孫 赫，王麗麗，康傳利，廉少杰，陳建英

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省皮膚與黏膜給藥工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 新型緩控釋制劑與藥物靶向遞送系統(tǒng)山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250101；3.國家藥監(jiān)局藥物制劑技術(shù)研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；4.山東百阜福瑞達(dá)制藥有限公司，山東 濟(jì)寧 273100；5.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

1909年Charles Tanret從麥角菌（Claviceps purpurea）中分離出含硫晶體化合物，并命名為麥角硫因（ergothioneine，EGT）。EGT作為一種天然手性氨基酸衍生物，存在硫醇和硫酮兩種互變異構(gòu)形式，在人體內(nèi)主要以硫酮形式存在[1]。與烷基硫醇谷胱甘肽（RSH）不同，這種咪唑硫酮結(jié)構(gòu)在溶液中不會(huì)自氧化，也不會(huì)在鐵鹽和氫過氧化物存在下誘導(dǎo)芬頓反應(yīng)[2]。研究表明EGT可抑制脂質(zhì)過氧化損傷[3]，清除羥自由基（·OH）[4]、超氧化物和單線態(tài)氧（1O2）等多種活性氧（ROS）物質(zhì)，是優(yōu)異的皮膚光敏保護(hù)劑[5-7]。人體內(nèi)的EGT并不是由人體本身合成，而是由放線菌、分枝桿菌等微生物合成后，通過植物吸收和食物鏈傳遞至人體內(nèi)積累而存在的。

皮膚衰老是機(jī)體衰老最直接的表現(xiàn)，除自然衰老等內(nèi)部因素外，引起皮膚衰老的還有諸如自然環(huán)境、外傷、接觸某些化學(xué)物質(zhì)等外界因素，其中最重要的是日曬，即光老化。陽光中的紫外輻射照射到人體表皮細(xì)胞后可產(chǎn)生1O2、·OH等有害物質(zhì)，誘發(fā)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞組織的損傷，并表現(xiàn)為皮膚的衰老和損傷。本文通過紫外線照射光敏劑羅丹明B（RhB）溶液誘發(fā)包括1O2在內(nèi)的自由基體系（下文簡稱UV-RhB體系）[8-10]，模擬紫外線照射人體皮膚產(chǎn)生ROS的情況，研究EGT在此體系下的抗氧化性能及其穩(wěn)定性，以期為EGT應(yīng)用于抗衰護(hù)膚品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Infinite M200PRO 酶標(biāo)儀（Tecan）；MS204TS/02 電子天平（Mettler Toledo）；SCIENTZ 03-II 紫外交聯(lián)儀（新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

EGT（化妝品級，批號(hào)：220308，山東百阜福瑞達(dá)制藥有限公司）；維生素C（藥用級，東北制藥集團(tuán)股份有限公司）；羅丹明B及其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 UV-RhB體系中EGT和VC抗氧化性能的測定

以pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS，取2.2 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4和8.5 g NaCl，加水溶解至1000 ml）為溶劑，分別配制0.001 %羅丹明B溶液（RhB）、0～1.00 mg/ml的EGT溶液及維生素C（VC）溶液。按表1配制測定溶液體系I、II，置紫外光（波長254 nm，光強(qiáng)度5 mW/cm2）下照射。分別于0，1 h時(shí)，采用酶標(biāo)儀，測定555 nm波長處吸收值（A0和A1），每個(gè)樣品平行3份，計(jì)算0 h和1 h吸光度變化量的平均值（ΔA），以ΔA空白為基線，按下式計(jì)算體系中活性物質(zhì)的抗氧化性能（F）。

表1 抗氧化作用測定溶液體系

式中，ΔA空白：空白對照溶液的吸收值的變化量（A0空白-A1空白）；ΔA樣品：樣品溶液的吸收值的變化量（A0樣品-A1樣品）。

2.2 離子強(qiáng)度對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系III，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對照，分別加入NaCl濃度分別為0 %，0.40 %，0.85 %，1.30 %，1.75 %的PBS。按2.1項(xiàng)下方法平行測定3份，取其平均值，計(jì)算不同離子強(qiáng)度體系的ΔA和F值。

2.3 pH值對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系IV，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對照，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)PBS緩沖液pH值為3.0，5.0，7.2，9.0，11.0。按2.1項(xiàng)下方法平行測定3份，取其平均值，計(jì)算不同pH體系的ΔA和F值。

2.4 還原劑對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系V，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照，Na2SO3溶液以PBS緩沖液為溶劑，濃度分別為0 %，0.02 %，0.05 %，0.10 %，0.25 %，0.50 %。按2.1項(xiàng)下方法平行測定3份，取其平均值，計(jì)算不同還原劑濃度體系的ΔA和F值。

2.5 金屬離子對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系VI，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照。分別加入0.05 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+生理鹽水溶液。按2.1項(xiàng)下方法平行測定3份，取其平均值，計(jì)算不同金屬離子體系的ΔA和F值。

2.6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系VII，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照。分別加入0.10 mol/L的Fe3+溶液和0 %，0.02 %，0.04 %，0.10 %，0.20 %的EDTA溶液。按2.1項(xiàng)下方法平行測定3份，取其平均值，計(jì)算不同EDTA濃度體系的ΔA和F值。

3 結(jié)果與分析

3.1 EGT和VC的抗氧化量效關(guān)系

不同濃度EGT和VC的抗氧化性能見圖1。由圖1可見，0～1 mg/ml范圍內(nèi)，EGT和VC的F值隨濃度的升高而增大，且相同濃度下EGT的F值一直高于VC，表明EGT和VC抗氧化作用具有較好的量效關(guān)系，同時(shí)在此體系下EGT的抗氧化性能優(yōu)于VC。

圖1 不同濃度EGT和VC的抗氧化性能

3.2 離子強(qiáng)度對EGT抗氧化性能的影響

離子強(qiáng)度對EGT抗氧化性能的影響見圖2。由圖2可見，NaCl濃度在0 %～0.85 %范圍內(nèi)，EGT的F值較為穩(wěn)定，當(dāng)NaCl濃度高于0.85 %時(shí)，F(xiàn)值急劇下降，表明此時(shí)EGT抗氧化性能受到體系內(nèi)高離子強(qiáng)度的抑制而顯著降低。

圖2 離子強(qiáng)度對EGT抗氧化性能的影響

3.3 pH值對EGT抗氧化性能的影響

pH值對EGT抗氧化性能的影響見圖3。由圖3可見，在pH 5～9范圍內(nèi)EGT的F值變化相對較小，表明EGT抗氧化活性在pH 5～9范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。

圖3 pH值對EGT抗氧化能力的影響

3.4 還原劑對EGT抗氧化性能的影響

還原劑亞硫酸鈉對EGT抗氧化性能的影響見圖4。由圖4可見，隨著亞硫酸鈉濃度的增大，F(xiàn)值呈下降趨勢，表明在此體系中加入亞硫酸鈉可抑制EGT的抗氧化活性。亞硫酸鈉濃度大于0.1 %時(shí)，F(xiàn)值趨于穩(wěn)定，表明其抑制作用趨于平緩。

圖4 亞硫酸鈉對EGT抗氧化性能的影響

3.5 金屬離子對EGT抗氧化性能的影響

不同金屬離子對UV-RhB體系的影響見圖5A。結(jié)果顯示，與Na+體系相比，K+、Mg2+、Zn2+體系中ΔA空白變化較小，表明加入這3種離子對體系內(nèi)RhB的降解速率影響較??；Cu2+對RhB的降解速率有較明顯的抑制，而加入Fe3+后，體系中RhB降解速率顯著提高，分析原因?yàn)镕e3+在水中形成Fe(OH)2+，經(jīng)光照射生成Fe2+和羥自由基[11-13]，增大了體系內(nèi)自由基的濃度，進(jìn)一步加劇了RhB的降解。

圖5 不同金屬離子對UV-RhB體系及EGT抗氧化性能的影響

不同金屬離子對EGT抗氧化性能的影響見圖5B。結(jié)果顯示，與Na+體系相比，Zn2+對EGT抗氧化性能沒有明顯影響，K+、Mg2+對EGT的抗氧化作用有一定程度的抑制，Cu2+在抑制RhB降解的同時(shí)對EGT的抗氧化性能也有較為明顯的抑制作用。而在體系中加入Fe3+，RhB降解速率提高的同時(shí)，EGT的抗氧化性能也得到了明顯的提升，這也表明EGT可有效抑制Fe3+誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

EDTA對EGT抗氧化性能的影響見圖6。由圖6可見，在添加Fe3+的體系中，EGT抗氧化性能隨EDTA的濃度增加而減小，分析原因?yàn)镋DTA與Fe3+形成金屬絡(luò)合物后降低了體系內(nèi)Fe3+的濃度，削弱了Fe3+對UV-RhB體系和EGT抗氧化性能的影響。

圖6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

4 結(jié)論

光老化、氧化自由基和皮膚糖化被認(rèn)為是皮膚衰老的直接原因。其中，紫外照射皮膚后能產(chǎn)生1O2、脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)過氧化物（LPO）等物質(zhì)，降低皮膚細(xì)胞抗氧化防御能力，導(dǎo)致膠原蛋白酶和彈性蛋白酶的釋放，并破壞兩種蛋白質(zhì)和結(jié)締組織，造成皮膚衰老、損傷等多種問題。本文通過建立紫外輻射光敏劑誘發(fā)自由基體系，測定抗氧化活性物質(zhì)的抗氧化性能。在此體系下EGT表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能，且在低離子強(qiáng)度和pH 5～9范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。