黃 帥,王 汀

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病,人病死率約100%[1]。暴露后最有效的防治手段是及時(shí)清洗傷口、接種免疫球蛋白及全程接種人用狂犬病疫苗[2-3]?？袢∫呙缰饕ㄟ^培養(yǎng)動物性細(xì)胞獲得,如Vero細(xì)胞疫苗、原代地鼠腎細(xì)胞疫苗及人二倍體細(xì)胞疫苗[4]。人二倍體細(xì)胞疫苗,系采用健康人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)培養(yǎng)狂犬病病毒,經(jīng)培養(yǎng)、收獲、濃縮、滅活病毒、純化后制備而成,有著無潛在致瘤DNA殘留和無外源蛋白過敏風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢,且具有更好的免疫原性[5]。

佐劑為一種非特異性免疫增強(qiáng)劑,能增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答,增強(qiáng)免疫反應(yīng)。BCG-CpG-DNA佐劑為一種新型生物佐劑,是從卡介菌(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)中提取的富含未甲基化CpG基序,該核酸片段具有強(qiáng)烈的免疫激活功能。其主要功能為刺激巨噬細(xì)胞、DC、B細(xì)胞等細(xì)胞成熟活化,激活TLR9受體,從而介導(dǎo)激活固有免疫并誘導(dǎo)機(jī)體建立強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng);并誘導(dǎo)IFN-α/β和IFN-γ等多種細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)抗病毒反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,提高抗體水平[6-7]。

Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,可通過檢測IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平來體現(xiàn)機(jī)體Th1型免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。

本研究評價(jià)了BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)在食蟹猴體內(nèi)的免疫原性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗 BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備,1.0 mL/劑;凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細(xì)胞)由成都康華生物制品有限公司生產(chǎn),1.0 mL/劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 普通級食蟹猴12只,雌雄各半,3～5歲,雄性體重 3.33～4.98 kg,雌性體重 2.56～3.29 kg,由廣西防城港常春生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2018-0005。

1.3 主要試劑及儀器 RFFIT實(shí)驗(yàn)用狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院;RFFIT實(shí)驗(yàn)用FITC標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白抗體,購自德國默克密理博公司;倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;熒光化學(xué)發(fā)光分析儀購自美國CTL公司;Monkey IL-2ELISpotPLUS(ALP)及Monkey IFN-γELISpotPRO(ALP)細(xì)胞因子檢測試劑盒購自MABTECH公司。

1.4 動物分組及免疫 將12只食蟹猴隨機(jī)分為對照組、3針組及4針組,每組4只,雌雄各半,經(jīng)后肢肌肉免疫,1.0 mL/劑。對照組接種市售凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細(xì)胞),按薩格勒布(Zagreb)方案[8],于0 d(2劑)、7 d及21 d各1劑,共4劑;4針組及3針組均接種BCG-CpG-DNA佐劑疫苗(MRC-5細(xì)胞);4針組按美國ACIP方案[9],于0 d、3 d、7 d及14 d各注射1劑,共4劑;3針組在Zagreb方案基礎(chǔ)上,將0 d的免疫降為1劑,其他免疫程序不變,共3劑。于初免當(dāng)天(0 d)及初免后7 d、14 d、28 d、35 d、49 d、63 d后肢隱靜脈采血,分離血清及外周血淋巴細(xì)胞,分別進(jìn)行體液免疫中和抗體檢測和細(xì)胞免疫細(xì)胞因子檢測。

1.5 免疫原性分析 采用《中國藥典》(四部)(現(xiàn)行版)中的快速熒光灶抑制試驗(yàn)(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)檢測食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗體,以血清中和抗體效價(jià)<0.5 IU/mL判為陰性,≥0.5 IU/mL判為陽性[10]。采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)檢測食蟹猴免疫前后外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2及IFN-γ的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 抗狂犬病病毒中和抗體水平 免疫前,各組食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗體水平均呈陰性,抗體轉(zhuǎn)陽率均為0%;首劑免疫后7 d,各組血清中抗體均>0.5 IU/mL,抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%。初次免疫后7～28 d,對照組及3針組血清中抗體水平呈上升趨勢,至28 d達(dá)最高,之后均呈下降趨勢;4針組在14 d達(dá)最高,之后呈下降趨勢。初次免疫后28 d,對照組、3針組中和抗體水平顯著高于4針組(t=2.529、4.068;P<0.05、P<0.001);初免后35 d,3針組中和抗體水平顯著高于4針組(t=3.277,P<0.01),其他同時(shí)間點(diǎn)各組血清中和抗體水平未發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;免疫后血清中抗體總水平為3針組>對照組>4針組,見表1,免疫后各組血清中和抗體變化趨勢見圖1。

圖1 各組食蟹猴血清中不同免疫時(shí)間抗狂犬病病毒中和抗體水平趨勢圖

表1 各組食蟹猴血清中不同免疫時(shí)間抗狂犬病病毒中和抗體水平

2.2 細(xì)胞免疫水平分析 初次免疫后,各組食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞中IL-2水平在7～14 d呈上升趨勢,至14 d達(dá)最高,之后呈下降趨勢,同時(shí)間各組外周血淋巴細(xì)胞中IL-2水平均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,免疫后IL-2總水平為3針組>4針組>對照組。初次免疫后,對照組外周血淋巴細(xì)胞中IFN-γ水平在7～28 d呈上升趨勢,至28 d達(dá)最高,之后呈下降趨勢;3針組及4針組IFN-γ水平在7～14 d呈上升趨勢,至14 d達(dá)最高,之后呈下降趨勢;初免后14 d,3針組IFN-γ水平顯著高于對照組,其他同時(shí)間點(diǎn)各組間IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;免疫后IFN-γ總水平為3針組>4針組>對照組,佐劑疫苗組IFN-γ較對照組的提前至14 d達(dá)高表達(dá)水平,見表2,免疫后外周血淋巴細(xì)胞中IL-2、IFN-γ水平變化趨勢見圖2。

圖2 各組食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞中不同免疫時(shí)間細(xì)胞因子水平

表2 各組食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞中不同免疫時(shí)間細(xì)胞因子水平(斑點(diǎn)數(shù)/孔,

3 討 論

狂犬病作為死亡率最高的傳染病之一,一旦發(fā)病,目前沒有有效的藥物可以治療[11]。接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病感染的必要途徑,但在一些發(fā)展中國家的使用仍然不足,致命的感染數(shù)量很高[12]。其中,人二倍體細(xì)胞疫苗作為國際公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)疫苗,生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴、限制其廣泛應(yīng)用[13]。因此新一代狂犬病疫苗研發(fā)需要降低成本和減少接種程序[14],而添加佐劑成為熱門研究方向,歷史上曾經(jīng)使用過鋁佐劑的狂犬病疫苗,但由于其延緩中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間,并且只誘導(dǎo)體液免疫,反而不利于狂犬病的預(yù)防[15],基于此,目前上市的滅活狂犬病疫苗都未添加佐劑,這也導(dǎo)致需要使用高濃度的抗原來確保免疫效果,從而導(dǎo)致高昂的成本。因此需要開發(fā)新型的佐劑狂犬病疫苗,通過提高免疫效果、降低成本,以助力WHO提出的2030年消滅人間狂犬病的目標(biāo)[16]。

目前人們一直致力于狂犬病疫苗新型佐劑的研究,如鞭毛蛋白佐劑、植物型多糖佐劑、CpG佐劑[17-18]等,其中BCG-CpG-DNA 作為天然的富含未甲基化CpG基序,與TLR9特異性結(jié)合,具有明顯的免疫激活作用,被認(rèn)為是一種有效的新型疫苗佐劑[19],已有研究證實(shí)在小鼠等模型中CpG可以減少狂犬病毒抗原使用量和免疫球蛋白使用量[20],但對免疫程序的研究尚有不足,尤其在非人靈長類模型中。目前,我國狂犬病暴露后推薦的免疫程序?yàn)?針法和2-1-1法,在2018年《狂犬病疫苗:WHO立場文件》中推薦暴露后免疫程序?yàn)楹喴?針法和2-1-1法。在保證效果的同時(shí)節(jié)約費(fèi)用和就醫(yī)程序,可以顯著提高患者依從性、減輕負(fù)擔(dān)[21]。因此,在本實(shí)驗(yàn)中使用4針法及簡易3針法來探討B(tài)CG-CpG-DNA佐劑狂犬病疫苗的免疫效果。在本實(shí)驗(yàn)中將食蟹猴隨機(jī)分為3針組、4針組及對照組,各組食蟹猴血清檢測結(jié)果顯示,3針組、4針組及對照組免疫前血清樣本中抗狂犬病病毒中和抗體水平均<0.5 IU/mL,呈陰性;在初次免疫7 d的抗體陽轉(zhuǎn)率均達(dá)100%,該陽性狀態(tài)可維持至少63 d;對照組和3針組在28 d抗體滴度均達(dá)最高,分別為215.95 IU/mL、293.20 IU/mL;4針組在14 d抗體滴度達(dá)最高,為100.95 IU/mL,遠(yuǎn)超過《狂犬病預(yù)防控制指南(2016版)》規(guī)定的0.5 IU/mL陽轉(zhuǎn)值標(biāo)準(zhǔn)。初免后28 d,對照組、3針組中和抗體水平顯著高于4針組。免疫后14 d開始,3針組中和抗體均值均大于4針組,免疫后28 d開始,3針組中和抗體平均值均大于對照組,整體血清抗體水平表現(xiàn)為3針組>對照組>4針組。顯示該佐劑疫苗在減少免疫劑量的情況下體液免疫反應(yīng)未降低。

3針組和4針組食蟹猴初次免疫后,外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)的IL-2及IFN-γ水平均在14 d達(dá)最高,其中3針組IFN-γ的水平顯著高于對照組,4針組IFN-γ平均值約為對照組2倍;對照組IL-2細(xì)胞因子表達(dá)水平趨勢與3針組及4針組一致,但I(xiàn)FN-γ水平在首免后28 d才達(dá)最高,但平均值與3針組、4針組的14 d表達(dá)水平相當(dāng)。整體細(xì)胞因子水平表現(xiàn)為3針組>4針組>對照組,顯示該佐劑疫苗可能更早的引起機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答,且在減少劑量的情況下細(xì)胞免疫反應(yīng)未降低。

綜上所述,接種BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)和接種市售凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細(xì)胞)后均能引起食蟹猴較高水平的特異性免疫應(yīng)答,且該佐劑狂犬病疫苗在簡易3針免疫程序下,產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫不弱于對照組的2-1-1程序,表明該佐劑疫苗具有較高的保護(hù)水平,較全面協(xié)同的體液免疫和細(xì)胞免疫保護(hù)機(jī)制,并可能減少免疫接種針次,在優(yōu)化狂犬病疫苗免疫接種程序中具有潛在價(jià)值。

利益沖突：無