線粒體DNA拷貝數(shù)作為生物標志物的研究前景

徐冬旸, 刁勇

(華僑大學 醫(yī)學院, 福建 泉州 362021)

線粒體是一種重要的細胞器,是能量代謝和生物合成的關鍵場所,參與氧化還原穩(wěn)態(tài)調節(jié)、信號轉導、癌變、固有免疫、細胞凋亡和自噬等多種生物學過程[1-2],并且與衰老[3-5]、癌癥[2,6],以及多種疾病[7]密切相關.人類的線粒體基因組為長度約16.6 kb的雙鏈閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA),其基因排列緊湊,主要由13個蛋白編碼基因、2個rRNA基因、22個tRNA基因,以及一段含有重(heavy,H)鏈復制起點的主非編碼區(qū)域(major non-coding region,major NCR)和一段含有輕(light,L)鏈復制起點的次非編碼區(qū)域(minor NCR)構成[8].近年來,有研究發(fā)現(xiàn),線粒體DNA還存在短開放閱讀框(short open reading frame,sORF),可編碼,被稱為線粒體源肽(mitochondrial-derived peptides,MDPs)的小肽,參與多種生物學過程[9-11].

大部分人類細胞中含有幾百至幾千個線粒體,每個線粒體的線粒DNA拷貝數(shù)約為2～10.線粒體DNA的拷貝數(shù)在不同個體及相同個體的不同組織和細胞中均有差異,且在不同生理條件下可發(fā)生變化.線粒體DNA拷貝數(shù)的多樣性和可變性可以反映多種生理狀態(tài)和生物學過程,具有作為生物標志物的重要潛力.本文對線粒體DNA拷貝數(shù)的多樣性及其作為生物標志物的研究前景進行綜述.

1 線粒體DNA拷貝數(shù)的多樣性

1.1 線粒體DNA拷貝數(shù)在不同組織器官及生理條件下的差異

人類細胞中,細胞核基因組具有相對固定的拷貝數(shù),而線粒體DNA的拷貝數(shù)則在不同組織中呈現(xiàn)出巨大的差異,從幾百到數(shù)十萬個不等.人類細胞中,僅成熟紅細胞不含線粒體DNA.在生殖細胞中,成熟卵母細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)為150 000以上,比大部分體細胞高一個數(shù)量級以上,而精子細胞線粒體DNA拷貝數(shù)僅約為100[12].線粒體DNA拷貝數(shù)在一定程度上與細胞能耗有關,例如,心臟和骨骼肌細胞等高耗能細胞平均線粒體DNA拷貝數(shù)為3 000～6 000,而肝臟、腎臟和肺組織的線粒體DNA拷貝數(shù)為500～2 000[13].

線粒體DNA拷貝數(shù)還與性別和年齡相關,女性的線粒體DNA拷貝數(shù)略高于男性,而線粒體DNA拷貝數(shù)可隨著年齡的增長而降低[14-15].線粒體DNA拷貝數(shù)與生理狀況也緊密相關,一項人群分析研究顯示,線粒體DNA拷貝數(shù)與腰臀比相關,但與身體質量指數(shù)(body mass index,BMI)無關,提示其可能與中心性肥胖和體脂分布相關[14].線粒體DNA拷貝數(shù)在不同的細胞生理條件下精確調節(jié),可響應不同的內部或外部微環(huán)境,并發(fā)生變化.

1.2 線粒體DNA拷貝數(shù)與衰老的相關性

半個多世紀以前,研究人員首次提出了線粒體功能障礙與衰老之間的關聯(lián)[16].時至今日,越來越多的研究證據(jù)表明,線粒體功能的減退在衰老過程中扮演重要角色,是與年齡相關疾病的促進因素之一[3-4,17],而線粒體DNA突變則可引發(fā)早衰表現(xiàn)[18-19].

近年來,多項人群研究試圖從線粒體DNA拷貝數(shù)的角度揭示線粒體與衰老之間的關聯(lián).隨著人類年齡的增長,外周血細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)下降[20-21].Zhang等[20]通過對1 511名17～85歲女性人群的研究發(fā)現(xiàn),外周血單核細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)平均每年以0.40的速度下降,同時伴隨著線粒體DNA異質性的升高.Mengel-From等[21]通過對1 067名18～93歲的志愿者進行研究發(fā)現(xiàn),18～48歲人群的外周血細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)相似,而50歲以上人群線粒體DNA拷貝數(shù)則以每年約0.54的速度下降;血液中線粒體DNA拷貝數(shù)與老年人的整體健康狀況相關,線粒體DNA拷貝數(shù)較高的個體擁有更好的健康和存活狀況,而線粒體DNA拷貝數(shù)較低的個體在認知、體力、自評健康等方面表現(xiàn)較差,且全因死亡率較高[21].Lee等[22]通過對107名表面健康老年女性(60歲以上)的研究發(fā)現(xiàn),外周血白細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)與認知功能呈正相關.Kim等[23]對142名60歲以上的社區(qū)老年女性的研究發(fā)現(xiàn),外周血白細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)與抑郁癥呈現(xiàn)顯著的負相關.

值得一提的是,不同的研究得出的結果并不總是一致的.例如,Reiling等[24]發(fā)現(xiàn)線粒體DNA拷貝數(shù)僅在男性中隨著年齡增加而降低.一些其他的研究則顯示線粒體DNA拷貝數(shù)與年齡無相關性[25-26].這些差異可能源于研究人群、樣品類型和統(tǒng)計分析方法的不同,以及樣本數(shù)量限制等因素.因此,更為系統(tǒng)及大規(guī)模的研究將有助于厘清和解釋來自不同研究的差異.

1.3 線粒體DNA拷貝數(shù)與癌癥的相關性

人類多種癌癥中的線粒體DNA拷貝數(shù)存在異常[27].Reznik等[28]對癌癥基因組圖譜(cancer genome atlas,TCGA)計劃中的22種癌癥樣本及相應的癌旁組織樣本進行線粒體DNA拷貝數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)許多癌癥樣本中的線粒體DNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,尤其在膀胱癌、乳腺癌和腎癌中.在其他研究中,線粒體DNA拷貝數(shù)在不同癌癥中既可表現(xiàn)為異常升高[29-35],也可表現(xiàn)為異常降低[36-39].由于不同類型的腫瘤中線粒體DNA拷貝數(shù)變化趨勢不同,Lan等[40]推測某些腫瘤中線粒體DNA拷貝數(shù)的增加并不僅僅是腫瘤細胞增殖能力增強的結果,而是具有腫瘤類型特異性.

線粒體DNA拷貝數(shù)異常被認為與癌癥風險具有相關性[40-47].Lan等[40]通過對ATBC(alpha-tocopherol,beta-carotene)癌癥預防隊列中的104例非霍奇金淋巴瘤患者及104例對照的研究發(fā)現(xiàn),線粒體DNA拷貝數(shù)與非霍奇金淋巴瘤患病風險存在劑量反應關系,線粒體DNA拷貝數(shù)的增加對應著較高的患癌風險.Xing等[42]通過對260例腎細胞癌和281例對照的研究發(fā)現(xiàn),腎細胞癌患者的線粒體DNA拷貝數(shù)顯著低于對照,低線粒體DNA拷貝數(shù)與患癌風險的增加顯著相關,且存在顯著的劑量反應關系.Bonner等[43]對云南省宣威地區(qū)的肺癌患病風險與線粒體DNA拷貝數(shù)的相關性進行研究,該地區(qū)煙煤的廣泛使用成為肺癌的重要致病因素之一,而煙煤中含有的多環(huán)芳香烴會在基因組DNA上形成加合物,其中,多環(huán)芳香烴對線粒體DNA的親和性比對細胞核DNA的親和性高40～90倍,因而可能對線粒體DNA拷貝數(shù)產(chǎn)生影響;通過對122名患者和121名對照的唾液樣本線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),當細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)大于157時,罹患肺癌的風險顯著升高,且線粒體DNA拷貝數(shù)與肺癌風險的相關性在老年人群中更為顯著.Yu等[41]通過對59例浸潤性乳腺腫瘤及配對的癌旁組織的分析發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的線粒體DNA拷貝數(shù)顯著低于癌旁組織,且降低的線粒體DNA拷貝數(shù)與較高的發(fā)病年齡及較高的組織學分級相關;線粒體DNA拷貝數(shù)降低的患者的無病生存率和總體生存率顯著降低;D環(huán)(displacement loop,D-loop)區(qū)域尤其是H鏈復制起點區(qū)域附近的突變可能是導致線粒體DNA拷貝數(shù)降低的關鍵因素.目前,大部分人群研究僅針對某一特定癌癥群人群或者族裔,此類研究盡管對特定問題具有較高的針對性,其結論有時難以推廣和應用于更為廣泛的人群.因此,未來的研究一方面應涉足更多樣化的人群,另一方面也應關注樣本量,以及人群差異對研究結論的影響.

多年來,研究者們致力于尋找用于癌癥預測和篩查的分子標志物,其中,大部分研究關注與細胞核DNA相關的遺傳和表觀遺傳變化,而近年來研究發(fā)現(xiàn)的線粒體DNA拷貝數(shù)與患癌風險之間的相關性使線粒體DNA拷貝數(shù)有望成為新的癌癥預測和診斷標志物,并且相較于基于細胞核DNA的方法有其獨特優(yōu)勢,是眾多研究者所關注的研究方向.

1.4 線粒體DNA拷貝數(shù)與生育能力的相關性

已知線粒體功能異常影響生育能力,與線粒體相關的療法可被用于延緩卵巢衰老及延長生殖壽命[48].線粒體DNA拷貝數(shù)也在愈來愈多的研究中被認為與生育能力具有相關性.Wai等[12]為探究線粒體DNA拷貝數(shù)對哺乳動物生育能力的影響,在小鼠中刪除了一個拷貝的Tfam基因,人為降低線粒體DNA拷貝數(shù),當卵母細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)低至4 000時,仍可正常受精并在移植前發(fā)育至囊胚階段,成熟卵母細胞植入后,可繼續(xù)發(fā)育的閾值則為40 000～50 000;形成鮮明對比的是,精子的線粒體DNA拷貝數(shù)降低3倍之后,仍具有正常的生育能力,甚至缺失Tfam等位基因的基因型更容易被遺傳.這些結果表明,成熟卵母細胞需要維持較高的線粒體DNA拷貝數(shù)來維持后續(xù)發(fā)育,而精子細胞則需要通過下調線粒體DNA拷貝數(shù)維持正常的功能.文獻[49-50]關于精子形成過程中線粒體基因表達的研究也支持了減少精子中線粒體DNA拷貝數(shù)是維持精子正常功能的重要調控過程的觀點.May-Panloup等[51]研究發(fā)現(xiàn),卵巢功能不全患者的卵母細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)平均下降約3倍.

此外,線粒體復制相關基因的缺陷會導致生育能力的下降[18,52-54].線粒體DNA拷貝數(shù)與生育能力的相關性使其有望作為卵巢功能和胚胎發(fā)育質量的標志物,在生殖治療中發(fā)揮作用.Fragouli等[55]在一項研究中對199個囊胚進行分析,評估線粒體DNA拷貝數(shù)在體外受精(IVF)時作為胚胎質量篩選工具的適用性,發(fā)現(xiàn)所有正常著床的胚胎均具有正?；蜉^少的線粒體DNA拷貝數(shù),而有16%未著床胚胎中有較多的線粒體DNA拷貝數(shù).這說明正常的線粒體DNA拷貝數(shù)盡管不能作為胚胎著床能力的標志,但是線粒體DNA拷貝數(shù)的增多卻可用于篩查無法正常著床的胚胎[55].在現(xiàn)階段,線粒體DNA拷貝數(shù)作為生殖能力評估工具已展現(xiàn)出一定的潛力和臨床價值,為達到成熟的臨床應用,相關研究還有待進一步深入.

2 循環(huán)細胞游離線粒體DNA

2.1 循環(huán)細胞游離線粒體DNA概述

循環(huán)細胞游離DNA(circulating cell-free DNA,ccf DNA)是從細胞內釋放到細胞外并進入循環(huán)系統(tǒng)的DNA分子,由于其具有易于獲取和測量的特點,已在多種疾病中成為重要的無創(chuàng)診斷生物標志物[56].線粒體DNA存在細胞外游離形式,被稱為循環(huán)細胞游離線粒體DNA(circulating cell-free mtDNA,ccf mtDNA).細胞損傷或應激可引發(fā)線粒體損傷相關分子模式(mitochondrial damage-associated molecular pattern,DAMP)的釋放,線粒體DNA在此過程中釋放到細胞外空間,形成循環(huán)細胞游離線粒體DNA[57].循環(huán)細胞游離線粒體DNA存在于人類的血漿和血清中[58],被認為與炎癥性疾病、創(chuàng)傷性損傷、敗血癥、心肌梗死與癌癥等多種疾病相關[59-67],是新型生物標志物的潛在重要分子.

2.2 循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與衰老的相關性

衰老被認為與慢性炎癥有關,而循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)則被發(fā)現(xiàn)與炎癥有緊密關聯(lián),因而循環(huán)細胞游離線粒體DNA被認為具有作為衰老及衰老相關疾病的生物標志物的潛能[57,67-68].

Pinti等[69]通過對831名志愿者(半數(shù)以上為90～104歲)血漿中的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),志愿者在50歲之后逐漸增高.其中,具有最高血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的志愿者的細胞炎癥因子水平也相應最高,研究者據(jù)此推測循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在維持老年人體內低程度慢性炎癥方面發(fā)揮了作用[69].在另一項研究中,Lazo等[70]通過對數(shù)十名30～64歲人群的血漿中胞外囊泡中的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的定量分析發(fā)現(xiàn),線粒體DNA拷貝數(shù)隨著年齡的增加而降低.以上兩項研究結論的不一致之處可能與受試者年齡段有關,前者的高齡人群比例顯著高于后者.

Nidadavolu等[71]以672名社區(qū)老年人為研究對象,發(fā)現(xiàn)血清中的炎癥標志物與循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)呈正相關,并且兩者的水平與生理和認知功能的損傷及死亡風險的增加有關. 該研究提示了循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與慢性炎癥的相關性. Fan等[72]通過對65歲及以上的老年人退行性病變肌少癥的研究發(fā)現(xiàn),血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與肌少癥顯著相關,在肌少癥患者中顯著增加,且通過接收者操作特征(ROC)曲線分析可有效地區(qū)分出肌少癥患者(曲線下面積為0.726);循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與細胞炎癥因子水平存在正相關性,說明其可能與慢性炎癥存在關聯(lián).以上研究表明,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)可用于表征衰老與衰老相關疾病,其分子機制與細胞炎癥反應密切相關.

2.3 循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與癌癥的相關性

循環(huán)細胞游離線粒體DNA存在于人體的血漿和血清中,具有易于檢測的特性,適用于無創(chuàng)診斷,對于常規(guī)核心標志物水平正常的患者,基于循環(huán)細胞游離線粒體DNA的檢測尤其具有特殊的意義.因此,近年來,循環(huán)細胞游離線粒體DNA在癌癥診斷中的價值引起了廣泛的研究興趣.

Ellinger等[73]發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者的血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)相比于健康對照,以及其他卵巢良性疾病患者均顯著增高;上皮性卵巢癌組與子宮內膜異位癥組相比,盡管循環(huán)細胞游離核DNA無顯著差異,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)卻存在顯著性差異.Ellinger等[74]通過對74例睪丸癌及35例健康對照的血清樣品進行循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),睪丸癌患者的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)顯著高于健康對照,接收者操作特征曲線分析顯示,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)可用于區(qū)分癌癥患者與健康對照(曲線下面積為0.787),并且可以用于區(qū)分常規(guī)標志物正常的患者與健康對照(曲線下面積為0.797),證明了循環(huán)細胞游線粒體DNA拷貝數(shù)作為生物標志物對于常規(guī)標志物正常的患者具有重要的診斷價值.

Ellinger等[75]發(fā)現(xiàn)循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤患者的血清中顯著增多,且可以用于區(qū)分癌癥患者與健康對照,靈敏度和特異性分別達到85%和97%.Kohler等[59]在一項針對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在惡性與良性腫瘤患者中均顯著低于健康對照,而使用接收者操作特征曲線分析可有效地通過循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)區(qū)分腫瘤患者與健康對照.以上研究顯示了循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在癌癥診斷中的良好應用前景,也提示了循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在不同類型的癌癥中可能具有不同的變化趨勢,是具有癌癥類型特異性的指標.

2.4 循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)與精神疾病的相關性

循環(huán)細胞游離線粒體DNA不僅與生理應激有關,還與心理應激相關,據(jù)推測可能在壓力作用下被釋放到細胞外,可作為精神疾病診斷的潛在生物標志物.

Trumpff等[76]對健康中年志愿者進行短暫的心理挑戰(zhàn)試驗,發(fā)現(xiàn)受試者血漿中的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)增加2～3倍,說明循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)特異性與急性心理應激相關;體外細胞實驗顯示,糖皮質激素信號作為人類心理壓力的產(chǎn)物之一,可誘導線粒體DNA拷貝數(shù)的增加,推測神經(jīng)內分泌信號是心理應激下循環(huán)細胞游離線粒體DNA釋放的潛在觸發(fā)因素.

Lindqvist等[77]發(fā)現(xiàn)循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)是獨立于細胞內線粒體DNA拷貝數(shù)的生物指標,重度抑郁癥患者的血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)顯著增加,而外周血單核細胞中的線粒體DNA拷貝數(shù)則無明顯變化,說明兩者指示了不同的生物學過程.Lindqvist等[78]通過對37名自殺未遂者和37名健康對照的血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的定量分析發(fā)現(xiàn),自殺未遂者的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)顯著增加,推測其與下丘腦-垂體-腎上腺軸的負反饋受損有關.Lindqvist等[79]后續(xù)通過對46名社交恐懼癥患者和42名健康對照的血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),社交恐懼癥患者的循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)顯著少于健康對照;并且在認知行為療法治療后,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)無顯著變化,且與焦慮癥狀的嚴重程度無關,推測社交恐懼癥患者可能是由于長期的心理壓力導致循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)的減少.

值得一提的是,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)在精神疾病中并非總是呈現(xiàn)上升趨勢,不同研究者均在抑郁癥人群中觀察到了血漿中循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)顯著減少的情況[80-81],說明在不同的精神疾病中,循環(huán)細胞游離線粒體DNA拷貝數(shù)可能存在不同的作用機制,有待于研究者的進一步揭示.

3 結束語

線粒體作為一種重要的細胞器,在人類的疾病和健康中扮演重要角色.線粒體DNA拷貝數(shù)作為一種易于檢測的指標,被發(fā)現(xiàn)在衰老、癌癥及其他多種疾病中具有特異性變化,是一種極具潛力的無創(chuàng)診斷生物標志物.目前,針對線粒體DNA拷貝數(shù)的相關研究主要集中于特定的疾病類型和人群,這些研究盡管得出了一些重要結論,其普適性還有待驗證.在多種疾病類型中進行更為大規(guī)模和系統(tǒng)性的研究將有助于厘清先前研究中存在的一定程度的不一致性,增加線粒體DNA拷貝數(shù)作為生物標志物在臨床上應用的可行性.此外,線粒體DNA拷貝數(shù)在衰老和疾病中的特異性變化的內在生物學機制還有待于被進一步揭示,從而更深入地理解線粒體及線粒體DNA拷貝數(shù)在疾病和健康中的作用.