胡會杰，鄭曉璐，雷立峰

0 引言

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡率較高的惡性腫瘤之一，5年生存率（診斷后）低于20%，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%[1-2]。盡管NSCLC的治療取得了重大進(jìn)展，但其復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高，仍需要更加全面地研究NSCLC的潛在機(jī)制[3]。越來越多的研究已證明JAK2/STAT3信號通路是促進(jìn)各種惡性腫瘤細(xì)胞生長和進(jìn)展的關(guān)鍵信號通路，通過靶向抑制JAK2/STAT3通路將是治療NSCLC的好方法[4]。

目前，對NSCLC的治療主要以靶向治療、手術(shù)和化療相結(jié)合的方法，但這些治療方法的不良反應(yīng)強(qiáng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。天然化合物可輔助治療腫瘤，并有不良反應(yīng)少的優(yōu)點[5]。檸檬苦素是柑橘類水果中的重要生物活性物質(zhì)，具有抗癌、抗病毒、抗炎、抗動脈粥樣硬和保護(hù)肝臟等作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素通過在各種人類腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出抗癌潛力，如結(jié)腸癌細(xì)胞、口腔癌細(xì)胞、黑色素瘤和骨肉瘤細(xì)胞等[7]。值得注意的是，已有研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可抑制肺癌細(xì)胞A549的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出抗肺癌的潛力[8]。然而，檸檬苦素對NSCLC的影響機(jī)制尚未完全闡明。因此本研究基于JAK2/STAT3信號通路探討檸檬苦素對NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549獲自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實驗試劑

檸檬苦素（SC11812）購自北京凱詩源生物科技有限公司；JAK2激活劑Coumermycin A1（HY-N7452）和JAK2抑制劑AG490（HY-12000）購自美國MCE公司；Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡試劑盒（556547）購自美國BD公司；抗體白介素-6（IL-6，ab233706）、JAK2（ab108596）、STAT3（ab68153）、E-鈣黏蛋白（E-Cadherin，ab1416）、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin，ab76011）、波形蛋白（Vimentin，ab92547）、GAPDH（ab8245）和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（ab6721）購自英國Abcam公司；抗體p-JAK2（PA5-37618）和p-STAT3（MA5-11189）購自美國ThermoFisher公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

RPMI 1640培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2～3 d換液一次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期進(jìn)行實驗。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況

將細(xì)胞以每孔1×104個的密度培養(yǎng)于96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液。A549細(xì)胞分別用0、5、10、25、50、75、100 μmol/L檸檬苦素[8]干預(yù)24 h。之后每孔加入10 μl CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度值。

1.5 細(xì)胞分組

將各組細(xì)胞分為NC組（正常培養(yǎng)A549細(xì)胞），檸檬苦素低劑量組（10 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞24 h）、檸檬苦素中劑量組（25 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞24 h）、檸檬苦素高劑量組（50 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞24 h）、Coumermycin A1組[9]（10 μmol/L JAK2激活劑Coumermycin A1+50 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞24 h）、AG490組[10]（10 μmol/L JAK2抑制劑AG490+50 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞24 h）。

1.6 克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞克隆情況

將各組細(xì)胞以每孔1 000個的密度接種到六孔板中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后取出六孔板，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，洗滌，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)＞50個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.7 Transwell小室檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲

將100 μl基質(zhì)膠稀釋液預(yù)涂在上室中，使用無血清培養(yǎng)基懸浮各組細(xì)胞使其濃度為5×104個/毫升，200 μl細(xì)胞液接種到上室，下室加入600 μl含有10%FBS的培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。下室細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定30 min后用0.5%結(jié)晶紫染色。拍照，并使用Image J軟件計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞遷移實驗無需基質(zhì)膠稀釋液孵育，直接向上室中加入細(xì)胞液，其余過程同侵襲實驗。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

收集各組細(xì)胞，洗滌后使用100 μl緩沖液重懸細(xì)胞，再分別用5 μl Annexin V-FITC和PI染液，室溫下避光染色15 min，使用流式細(xì)胞儀在染色1 h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞用RIPA裂解液裂解提取總蛋白，并使用BCA法檢測總蛋白濃度。使用10%SDS-PAGE分離20 μl總蛋白，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，然后與一抗IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和GAPDH在4℃下孵育過夜。然后將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。TBST洗滌后，使用ECL顯色觀察蛋白質(zhì)條帶，并使用Image J軟件量化蛋白的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析使用SPSS 25.0軟件，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用單因素方差分析不同組之間的差異，兩組間差異使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度檸檬苦素對A549細(xì)胞增殖的影響

與0 μmol/L檸檬苦素組相比，5、10、25、50、75、100 μmol/L檸檬苦素干預(yù)A549細(xì)胞，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低（均P＜0.001），IC50為（45.16±1.66）μmol/L。綜合考慮，后續(xù)選取10、25、50 μmol/L的檸檬苦素劑量組作為實驗低、中、高劑量組，見表1。

表1 不同濃度檸檬苦素對A549細(xì)胞增殖的影響 (±s)Table 1 Effect of different concentrations of limonin on proliferation of A549 cells (±s)

表1 不同濃度檸檬苦素對A549細(xì)胞增殖的影響 (±s)Table 1 Effect of different concentrations of limonin on proliferation of A549 cells (±s)

Note: a, b, c, d, e, f: P＜0.05, compared with 0, 5, 10, 25, 50, 75 μmol/L,respectively.

Concentration (μmol/L) Cell viability (%)0 97.95±2.63 5 88.31±2.17a 10 76.84±3.04ab 25 61.43±2.45abc 50 49.32±2.06abcd 75 42.23±1.98abcde 100 30.55±2.36abcdef

2.2 檸檬苦素對A549細(xì)胞克隆形成的影響

與NC組相比，不同檸檬苦素劑量組細(xì)胞克隆數(shù)呈劑量依賴性降低（均P＜0.001）；與檸檬苦素高劑量組相比，Coumermycin A1組細(xì)胞克隆個數(shù)增加（P＜0.001），AG490組進(jìn)一步降低了細(xì)胞克隆數(shù)（P＜0.001），見圖1、表2。

圖1 檸檬苦素對A549細(xì)胞克隆形成的影響Figure 1 Effect of limonin on clonogenic ability of A549 cells

表2 檸檬苦素對A549細(xì)胞克隆形成的影響 (±s)Table 2 Effect of limonin on clonogenic ability of A549 cells (±s)

表2 檸檬苦素對A549細(xì)胞克隆形成的影響 (±s)Table 2 Effect of limonin on clonogenic ability of A549 cells (±s)

Note: *, #, &, @: P＜0.05, compared with the NC, Low-dose limonin,Medium-dose limonin, High-dose limonin groups, respectively.

Groups Number of cell clones NC group 102.67±2.91 Low-dose Limonin group 71.67±2.34*Medium-dose Limonin group 56.83±2.58*#High-dose Limonin group 43.50±1.93*#&Coumermycin A1 group 59.17±2.77@AG490 group 30.33±2.14@

2.3 檸檬苦素對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與NC組相比，不同檸檬苦素劑量組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)呈劑量依賴性降低（均P＜0.001）；與檸檬苦素高劑量組相比，Coumermycin A1組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加（均P＜0.001），AG490組進(jìn)一步降低了細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)（均P＜0.001），見圖2、3和表3。

圖2 檸檬苦素對A549細(xì)胞遷移的影響Figure 2 Effect of limonin on migration of A549 cells

圖3 檸檬苦素對A549細(xì)胞侵襲的影響Figure 3 Effect of limonin on invasion of A549 cells

表3 檸檬苦素對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響 (±s)Table 3 Effect of limonin on migration and invasion of A549 cells (±s)

表3 檸檬苦素對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響 (±s)Table 3 Effect of limonin on migration and invasion of A549 cells (±s)

Note: *, #, &, @: P＜0.05, compared with the NC, Low-dose limonin,Medium-dose limonin, High-dose limonin groups, respectively.

Groups Cell migration number Cell invasion number NC group 172.17±7.25 135.50±6.59 Low-dose Limonin group 147.50±7.02* 104.17±5.81*Medium-dose Limonin group 111.33±7.35*# 83.33±6.06*#High-dose Limonin group 86.83±6.72*#& 67.67±5.35*#&Coumermycin A1 group 105.33±6.60@ 79.17±6.34@AG490 group 72.50±6.11@ 50.67±5.24@

2.4 檸檬苦素對A549細(xì)胞凋亡的影響

與NC組相比，檸檬苦素不同劑量組凋亡率呈劑量依賴性上升（均P＜0.001）；與檸檬苦素高劑量組相比，Coumermycin A1組凋亡率下降（均P＜0.001），而AG490組凋亡率進(jìn)一步升高（均P＜0.001），見圖4。

圖4 檸檬苦素對A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of limonin on apoptosis of A549 cells

2.5 檸檬苦素對A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC組相比，不同檸檬苦素劑量組IL-6、p-JAK2、p-STAT3、N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低，E-Cadherin表達(dá)升高（均P＜0.01）；與檸檬苦素高劑量組相比，Coumermycin A1組p-JAK2（P＜0.001）、p-STAT3（P＜0.001）、N-Cadherin（P=0.030）和Vimentin（P＜0.001）蛋白表達(dá)升高，E-Cadherin表達(dá)降低（P=0.011），IL-6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.974），而AG490組p-JAK2（P＜0.001）、p-STAT3（P＜0.001）、N-Cadherin（P=0.030）和Vimentin（P＜0.001）蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，E-Cadherin表達(dá)進(jìn)一步升高（P=0.018），IL-6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.867），見圖5（數(shù)據(jù)表請掃描本文OSID碼）。

圖5 檸檬苦素對A549細(xì)胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of limonin on IL-6, JAK2, p-JAK2,STAT3, p-STAT3, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin protein expression in A549 cells

3 討論

轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的一個連續(xù)的、周期性的過程，包括生長、遷移和侵襲。其中，EMT被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的初始過程，在此過程中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附減少并伴隨更高的細(xì)胞遷移和侵襲現(xiàn)象[11]。EMT過程通常伴隨著間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如Vimentin和N-Cadherin的過度表達(dá)和上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-Cadherin的下調(diào)[12]。檸檬苦素是一種存在于柑橘類水果中的四環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性[13]。多方面研究報道檸檬苦素凋亡，起到抗卵巢癌作用[17]。另外，檸檬苦素也可抑制STAT3轉(zhuǎn)錄活性抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖遷移能力[18]。JAK2/STAT3信號通路主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)。在正常組織中，JAK2/STAT3信號通路受到嚴(yán)格調(diào)控，STAT處于非活動狀態(tài)[1]。當(dāng)被激活時，JAK會誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中單體STAT分子的磷酸化，形成STAT二聚體并將它們轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)基因表達(dá)[19]。研究表明，JAK2/STAT3信號通路異常激活發(fā)生在肺癌等腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲，促能夠抑制多種癌細(xì)胞生長，在癌癥防治方面具有很大潛力[14]。本研究通過體外細(xì)胞實驗探討檸檬苦素對NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及EMT過程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這一結(jié)果與Fan等[15]結(jié)果基本一致，表示檸檬苦素可抑制NSCLC惡性生物學(xué)行為。值得注意的是，本研究前期預(yù)實驗通過檢測實驗濃度的檸檬苦素對正常肺上皮細(xì)胞（Beas-2B）的作用，結(jié)果顯示，實驗濃度的檸檬苦素對正常肺上皮細(xì)胞（Beas-2B）的增殖幾乎無影響，可說明檸檬苦素對細(xì)胞無毒。后續(xù)進(jìn)一步探究檸檬苦素對NSCLC的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可通過多種方式抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。檸檬苦素可通過阻斷VEGF與VEGFR2的結(jié)合抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[16]，也可通過激活p53信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)癌癥浸潤、轉(zhuǎn)移和EMT[3]。因此認(rèn)為抑制JAK2/STAT3通路持續(xù)性激活是癌癥化療過程中一個有希望的靶點[20]。研究顯示IL-6的分泌和JAK2/STAT3通路的異常激活與多種癌癥的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)，IL-6能通過結(jié)合細(xì)胞表面上的IL-6受體（IL-6R）來導(dǎo)致JAK2激活，進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞存活率，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力[21]。本研究進(jìn)一步研究了檸檬苦素抑制A549細(xì)胞增殖可能的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可抑制IL-6、p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平，提示檸檬苦素可能是通過抑制JAK2/STAT3通路發(fā)揮抗肺癌作用，其可能通過抑制細(xì)胞因子IL-6的分泌進(jìn)一步抑制JAK2/STAT3通路，最終抑制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。進(jìn)一步通過功能回復(fù)實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK2激活劑Coumermycin A1會逆轉(zhuǎn)檸檬苦素對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT過程抑制作用，然而使用JAK2抑制劑AG490與檸檬苦素共同作用時，增強(qiáng)了檸檬苦素對NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡水平，證明了JAK2/STAT3通路在檸檬苦素抑制NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為發(fā)揮的作用。

綜上所述，檸檬苦素可通過抑制JAK2/STAT3通路，抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為，本研究進(jìn)一步豐富了檸檬苦素抑制NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的潛在機(jī)制，并為以JAK2/STAT3通路為靶點研究新的治療NSCLC的藥物提供了實驗依據(jù)。但本研究仍存在不足之處，檸檬苦素抑制JAK2/STAT3通路的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。