聶芙蓉， 郭良興， 楊金金， 馮海博， 徐紅蕊， 周亞星， 李夢(mèng)云

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省非常規(guī)飼料創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450046；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046）

黃秋葵（Okra，Hibiscus esculentus L.），屬錦葵科秋葵屬一年生草本植物，果實(shí)中富含粗蛋白質(zhì)、氨基酸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及多糖、黃酮類等活性組分（皇圓圓等，2019）。 黃秋葵收獲后剩余的大部分青綠葉片及嫩枝粗蛋白質(zhì)含量高， 特別是葉片中的葉黃素和β- 胡蘿卜素含量較高， 是其他牧草的2 倍以上。 研究表明， 黃秋葵莖葉粉中粗蛋白質(zhì)為17.47%、粗灰分為13.48%、粗纖維為10.9%、粗脂肪為7.08%、無(wú)氮浸出物為51.07%、葉黃素含量2370 mg/kg 左右， 具有較高的利用價(jià)值（侯冠彧等，2006）。如果將黃秋葵莖葉飼料化進(jìn)行利用，不但能變廢為寶，有利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，也使難以處理的秋葵秸稈成為一種優(yōu)質(zhì)新型飼料， 有利于擴(kuò)大飼料資源，降低養(yǎng)殖成本。 目前，研究主要集中在黃秋葵對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響方面（張海文等，2017），關(guān)于黃秋葵莖葉在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬選取黃秋葵秸稈作為材料， 研究肉兔日糧中添加不同量黃秋葵秸稈對(duì)其生產(chǎn)性能、血液生化指標(biāo)、盲腸微生物多樣性的影響， 篩選出黃秋葵秸稈在肉兔日糧中適宜的添加比例， 為黃秋葵秸稈作為飼料原料的利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 黃秋葵秸稈為黃秋葵收獲后剩余的大部分青綠葉片及嫩枝，購(gòu)買于孟州市。將其60 ℃烘干，粉碎過(guò)60 目篩，測(cè)定常規(guī)養(yǎng)分及主要活性組分含量，測(cè)定參照賀建華（2020）和黃阿根等（2007）方法進(jìn)行。 具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 黃秋葵秸稈的營(yíng)養(yǎng)組成（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物 選用35 日齡體重相近、健康狀態(tài)良好的伊普呂斷奶肉兔80 只，隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)組（4%組、6%組和8%組），每組5 個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)4 只兔。 對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂含4%、6%、8%黃秋葵秸稈的飼糧。 預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期35 d。

1.3 試驗(yàn)日糧 肉兔日糧參考 《肉兔營(yíng)養(yǎng)需要量》（NY /T 4049-2021） 飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，試驗(yàn)各組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在濟(jì)源陽(yáng)光兔業(yè)科技有限公司祖代肉兔場(chǎng)進(jìn)行。 試驗(yàn)前對(duì)兔舍及試驗(yàn)用具進(jìn)行清洗， 熏蒸消毒， 火焰噴槍高溫灼燒兔籠滅菌。 試驗(yàn)期間按照陽(yáng)光兔業(yè)常規(guī)免疫程序免疫接種，30 d 接種二聯(lián)疫苗， 之后每周1 次接種其他疫苗，直至4 次全部接種完成。 試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)所用的九號(hào)兔舍自然采光、通風(fēng)，室溫保持在6 ～9 ℃。 除每天下午3 點(diǎn)定時(shí)喂料外，其余時(shí)間不喂料，自由飲水。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定 以重復(fù)為單位， 正式試驗(yàn)的第1 天和第35 天早晨空腹稱重，用于計(jì)算平均日增重；每天收集料盒剩料并稱重，根據(jù)飼喂投料量計(jì)算平均日采食量； 根據(jù)平均日增重和平均日采食量計(jì)算料重比。 每天觀察記錄所有試驗(yàn)兔的腹瀉和死亡情況， 每只兔腹瀉1 d 記為1 個(gè)腹瀉只次，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算各組的腹瀉率。

腹瀉率/%=[腹瀉只次總數(shù)/（試驗(yàn)兔總頭數(shù)×試驗(yàn)總天數(shù)）]×100。

1.5.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)束后， 從每個(gè)重復(fù)選取1 只平均體重接近且健康狀況良好的肉兔進(jìn)行屠宰，接取全血暫存于抗凝管內(nèi)，隨即利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5.3 盲腸菌群多樣性分析 在無(wú)菌條件下，用眼科剪在盲腸閉合處開(kāi)口， 將盲腸內(nèi)容物采集到無(wú)菌的凍存管中，迅速投入液氮中，放置入-80 ℃冰箱中保存，用于微生物多樣性檢測(cè)。隨后將樣品送至武漢生物科技有限公司， 使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)盲腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序， 分析肉兔盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)用Excel 2016 軟件初步處理后，采用SPSS Statistics25.0 進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)， 試驗(yàn)結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響 由表3 可知， 和對(duì)照組相比，4%添加組末重、 平均采食量與平均日增重?zé)o顯著差異（P > 0.05）。 而8%組末重、平均采食量與平均日增重則顯著降低（P < 0.05）。 數(shù)據(jù)還表明，日糧中添加4%和6%黃秋葵秸稈對(duì)料重比無(wú)顯著影響（P > 0.05），當(dāng)添加量達(dá)到8%，料重比顯著增加（P < 0.05）。 日糧中添加秋葵秸稈可以改善、降低肉兔生長(zhǎng)過(guò)程中的腹瀉情況， 其中以4%添加量效果最好。

表3 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響 由表4 可知，與對(duì)照組相比，4%組、6%組和8%組的總膽固醇分別降低了0.62、0.4、0.32 mmol/L， 其中4%組與對(duì)照組差異顯著 （P < 0.05）； 總膽紅素分別降低了10.96、10.52、9.93 μmol/L； 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶分別升高了12.67、21.00、32.17 U/L， 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶也有一定提高，肌酐、尿素有一定降低，但均差異不顯著（P > 0.05）。

表4 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 盲腸菌群OTUs 數(shù)量分析 如圖1 所示，4組有效序列的聚類，總共有OTUs 的數(shù)目為21231個(gè)， 對(duì)照組、4%組、6%組和8%組OTUs 數(shù)目分別為6749、6189、4960 和6846。4 組中共有OTUs 數(shù)目為262 個(gè)，對(duì)照組、4%組、6%組和8%組組獨(dú)有的OTUs 數(shù)目分別為5196、4609、3711、5301 個(gè)。

圖1 韋恩圖

2.3.2 Alpha 多樣性分析 由表5 可知， 各組的覆蓋率均超過(guò)0.96，平均覆蓋率為97%，說(shuō)明測(cè)序樣品滿足后續(xù)盲腸菌群生物信息學(xué)分析的要求。Chao1 指數(shù)，6%添加組顯著低于對(duì)照組、4%組和8%組 （P < 0.05），Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，4 組之間差異均不顯著（P > 0.05）。

表5 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔盲腸菌群Alpha 多樣性指數(shù)影響

2.3.3 門水平 由表6 可知，4 組中的三大優(yōu)勢(shì)菌群占盲腸微生物豐度的比例為97.21%、96.21%、96.35%、97.32%， 且4 組間在厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門的相對(duì)豐度上，均差異不顯著（P > 0.05）。 厚壁菌門的相對(duì)豐度最高的為8%添加組達(dá)到91.65%，并且在3 個(gè)試驗(yàn)組中隨著黃秋葵秸稈添加比例的增加， 相對(duì)豐度呈逐漸遞增的趨勢(shì)。 其余5 個(gè)菌門的豐度均在0.01%~ 1%，其中軟壁菌門、糖化菌門、放線菌門的相對(duì)豐度4 組之間均差異不顯著（P > 0.05），變形菌門的相對(duì)豐度8%組顯著低于其他組（P < 0.05），藍(lán)細(xì)菌門相對(duì)豐度對(duì)照組顯著高于其他組（P < 0.05）。

表6 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔盲腸菌群門水平相對(duì)豐度的影響

2.3.4 屬水平 由表7 可知，4%添加組罕見(jiàn)小球菌屬的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組和6%添加組（P< 0.05），其他菌屬的相對(duì)豐度各組之間均差異不顯著（P > 0.05），但添加黃秋葵秸稈可以增加顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度。

表7 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔盲腸菌群屬水平相對(duì)豐度的影響

3 討論

3.1 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響 目前關(guān)于黃秋葵秸稈對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。 王明海等（2021）在肉兔日糧中添加1%、2%、3%和4%黃秋葵粉， 發(fā)現(xiàn)各組采食量無(wú)顯著差異， 但3%添加組平均日增重顯著增加，料重比顯著降低，表明肉兔飼料中黃秋葵的適宜添加量為3%。 吳佳靜等（2012）在蛋雞飼料中添加不同比例的黃秋葵葉粉，結(jié)果表明，當(dāng)在海蘭褐蛋雞飼料中添加3%~ 4%黃秋葵時(shí)，可提高海蘭褐蛋雞的產(chǎn)蛋率， 添加量為4%~ 5%則會(huì)導(dǎo)致蛋雞采食量降低， 而5%~ 6%的添加量則會(huì)導(dǎo)致海蘭褐蛋雞的產(chǎn)蛋率下降。 本試驗(yàn)結(jié)果表明， 在肉兔日糧中添加4%的黃秋葵秸稈對(duì)其采食量、日增重及料重比均無(wú)顯著影響，但當(dāng)添加量達(dá)到6%和8%時(shí)，就會(huì)顯著降低生產(chǎn)性能。 這可能是因?yàn)槠渲械拇掷w維含量較高，影響了適口性，故而肉兔采食量會(huì)降低。同時(shí)還含有大量的多糖，多糖具有一定的黏性， 隨著日糧中添加的黃秋葵秸稈含量增加，日糧的硬度和黏度也隨之增加，故而日糧中黃秋葵秸稈比例越大， 日糧顆粒飼料的硬度越大， 肉兔采食越困難， 故而采食量也會(huì)降低。 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明了黃秋葵秸稈中的多糖和黃酮含量較高， 這也會(huì)導(dǎo)致粗纖維在消化道中能結(jié)合大量的水，使消化道的食糜體積增大，黏度增加，并形成凝膠，進(jìn)而引起腸道微生物異常繁殖，造成動(dòng)物生長(zhǎng)受阻（辛松林等，2020），因而降低動(dòng)物生產(chǎn)性能。

斷奶幼兔因生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)快， 消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，胃酸和消化酶分泌不足，從而導(dǎo)致腹瀉甚至死亡（張海文等，2017）。日糧中添加一定量的黃秋葵秸稈可以有效改善肉兔的腹瀉狀況、 顯著降低肉兔的死亡率；其中，以4%的添加量效果最好，這是因?yàn)辄S秋葵秸稈中含有豐富的維生素（盧隆杰等，2004）和黃酮類物質(zhì)，黃酮具有抗氧化（龍春等，2006）、防癌癥的功效，可以顯著降低肉兔生長(zhǎng)疾病的發(fā)生、 減少肉兔腸道內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌的感染，從而降低腹瀉率和死亡率。

3.2 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響 斷奶肉兔生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)可以反映機(jī)體各項(xiàng)生理特征以及變化趨勢(shì)，從而反映出斷奶肉兔生長(zhǎng)狀況（Joshi，2002）。 AST和ALT 活性可反映肝臟對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝能力（張邦等，2022）。 本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的AST 和ALT 均有所上升，可能是因?yàn)辄S秋葵秸稈中含有大量黃酮、糖苷和多糖等生物活性成分，黃酮類具有抗氧化（劉輝等，2020；龍春等，2006）、提高肝臟代謝的能力，而多糖可以降低血脂（趙勝男等，2019），是保護(hù)肝臟的主要活性成分之一。 血清膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平是機(jī)體脂肪沉積的重要指標(biāo)（郭志強(qiáng)等，2022；王敬軍，2020），本試驗(yàn)中黃秋葵秸稈的添加，斷奶肉兔血液中總膽固醇有著不同比例的降低，表明黃秋葵秸稈具有一定調(diào)節(jié)脂肪代謝的作用。 肌酐是機(jī)體組織中的代謝產(chǎn)物，血液中肌酐含量升高可能是因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)鉀離子、鈣離子等元素失衡所致；尿素是哺乳動(dòng)物的代謝含氮終產(chǎn)物，當(dāng)肝腎發(fā)生炎癥或者重大疾病時(shí)，體內(nèi)尿素含量會(huì)非正常性的升高；本試驗(yàn)中黃秋葵秸稈添加組與對(duì)照組相比肌酐和尿素均有所降低，這與張艷軍等（2021）關(guān)于黃秋葵秸稈中的黃秋葵多糖可以降低血液中的血脂，改善腎臟組織的病理變化以及宋春蕾等（2017）表明黃秋葵秸稈具有一定的保肝護(hù)腎功能等相一致。

3.3 飼糧中添加不同比例黃秋葵秸稈對(duì)肉兔盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響 Alpha 多樣性又稱為生物境內(nèi)多樣性，是指一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的多樣性，通常是用來(lái)反映微生物群落豐富度和多樣性的綜合性指標(biāo)。Chao1 指數(shù)常用來(lái)反映菌群豐富度，Chao1 指數(shù)越大，說(shuō)明物種豐富度越高。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來(lái)反映菌群多樣性（Holmstron 等，2004），Shannon 指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性也越高。 由本試驗(yàn)結(jié)果可知，Chao1 指數(shù)，6%添加組顯著低于對(duì)照組、4%組和8%組 （P < 0.05），Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，4 組之間差異均不顯著（P > 0.05）。說(shuō)明了添加6%的黃秋葵秸稈量可以降低盲腸微生物菌群的豐度，這可能是因?yàn)辄S秋葵秸稈中的某些成分選擇性的促進(jìn)益生菌的增殖，抑制其他致病菌的生長(zhǎng)，從而使菌群的豐度和數(shù)量降低，這與張江亮等（2021）的研究結(jié)果基本一致。

本研究結(jié)果表明， 各組肉兔盲腸微生物菌群門水平的優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門、 擬桿菌門和疣微菌門，其中相對(duì)豐度最高的是厚壁菌門，其次是擬桿菌門、疣微菌門，這些結(jié)果與前人對(duì)肉兔盲腸菌群結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果相一致（馮國(guó)亮，2020； 武帥，2019）。 厚壁菌門的纖維分解菌較豐富，并且擬桿菌門相對(duì)豐度較高時(shí)， 纖維分解菌的含量也有所增加，因此當(dāng)厚壁菌門和擬桿菌門的豐度升高，盲腸的發(fā)酵作用也隨之增強(qiáng)（徐靜，2020）。另外厚壁菌門的有益菌群包括雙歧桿菌和乳酸桿菌等，有益菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)， 菌群間形成一種相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)， 當(dāng)菌群失衡時(shí)會(huì)引起腹瀉和炎癥（李岫怡，2019），擬桿菌門在維持腸道微生態(tài)平衡方面起著重要性作用， 可以改善宿主的健康狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組中隨著黃秋葵秸稈的添加量增加， 厚壁菌門的相對(duì)豐度不斷增加，且8%的添加組高于對(duì)照組， 說(shuō)明添加8%的黃秋葵秸稈可以提高厚壁菌門的豐度， 增加有益菌的含量，提高日糧纖維的發(fā)酵分解。變形菌門在肉兔盲腸菌群中所占比例較少，多為致病性病原菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺旋桿菌等病原菌。 大腸桿菌和沙門氏菌在畜禽養(yǎng)殖中嚴(yán)重危害著動(dòng)物機(jī)體的健康與引起腸道炎癥有關(guān)， 如腸病和壞死性小腸結(jié)腸炎（張?chǎng)危?018）。 本試驗(yàn)中添加8%的黃秋葵秸稈顯著性降低了變形菌門的相對(duì)豐度，并且隨著黃秋葵秸稈的添加量的增加， 變形菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。 以上說(shuō)明添加8%的黃秋葵秸稈可以提高肉兔盲腸微生物的部分優(yōu)勢(shì)菌群豐度，降低有害菌群的數(shù)量和豐度。

瘤胃球菌屬主要作為營(yíng)養(yǎng)和能源的提供者作用于腸道上皮細(xì)胞，對(duì)于纖維的分解能力較強(qiáng)（張凱歌，2021），顫螺旋菌屬屬于厭氧性菌屬，來(lái)自梭狀芽孢菌群Ⅳ，顫螺旋菌能將糖、淀粉等發(fā)酵轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸， 短鏈脂肪酸作為腸上皮細(xì)胞的首選能量，能抑制腸炎保護(hù)腸上皮細(xì)胞，對(duì)腸道健康具有重要作用（Kajander，2009）。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 添加黃秋葵秸稈可以增加顫螺旋菌屬的豐度，其中以8%組最高。 罕見(jiàn)小球菌屬是近年來(lái)在人類排泄物中新分離的嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，呈多樣性的球菌形態(tài)（Leclercq，2014）。 罕見(jiàn)小球菌屬?gòu)V泛存在于健康成人腸道內(nèi)，并與腸道通透性息息相關(guān)（Vinolo，2011）。 有研究指出， 罕見(jiàn)小球菌屬可通過(guò)發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)生丁酸、 乳酸以及微量的乙酸和琥珀酸（Leclercq，2014），這些短鏈脂肪酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，參與維持腸道黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道炎癥以及增加胃腸動(dòng)力等 （Vitek，2015）。 本試驗(yàn)中添加4 %的黃秋葵秸稈顯著性提高了罕見(jiàn)小球菌屬的相對(duì)豐度， 且3 個(gè)試驗(yàn)組的罕見(jiàn)小球菌屬相對(duì)豐度均大于對(duì)照組， 說(shuō)明日糧中添加黃秋葵秸稈能夠增加罕見(jiàn)小球菌屬的相對(duì)豐度。 這提示黃秋葵秸稈可能通過(guò)提高顫螺旋菌屬、 罕見(jiàn)小球菌屬相對(duì)豐度，增加腸道短鏈脂肪酸含量，進(jìn)而影響機(jī)體的能量代謝。

4 結(jié)論

日糧中添加一定比例黃秋葵秸稈可以改善斷奶肉兔的腹瀉率，顯著降低斷奶肉兔的死亡率，并且對(duì)于斷奶肉兔的肝腎功能有一定的調(diào)節(jié)作用；添加8%的黃秋葵秸稈可以提高厚壁菌門、 擬桿菌門、瘤胃球菌屬、顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度，降低變形菌門的相對(duì)豐度。