡萄酒產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2019—2025 年）》，目前阿瓦提縣釀造慕薩萊思家庭式作坊400 多家，大型生產工廠10 余家，年產量達5 000 t 以上[2]，在工業(yè)化生產時由于其糖漿及成品保藏期較短，易腐敗變質。因此，在其生產過程中會加入山梨酸鉀作為防腐劑，添加量受到生產者及消費者的關注，準確檢測穆薩萊思中山梨酸含量是確保產品質量的關鍵，只有具有準確檢測的方法手段，才能使得這一民族特色產品在新時代中發(fā)展更迅速。

山梨酸鉀（Potassium Sorbate），也稱為2,4 - 己二烯酸鉀，是山梨酸的鉀鹽，是目前最常見的食品防腐劑之一，其作用機制是通過與侵入微生物系統(tǒng)的巰基結合而破壞微生物體的許多酶[3]，使得微生物酶失活，達到防腐延長貨架期的目的。因低毒性，所以目前被廣泛使用。聯合國糧農組織將山梨酸鉀現推薦為安全、高效的食品防腐劑，許多發(fā)達國家已經把山梨酸鉀作為良好、高效的防腐劑，大量地應用于食品中[4]。食品中山梨酸鉀的測定方法多樣，目前在試驗中使用較多的分別為熒光檢測法[5-7]、紫外光譜法[8-9]、拉曼特征峰法[10-11]、氣相色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-17]等。熒光檢測法顯色靈敏、回收率高，但易受時間溫度影響[9]；紫外光譜法具有操作便捷、結果精準、具有高回收率等優(yōu)點，但專一性較差，最低檢測濃度較高；高效液相色譜法雖然靈敏度與熒光檢測法、紫外光譜法相比較低，但是其可以對樣品進行前處理，通過凈化和富集作用來增加靈敏度，具有專一性強、檢測限低、準確率高等特點[15]。近年來，利用高效液相色譜技術檢測食品、藥品中的化學成分已較為普遍，田莉等人[16]建立了HPLC 法測定發(fā)酵面制品中山梨酸含量的方法，試驗成功優(yōu)化了提取方法、方法適用等方面的內容。李岳等人[18]通過HPLC 法測定小兒咳喘靈口服液中山梨酸鉀的含量試驗，結果表明，山梨酸鉀濃度在一定范圍內與峰面積具有良好的線性關系（R=0.999 9），平均回收率可達到100.0%，RSD 為0.47%（n=9），線性濃度范圍內與峰面積關系良好。截止到目前，研究者采用HPLC 對食品中山梨酸鉀檢測的研究，主要集中在檢測藥品[19-20]、面制品[21-22]、調味品[23-24]、果汁[25]、部分酒類[26-27]。首次提出利用HPLC 法建立慕薩萊思中山梨酸鉀的測定方法，該方法建立優(yōu)化成功后不僅對慕薩萊思中山梨酸鉀檢測方法有一定指導意義，有利于填補慕薩萊思檢測方面的空白，為其產品規(guī)范化奠定一定試驗基礎，也對其中其他物質含量檢測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與儀器

慕薩萊思樣品，新疆阿瓦提縣慕薩萊思生產企業(yè)提供；山梨酸標準品（≥99.99%），阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；氨水、乙酸銨、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司提供；甲醇為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司提供。

LC-20A 型液相色譜儀、SPD-M20A 型檢測器，日本島津公司產品；KQ- 100VDE 型雙頻數控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司產品；LE203E/0 型電子天平，梅特勒- 托利多儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液制備

（1） 氨水溶液。取氨水1 mL，加到99 mL 水中，混勻。

（2） 乙酸銨溶液。稱取乙酸銨1.54 g，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，即得濃度為20 mmol/L的乙酸銨溶液，然后經0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后備用。

1.2.2 樣品處理

樣品處理依據GB 5009.28—2016 中處理方法，并做一定修改。準確稱取10 g 慕薩萊思，轉移至容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至25 mL，過0.22 μm 針式濾膜備用。

1.2.3 標品制備

（1） 山梨酸標準溶液。準確稱取山梨酸鉀和苯甲酸鈉0.134 g 和0.118 g，用水溶解并分別定容至100 mL，得到質量濃度為1 000 mg/L 標準貯備液。使用山梨酸標準品時，需要用甲醇溶解并定容。

（2） 山梨酸混合標準中間溶液。準確吸取山梨酸標準溶液各10.0 mL 于50 mL 容量瓶中，用水定容，即得質量濃度為200 mg/L 山梨酸混合標準中間溶液，于4 ℃條件下貯存。

（3） 山梨酸混合標準系列工作溶液。準確吸取山梨酸混合標準中間溶液0，0.05，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，用水定容至10 mL，配制成質量濃度分別為0，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 mg/L 的混合標準系列工作溶液，臨用現配。

1.2.4 色譜條件

參照GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》第一法液相色譜法[28]，并作一定修改。色譜柱：X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱（美國Waters）；流動相：A 為甲醇，B 為0.02 mol/L 乙酸銨，等度洗脫，流速0.8 mL/min；進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

1.3 數據分析與處理

每個處理重復3 次，結果以X±SD 表示，采用IBM SPSS Statistics 20.0 進行方差分析，并進行Duncan's 多重比較（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

分別用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱（美國Waters） 和Spursil C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（天津迪馬） 兩款C18色譜柱分析，獲得山梨酸鉀標品的HPLC 色譜圖。

2 種C18柱分析山梨酸的色譜峰見圖1。

圖1 2 種C18 柱分析山梨酸的色譜峰

由圖1 可知，2 種色譜柱均能獲得山梨酸的HPLC 色譜圖，但是2 種色譜柱對山梨酸色譜峰的保留時間及峰形的影響較大。Spursil C18色譜柱的保留時間為21.28 min，色譜峰寬且有明顯拖尾，而X bridge C18色譜柱的保留時間僅為12.85 min，且色譜峰窄，峰形尖銳，說明X bridge C18色譜柱更適合于山梨酸的HPLC 分析。

2.2 有機相比例的優(yōu)化

為確認有機相對山梨酸鉀標準品的影響，參照GB 5009.28—2016 中的液相色譜條件，用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱進行分析，改變A 相（甲醇） 的比例，獲得了山梨酸標準品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖。

山梨酸標準品在不同有機相比例下的色譜圖見圖2，慕薩萊思在不同有機相比例下的色譜圖見圖3。

圖2 山梨酸標準品在不同有機相比例下的色譜圖

圖3 慕薩萊思在不同有機相比例下的色譜圖

由圖2 和圖3 可知，A 相（甲醇） 比例對色譜圖中山梨酸的保留時間及峰形均具有較大影響。甲醇比例越大，山梨酸出峰時間越短，且峰形越尖銳，越有利于山梨酸的準確定量分析。由圖3 可知，隨著有機相比例的增加，慕薩萊思中山梨酸色譜峰保留時間縮短，然而當有機相比例為20%時，山梨酸色譜峰的基線不平，說明有機相比例增加，易引起色譜圖基線波動，導致山梨酸色譜峰基線不穩(wěn)，不利于山梨酸的準確定量。因此，慕薩萊思中山梨酸的分析應以15%的A 相（甲醇），在該條件下山梨酸的保留時間短，且基線平穩(wěn)。

2.3 氨水用量對山梨酸峰面積的影響

氨水作為樣品前處理中重要添加試劑，其影響因素不可小覷。首先按體積比1∶1 的比例配制氨水溶液，然后移取10 mL 慕薩萊思至容量瓶中，分別加入0，0.12，0.50，1.00，2.00，3.00 mL 氨水溶液，混勻后定容，過0.22 μm 針式濾頭，然后進行HPLC分析，記錄山梨酸的峰面積。

氨水用量對山梨酸鉀的峰面積的影響見表1。

表1 氨水用量對山梨酸鉀的峰面積的影響

盡管參照GB 5009.28—2016 的樣品處理需要添加氨水調節(jié)pH 值，但由表1 可知，慕薩萊思中添加氨水，對山梨酸峰鉀面積影響差異不顯著（p＞0.05），說明在慕薩萊思中山梨酸含量分析時，可以不添加氨水，稀釋后可以直接進行液相分析。

2.4 精密性試驗

移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進行HPLC分析，重復進樣6 次，記錄樣品中山梨酸鉀的峰面積，計算相對標準差（RSD）。

精密性試驗見表2。

表2 精密性試驗

由表2 可知，重復進樣6 次后所得標準差（SD）為11 828.79，相對標準差（RSD） 為1.12%，該方法測量山梨酸鉀精密度良好，試驗結果準確，可信度高。

2.5 穩(wěn)定性試驗

準備相同的慕薩萊思6 份，分別移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭備用，分別在室溫條件下放置0，12，24，48，72，96 h 再進行HPLC 分析，記錄樣品中山梨酸鉀的峰面積，計算相對標準差（RSD）。

穩(wěn)定性試驗見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗

由表3 可知，相對標準差（RSD） 為2.23%，放置時間對慕薩萊思樣品中山梨酸鉀含量影響很小，排除掉放置時間對慕薩萊思中山梨酸鉀含量的影響。

2.6 回收率試驗

首先稱取100 mg 山梨酸鉀標準品，用甲醇溶解定容至100 mL，獲得質量濃度為1 mg/mL 山梨酸標準溶液，準確移取10 mL 的慕薩萊思樣品至25 mL容量瓶中，添加一定體積山梨酸鉀標準溶液，混勻后用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進行HPLC 分析，根據峰面積計算樣品中山梨酸的含量。

山梨酸的回收率見表4。

表4 山梨酸的回收率

由表4 可知，其加標回收率高達94.11%，表明其測定慕薩萊思中山梨酸鉀方法準確度較高，試驗可信度良好。

2.7 山梨酸的液相色譜圖

對上述慕薩萊思樣品及山梨酸標品進行高效液相色譜分析，得其色譜圖。

山梨酸鉀標準品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖見圖4，山梨酸鉀標準品的最大吸收波長見圖5。

圖4 山梨酸鉀標準品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖

圖5 山梨酸鉀標準品的最大吸收波長

由圖4 可知，山梨酸鉀的保留時間為8.37 min。在200～400 nm 范圍內；由圖5 可知，山梨酸鉀的最大吸收波長為252 nm。

2.8 山梨酸鉀的標準曲線

稱取一定量山梨酸鉀標準物質，甲醇溶解定容，配制質量濃度約為1 mg/mL 的標準母液，用山梨酸鉀標準母液，配制系列質量濃度為0.78～50.00 μg/mL 的標準工作液，按照優(yōu)化后的HPLC 色譜條件分析，測定其峰面積。以峰面積為縱坐標，質量濃度（μg/mL） 為橫坐標，繪制山梨酸鉀標準曲線。上述慕薩萊思樣品及山梨酸標品進行高效液相色譜分析，得其色譜圖。

山梨酸標準品標準曲線見圖6。

圖6 山梨酸標準品標準曲線

由圖6 得到線性回歸方程為Y=80 171X+45 678，R2=0.999 9。按照Araujo P 等人[29]的方法計算，即檢測限（LOD） 為3×SD/m 和定量限（LOQ） 為10×SD/m，其中SD 為標準曲線的截距，m 為標準曲線斜率。該方法的檢測限（LOD） 和定量限（QOD） 分別為1.71 μg/mL 和5.70 μg/mL。這說明建立的方法適合慕薩萊思中山梨酸鉀質量濃度的測定。

2.9 慕薩萊思樣品中山梨酸鉀的測定

移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進行HPLC分析，用山梨酸鉀峰面積計算樣品中山梨酸鉀質量濃度。

慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質量濃度見圖7。

圖7 慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質量濃度

由圖7 可知，所檢測慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質量濃度差異很大，據GB 2760—2014—19《安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定，葡萄酒中山梨酸鉀最大使用量為200 mg/kg，而明顯看出D1 略微超此標準。經過后期對超標樣品糖度及酒精度檢測，發(fā)現超標樣品均為濃縮果汁或葡萄汁原糖漿，為商家發(fā)酵前原料，商家為延長其保存時間加入過量的山梨酸鉀，使得其保存時間增加，且高糖度利于后期發(fā)酵，減少經濟損失，在發(fā)酵期間會進行山梨酸鉀濃度降低處理，達到符合其成品慕薩萊思酒的標準范圍，因此前期樣品中山梨酸鉀量會有所偏高。綜上所述，樣品中山梨酸含量差異較大，在生產和貯藏慕薩萊思過程中要精準控制山梨酸鉀的質量濃度。

3 結論

首次成功建立并優(yōu)化了利用高效液相色譜法測定慕薩萊思中山梨酸鉀質量濃度的方法，利用HPLC法測定慕薩萊思中山梨酸鉀的峰面積和質量濃度之間具有良好的線性關系，測定結果具有較高準確率，且重復性好、回收率穩(wěn)定、操作簡便，為監(jiān)測慕薩萊思中的山梨酸鉀提供了有效的分析方法。